COMPARAÇÃO DA PRODUÇÃO DE POLIHIDROXIBUTIRATO A PARTIR DE RESÍDUO AGROINDUSTRIAIS E GLICOSE PELA BACTÉRIA Herbaspirillum seropedicae ESTIRPE SmR1

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1 COMPARAÇÃO DA PRODUÇÃO DE POLIHIDROXIBUTIRATO A PARTIR DE RESÍDUO AGROINDUSTRIAIS E GLICOSE PELA BACTÉRIA Herbaspirillum seropedicae ESTIRPE SmR1 Fagner Grolli 1, Fernando H. G. Tessaro 1, Fernando A. Fovis 2, Clarice A. Osaku 3 Universidade Estadual do Oeste do Paraná Resumo Os polihidroxibutiratos (PHBs) têm representado um imenso potencial para aplicação farmacêutica, na área de liberação controlada de fármacos em virtude de suas características de biodegradabilidade e biocompatibilidade. Além disso, são estudados intensivamente devido a algumas propriedades físicas semelhantes aos plásticos petroquímicos, tendo a vantagem de serem biodegradáveis. Infelizmente, em consequência do seu alto custo de produção, este biopolímero não ganha o devido espaço no mercado, sendo este, um dos principais objetivos a serem alcançados para a possível substituição do PET pelo PHB. Este trabalho teve como objetivo buscar alternativas para diminuir o custo da produção de PHB fazendo uso de resíduos agroindustriais de baixíssimo valor comercial, na tentativa de torná-lo mais barato e competitivo em relação ao derivado petrolífero, PET. Foram otimizados os parâmetros físicos ph, concentração de glicose e concentração de amônio para a obtenção de PHBs pela bactéria Herbaspirillum seropedicae estirpe SmR1 através do uso da Metodologia de Superfície e Resposta (MSR) com base no Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR). Observou-se que a variável concentração de glicose influenciou positivamente e a concentração de amônio influenciou negativamente a produção de PHB por H. seropedicae. O resultado obtido com a utilização foi promissor, alcançou-se a produção do polímero em quantidades de 3,78 mg e 3,26 mg tendo, o meio de cultura, apenas 125 mg de bagaço de canade-açúcar e bagaço de cevada, respectivamente: Palavras-chave: Polihidroxibutiratos, Herbaspirillum seropedicae, DCCR 1 Alunos do curso de Graduação em Farmácia 2 Farmacêutico Generalista 3 Docente do Centro de Ciências Médicas e Farmacêuticas/ Cascavel, PR.- Curso de Farmácia fagner.grolli@hotmail.com

2 Introdução O uso de polímeros têm se tornado cada vez maior desde o século passado no qual se iniciou as suas primeiras utilizações. Muitos produtos utilizam os polímeros como matéria-prima para sua confecção. Das garrafas de refrigerantes, passando pelas hastes de cotonetes, sacos de supermercados, tubos de PVC, recipientes de poliestireno expandido, revestimentos de panelas e de latas de conserva, mamadeiras, tintas para paredes, próteses, escovas de dente, párachoques de veículos, tapetes, cobertores, pneus ou suportes para componentes eletrônicos, os polímeros estão presentes em quase a totalidade dos utensílios de uso cotidiano (ROSA et al, 2002). Outra aplicação atual é o uso de biopolímeros para a composição de formas farmacêuticas para liberação controlada de fármacos em medicamentos e cosméticos e uso em materiais médico-hospitalares. Assim, a pesquisa para o desenvolvimento de novos polímeros sintéticos baseou-se exclusivamente nas características de inércia e resistência à biodegradação ao contrário do que ocorre com os polímeros naturais como o amido, celulose e proteínas. Em particular, os polímeros formados por hidrocarbonetos são resistentes ao ataque químico e biológico, de tal forma que isso lhes assegura longevidade e outras propriedades que se mantém por longo tempo (ROSA et al, 2001). Devido a essa propriedade dos polímeros sintéticos, a durabilidade, surge um grande problema para a sociedade atual: o acúmulo de lixo, em grande parte polímeros e seus derivados. Considerando que o tempo para decomposição de polímeros sintéticos varia de 50 a 500 anos é interessante buscar novas alternativas na tecnologia de obtenção de polímeros com menor tempo de degradação (COUTINHO et al, 2004). Dessa forma, surge um importante grupo de compostos poliméricos, denominados Polihidroxialcanoatos (PHA s) e Polihidroxibutiratos (PHB s), os quais apresentam menor tempo de degradação, variando de 6 a 12 meses (BOHMERT et al, 2002). Estes podem ser obtidos de matrizes renováveis através de técnicas específicas de produção, dentre elas a obtenção biotecnológica por bactérias e fungos, além da produção por plantas como a cana-de-açúcar, sendo considerados biopolímeros (COUTINHO et al, 2004).

