VERIFICAÇÃO DA INFLUÊNCIA DO ÓLEOS VEGETAIS NA OBTENÇÃO DE POLI(3-HIDROXIBUTIRATO) POR Ralstonia eutropha.

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1 VERIFICAÇÃO DA INFLUÊNCIA DO ÓLEOS VEGETAIS NA OBTENÇÃO DE POLI(3-HIDROXIBUTIRATO) POR Ralstonia eutropha. Michele C. Formolo 1 ; Sandra A. Furlan 2 ; Ana Paula T. Pezzin 3 ; Andréa L. Schneider 4 1 Acadêmica do curso de Ciências Biológicas, 4º ano. Bolsista PIBIC 2 Professora Dra. do departamento de Engenharia Ambiental da UNIVILLE, pesquisadora. 3 Professora Dra. do departamento de Eng. Ambiental da UNIVILLE, co-orientadora. 4 Professora Msc. do departamento de Ciências Biológicas da UNIVILLE, orientadora. RESUMO: Considerando a variedade de produtos e bens tecnológicos empregados na atualidade, que vão desde canetas a conectores telefônicos, é difícil imaginar o mundo de hoje sem a presença dos plásticos no cotidiano. No entanto, o tempo necessário para a degradação destes materiais, e o fato de que a maioria dos produtos plásticos possui vida útil efêmera sendo rapidamente descartados, tem gerado grandes problemas ao ambiente. Os polímeros biodegradáveis despertam grande interesse, pois possuem propriedades similares aos plásticos convencionais, além da vantagem de serem degradados no solo em questão de poucos meses. Os polihidroxialcanoatos (PHAs) são uma classe de polímeros produzidos e acumulados como reserva energética por inúmeras bactérias, no interior das células, sendo o P(3-HB) o principal polímero. Estudos já demonstraram que o ácido oléico como suplemento, na fase de síntese do polímero, aumenta a produtividade máxima do copolímero poli(3hv-co-3hb) em culturas de Ralstonia eutropha. Desta forma este trabalho tem como proposta a síntese de P(3- HB) na presença de diferentes óleos vegetais nas fases de crescimento celular e produção de polímero, em culturas de Ralstonia eutropha,. Os resultados nos têm indicado que os óleos vegetais não contribuem para o incremento da concentração celular, sendo inclusive, a velocidade de crescimento do meio controle (sem óleo) ligeiramente maior do que os meios acrescidos de óleo vegetal. Palavras-Chave: plástico biodegradável, poli(3-hidroxibutirato), fermentação, óleos vegetais. INTRODUÇÃO Mais de 30% dos plásticos que utilizamos todos os dias duram unicamente os segundos que levamos para desembrulhar um produto (MIRALLES, 1999) e rapidamente estarão nos aterros sanitários que já estão saturados de resíduos plásticos. Tal acúmulo de lixo dificulta a circulação de líquidos e gases e retarda a estabilização de matéria orgânica, causando danos à natureza (SANTOS et al., 2001). Uma alternativa a esse problema são os polímeros biodegradáveis que vem despertando interesse de pesquisadores de todas as áreas, devido à diversidade de suas aplicações nos campos da biotecnologia, medicina, farmácia e agricultura. O poli(3-hidroxibutirato) P(3-HB) é um poliéster natural e biodegradável da classe dos polihidroxialcanoatos (PHAs). É produzido por fermentação bacteriana, com predomínio no uso da bactéria Ralstonia eutropha (GOMES & BUENO NETTO, 1997). Esse polímero é