3 Os PHA s são poliésteres de ácidos hidroxialcanoicos e/ou hidroxialcenóicos que podem ser acumulados por diversos micro-organismos em grandes quantidades sem afetar a pressão osmótica das células. Estes micro-organismos acumulam os polímeros na forma de grânulos intracelulares (que podem chegar a constituir aproximadamente 80% da massa celular seca). Esse polímero tem como principal função servir como reserva de carbono e energia (LEE, 1996). A diversidade de polímeros da família de PHA s e do seu vasto potencial de aplicação depende da variação do comprimento e da composição das cadeias. Sendo o polihidroxibutirato (PHB) o principal representante dos PHA s (COOPERSUCAR, 2009). As principais características dos PHA s são a rápida biodegrabilidade e propriedades termoplásticas, dentre as quais o elevado ponto de fusão, baixa rigidez, alta resistência à pressão e ao alongamento antes da ruptura e alta resistência ao impacto e por isso são considerados bons substitutos dos plásticos de origem petroquímica (COOPERSUCAR, 2009). Devido a esta falta de competitividade comercial dos polímeros petroquímicos em relação aos polímeros biodegradáveis, justificada pela diferença no custo da matéria-prima, o PHB é alvo de extensas pesquisas que procuram desenvolver a busca por gêneros bacterianos que possuam elevada produção do polímero e utilizem como matéria-prima substratos renováveis pela agricultura e de baixo valor comercial (SILVA et al, 2007). Uma opção para a realidade brasileira seria a utilização do bagaço de cana-deaçúcar. Estima-se que no Brasil, a cada ano, sobrem de 5 a 12 milhões de toneladas deste resíduo onde, as indústrias sucro-alcooleiras, usam de 60 % a 90 % deste volume de resíduo para produção de energia térmica e elétrica (FAPESP, 1998). Este trabalho teve como principal objetivo à busca pela produção de biopolímero utilizando a bactéria, gram negativa e fixadora de nitrogênio Herbaspirillum seropedicae estirpe SmR1 a partir de resíduos agroindustriais como o bagaço de cana-de-açúcar, resíduo fibroso de mandioca, palha de milho e bagaço de cevada, dejetos agrícolas sem utilização comercial além de serem adquiridos com

4 baixíssimo custo. Para poder comparar se a produção com os resíduos era viável, foi otimizado os parâmetros físicos de ph, concentração de glicose e concentração de amônio para a produção de PHB pela estirpe SmR1 de H. seropedicae utilizando o planejamento experimental baseado na metodologia de Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) aliado a metodologia de superfície de resposta (MSR). Material e Métodos Micro-organismo Utilizou-se a estirpe SmR1 de Herbaspirillum seropedicae cedida pelo Núcleo de Fixação de Nitrogênio da Universidade Federal do Paraná. Meio de cultura Utilizou-se o meio Nfb (Novo Fabio Pedrosa) líquido (KLASSEN et al., 1997), ao qual foram adicionadas diferentes concentrações de glicose como fonte de carbono. A composição é apresentada na tabela 1. Tabela 1 Composição do Meio Nfb (KLASSEN et al., 1997). g/l Componentes g/l MgSO 4.7H 2 O 2,0 x 10-1 Biotina 1,0 x 10-4 NaCl 1,0 x 10-1 Na 2 MoO 4.2H 2 O 2,0 x 10-3 CaCl 2 2,0 x 10-2 MnSO 4.H 2 O 2,35 x 10-3 Ácido Nitrilotriacético 5,6 x 10-2 H 3 BO 3 2,8 x 10-3 FeSO 4.7H 2 O 2,0 x 10-2 CuSO 4.5H 2 O 8,0 x 10-5 Em todos os cultivos manteve-se a relação de 1/5 entre o volume do meio e o volume total do frasco empregado com o objetivo de garantir uma aeração ideal. Para testar os resíduos agroindustriais como fontes de carbono foram adicionadas

5 ao meio de cultura: bagaço de cana; bagaço de cevada, resíduo fibroso de mandioca e palha de milho. Determinação de Polihidroxibutirato (PHB) A determinação do PHB foi realizado de acordo com LAW e SLEPECKY (1960). A quantidade de ácido crotônico foi calculada utilizando-se o coeficiente de extinção molar desta substância que é 1,55x10 4 (SLEPECKY & LAW, 1960 a, b). Dessa forma calculou-se a concentração de PHB sabendo-se que a quantidade de ácido crotônico é proporcional ao conteúdo de PHB da amostra. Otimização da produção de PHB através de Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) Foi realizada a otimização da produção de PHB (variável dependente) utilizandose três variáveis independentes: concentração de glicose, concentração de amônio e ph. O estudo envolveu a aplicação de RSM (Metodologia de Superfície de Resposta) com o uso de DCCR através do modelo 2 3 fatorial com oito ensaios lineares (níveis +1 e -1), três réplicas no ponto central (nível 0) e seis pontos axiais (com α = ±1,68). A equação quadrática = o + ixi + ixi2 + ijxixj foi utilizada como modelo, onde o é a resposta, o a intercepção, i o coeficiente linear e ij o coeficiente da interação. O modelo avalia os efeitos lineares, quadráticos e termos interativos das variáveis independentes na variável dependente ( ). Análise estatística Utilizou-se o software Statistica 7 (StatSoft Inc.) para a análise de regressão dos dados experimentais e para obter os gráficos da superfície de resposta.

6 Resultados e Discussão Com base na Metodologia de Superfície de Resposta (BOX et al, 1978) foi realizada a análise dos resultados, sendo que o delineamento estatístico (valores codificados e reais) com os resultados dos ensaios experimentais é apresentado na Tabela 2, onde se observa que as maiores produções de PHB (350,0; 243,89 e 236,48 mg) foram obtidas nos ensaios 13, 4 e 12 respectivamente e as menores quantidades foram obtidas nos ensaios 1, 6, 9 e 11. Baseado no modelo dos coeficientes estimados pelas regressões lineares múltiplas, no intervalo de confiança de 95%, verificou-se que as variáveis lineares concentrações de glicose e amônio foram significativas para a produção de PHB, sendo que a concentração de glicose influenciou positivamente e a concentração de amônio influenciou negativamente a produção de PHB. A variável ph linear e as variáveis quadráticas bem como as interações entre as variáveis não obtiveram significância estatística. Tabela 2: DCCR usado para otimizar os parâmetros físicos para a produção de polihidroxibutirato (PHB) pela estirpe SmR1 de Herbaspirillum seropedicae. Níveis Ensaio x1 ph x2 Glicose (mm) x3 Amônio (mm) PHB (mg) 1-1 (6,0) -1 (30) -1 (5,0) 83, (8,0) -1 (30) -1 (5,0) 123, (6,0) +1 (70) -1 (5,0) 174, (8,0) +1 (70) -1 (5,0) 243, (6,0) -1 (30) +1 (15) 72, (8,0) -1 (30) +1 (15) 96, (6,0) +1 (70) +1 (15) 139, (8,0) +1 (70) +1 (15) 181,06 9-1,68 (5,32) 0 (50) 0 (10) 89, ,68 (8,68) 0 (50) 0 (10) 212, (7,0) -1,68 (16,4) 0 (10) 74, (7,0) +1,68 (83,6) 0 (10) 236, (7,0) 0 (50) -1,68 (1,6) 350, (7,0) 0 (50) +1,68 (18,4) 106, (7,0) 0 (50) 0 (10) 192, (7,0) 0 (50) 0 (10) 187, (7,0) 0 (50) 0 (10) 189,35

7 A partir dos efeitos das variáveis que influenciaram na produção de PHB, conforme a tabela acima, se elaborou a equação matemática descrita abaixo para prever a produção deste biopolímero. PHB (mg) = 192, ,0497 x (Glicose mm) - 80,0636 x (Amônio mm) Nos ensaios realizados observou-se distribuídos aleatoriamente de forma que o modelo estatístico utilizado baseia-se numa distribuição paramétrica normal. Dessa forma, foi realizada a análise de variância (ANOVA) na qual se verificou que o valor R 2 (coeficiente de correlação múltipla) foi de 0,82569 indicando que 82,569% da variabilidade na resposta pode ser explicada pelo modelo matemático obtido. Conforme a ANOVA o valor do F calc = 3,68 é maior do que F tab (9;7;0.05) = 3,29, no intervalo de confiança de 95%, de modo que o modelo matemático é considerado aceitável para descrever o comportamento da produção de PHB uma vez que a relação F calc /F tab > 1 demonstra que há diferença entre as médias quadráticas da regressão e dos resíduos. A superfície de resposta indicada na Figura 1 pode ser usada para visualizar o efeito das variáveis concentração de glicose (mm) e ph sobre a produção de PHB (mg). 90 DV: PHB (mg) Glicose (mm) ,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 ph Figura 1 - Superfície de resposta mostrando o efeito das variáveis concentração de glicose e ph sobre a produção de PHB por H. seropedicae Sm1 após 50 horas de cultivo a 30 C e 120 rpm.

8 Podemos visualizar a influência da variável ph linear sobre a produção de PHB na Figura 1 de forma que as maiores quantidades deste polímero foram obtidas nos ensaios cujo o meio de cultivo apresentou ph inicial mais alcalino (ph acima de 7,0). A interferência negativa do amônio sobre a produção de PHA e PHB também foi observada com outros micro-organismos, BRANDL et al (1988) observaram este fato em Pseudomonas oleovorans, utilizando octanoato como fonte de carbono, no qual verificaram o efeito de diferentes concentrações de amônio (0, 5, 10, 25 e 50 mm) sobre a produção de PHB por este micro-organismo, sendo que a produção de PHB foi inversamente proporcional à quantidade de amônio adicionada ao meio de cultivo. COUTO (2005) evidenciou o envolvimento da proteína glnd na regulação por amônio da biossíntese de PHB em H. seropedicae. No entanto, não há estudos mais acurados sobre a interferência negativa do amônio sobre o metabolismo do carbono e a síntese de PHB. Após a otimização com glicose, buscou-se outras fontes de carbono e, analisando a tabela 3, pode se comparar a produção do PHB em relação a cada resíduo utilizado e observa-se a produção de 3,78 e 3,26 mg de polímero tendo como fonte de carbono exclusivamente o bagaço de cana-de-açúcar e o bagaço de cevada, respectivamente. TABELA 3: Quantidade de PHB produzida conforme fonte de carbono utilizada. Resíduo Agroindustrial PHB (mg) Bagaço cana-de-açúcar 3,78 ± 0,081 Bagaço de cevada 3,26 ± 0,004 Resíduo fibroso de mandioca 1,67 ± 0,066 Palha de milho 1,85 ± 0,033 RODRIGUES (2005) obteve a produção de PHB utilizando a bactéria Cupriavidus necator e obteve 0,65 mg de PHB por grama de fonte de carbono; em comparação com os valores obtidos pela bactéria H. seropedicae utilizando o bagaço de cana de açúcar que foi de 3,78 mg de PHB para 125 mg de fonte de

9 carbono, dando dessa maneira 30,24 mg/g de fonte de carbono o que daria um rendimento de 46 vezes. Considerações Finais O microorganismo utilizado se mostrou capaz de crescer no meio de cultura tendo como única fonte de carbono o resíduo agroindustrial. Desta maneira, a produção de PHB por Herbaspirillum seropedicae pode ainda ser melhorada, aumentando sua capacidade produtiva e reduzir ainda mais, os custos do biopolímero tornando-o mais competitivo comercialmente aos polímeros derivados do petróleo. Em comparação com o processo otimizado utilizando-se a glicose com fonte de carbono com os resíduos agroindustriais, observamos que a produção de PHB foi pelo menos 90 vezes superior utilizando a glicose, mas comparando com a literatura observamos que bactéria H. seropedicae tem um potencial como produtora de PHB em relação à Cupriavidus necator utilizada por RODRIGUES (2005). Referências Bibliográficas BOHMERT, K; BALBO, I; STEINBUCHEL, A.; TISCHENDORF, G; WILLMITZER, L. Constitutive Expression of the beta-ketothiolase Gene in Transgenic Plants. A Major Obstacleee for Obtaining PollyhydroxybutyrateProducing Plants. Plant Physiol. Vol 128, BOX, G. E. P., HUNTER, W. G., HUTER, J. S. Statistics for experimenters. USA: John Wiley & Sons, BRANDL, H; GROSS, A. R; LENZ, W. R; FULLER, C. Pseudomonas oleovarans as a source of poly (β-hydroxyalkanoates) for potential applications as biodegradable polyesters. Applied and Enviromental Microbiology, p , COOPERSUCAR, Disponível em: acessado em 17 de Abril de 2009.

10 COUTINHO, B.C; MIRANDA, G.B; SAMPAIO, G.R; DE SOUZA, L.B.S; SANTANA, W.J; COUTINHO, H.D.M; A importância e as vantagens do polihidroxibutirato (plástico biodegradável). Revista Holos, Ano 20, COUTO, H.G; expressão e purificação da proteína GlnD de Herbaspirillum seropedicae. Dissertação de mestrado, UFPR, FAPESP; Propriedades do bagaço de cana-de-açúcar. Pesquisa Online FAPESP. Ed. 30, Disponível em: < Acesso em: 20/04/2010. KLASSEN, G. et al. Effect of nitrogen compounds on nitrogenase activity in Herbaspirillum seropedicae. Can. J. Microbiol.1997, LAW, JH; SLEPECKY, RA. Assay of poly- -hydroxybutyric acid. J Bacteriol; 82: 33-6, 1960 a. LEE, S.Y. Bacterial polyhydroxyalkanoate. Biotec.Bioeng. 49:1-14, RODRIGUES, A.D. Estudo da produção de polihidroxibutirato por Cupriavidus necator. em fermentação no estado sólido Dissertação de mestrado em Ciências em Engenharia Química. UFRJ/ RJ. ROSA, D.S.; FRANCO, B.L.M.; CALIL, M.R. Biodegradabilidade e Propriedades Mecânicas de Novas Misturas Poliméricas. Polímeros. 2001, 11(2): ROSA, D.S.; HANG-CHUI, Q. S.; PANTANO FILHO, R.; AGNELLI, J.A.M. Avaliação da Biodegradação de (Hidroxibutirato), Poli-(Hidroxibutirato-co-ξ caprolactona) em Solo Compostado. valerato). Polímeros. 12 (4): , SILVA, L.; MIGUENS, G.; OLIVARES, F.L. Herbaspirillum seropedicae and sugarcane endophytic interaction investigated by using high pressure freezing electron microscopy. Braz. J. Microbiol. v.34, p SLEPECKY R. A.; LAW, R. H. Assay of poly- α-hydroxybutyric acid. J Bacteriol; 82: 33 6, 1960a. SLEPECKY, R. A.; A. J. H. LAW. A rapid spectrophotometric assay of, α-βunsaturated acids and, β-hydroxy acids. Anal. Chem. 32: , 1960b.