2 degradado pela ação de microrganismos de ocorrência natural, como bactérias, fungos e algas (SILVA, 2001), sofrendo redução da massa molar, sendo degradado em CO2 e H2O (REIS & CUNHA, 1995). Mas não é só a biodegradabilidade que torna o P(3-HB) tão fascinante. A síntese deste polímero a partir de fontes renováveis de carbono, oriundas da agricultura, permite um processo cíclico fechado sustentável para a produção e uso deste poliéster (BRAUNEGG et al., 1998). Diante do exposto, a proposta deste trabalho visa sintetizar P(3-HB) pela bactéria Ralstonia eutropha na presença de diferentes óleos vegetais, como suplemento da produção de P(3-HB), caracterizando-o por diversas técnicas físico-químicas, comparando-o com o P(3- HB) doado pela PHB Industrial. PARTE EXPERIMENTAL Microrganismo O microrganismo utilizado foi a bactéria Ralstonia eutropha DNS 545, gentilmente fornecida pelo Departamento de Engenharia Química da Universidade Federal de Santa Catarina. Para sua manutenção empregou-se o cultivo em placas de Petri contendo meio de cultura sólido (ágar nutriente). Essa cultura foi mantida a 30ºC durante 48 horas, seguido de acondicionamento em refrigerador a 4ºC. Meios de cultivo a) O meio de cultivo para manutenção é composto de peptona de carne, extrato de carne e ágar. b) O meio de cultivo para ressuspenção do microrganismo possui a mesma composição, com exceção de ágar. c) O meio de cultivo utilizado para fermentação, denominado meio mineral é composto de: 0,19 g/l ácido nitriloacético, 0,06 g/l citrato férrico de amônia, 0,5 g/l MgSO4. 7H2O, 0,01 g/l CaCl2. 2H2O, 1 ml de solução de oligo-elementos, 8,95 g/l Na2HPO4. 12H2O, 1,5 g/l KH2PO4, 30 g/l açúcar invertido (furtose e glicose) e 5 g/l NH4SO4., acrescido de um óleo vegetal na concentração 0,3 g/l (azeite de dendê, soja, oliva, girassol e canola). Condições de cultivo As células de Ralstonia eutropha foram cultivadas em frascos de Erlenmeyer (1000mL) aletados, contendo 300 ml de meio mineral, tendo como fonte de carbono, açúcar invertido (glicose e frutose) (30 g/l) e como fonte de nitrogênio, sulfato de amônio (5 g/l para ensaios sem limitação de nitrogênio e 2,3 g/l em ensaios com limitação de nitrogênio). A cultura foi mantida sob agitação a 30 ºC e 150 rpm durante 24 horas.

3 Os óleos vegetais (Canola, Girassol, Soja, Oliva e Dendê) foram adicionados aos meios de cultura, observando-se a concentração de 0,3g/L de ácido oléico. Nos ensaios realizados para o crescimento celular, os óleos vegetais foram adicionados já no início da fermentação e, nos ensaios para produção de polímero estes óleos foram adicionados somente ao final da fase exponencial de crescimento. Métodos analíticos A determinação da concentração celular foi feita por turbidimetria ( =600 nm). A curva de correlação DO X Peso seco, foi obtida pela filtração de 8 ml de caldo fermentado em membranas previamente secas e pesadas nos tempos 0, 5 12 e 24 h de cultivo. A equação da reta obtida pode ser visualizada abaixo: y = 2,3459x + 0,0801 R 2 = 0,9975 (equação 1) O P(3HB) foi dosado por cromatografia gasosa conforme o método de metanólise baseado em BRAUNEGG et al. (1978), com as modificações propostas por BRANDL et al. (1988).Para a extração do polímero foi utilizada a técnica de LEE 1996 com alterações. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os experimentos foram realizados comparando-se o cultivo das células de Ralstonia eutropha sem óleo vegetal (controle) e, na presença dos óleos de oliva, soja canola, girassol e dendê. A figura I apresenta a influência dos óleos vegetais sobre o crescimento microbiano nas temperaturas de 30 e 37ºC. Os resultados, em termos da velocidade específica de crescimento máxima, µx(h -1 ), demonstram que não houve uma influência positiva da presença do óleo vegetal sobre o crescimento microbiano para as duas temperaturas testadas, exceto para o óleo de soja em que os resultados deverão ser confirmados para temperatura de 30ºC. Óleo sobre o crescimento celular mi x (h-1) 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 controle soja canola girassol dende oliva óleo vegetal 30ºC 37ºC FIGURA I: Gráfico de influência dos óleos vegetais sobre o crescimento microbiano nas temperaturas de 30 e 37ºC.

4 A velocidade máxima de crescimento foi obtida, em todos os ensaios, ocorrendo até por volta de 13 horas de fermentação, entrando as células em seguida, na fase estacionária (resultados não demonstrados). Os experimentos de favorecimento da fase de produção de polímero foram realizados limitando-se a fonte de nitrogênio, ou seja, utilizando a concentração de 2,3g/L, sendo que o pulso de óleo vegetal ocorreu entre 13 e 14 horas de fermentação, tempo em que o microrganismo já finalizava a fase de crescimento exponencial de crescimento e iniciava a fase estacionária. De acordo com a figura II, pode-se observar que não há uma influência perceptível da presença do óleo vegetal sobre a fase de produção do polímero nas duas temperaturas testadas, no entanto, nota-se grande diferença com relação à temperatura de 37ºC, que, favorece a produção do polímero em média 400%. Efeito do óleo sobre a produção de PHB-24h PHB (g/l) 2,5 2 1,5 1 0,5 0 controle soja canola girassol dende oliva óleo vegetal 30ºC 37ºC FIGURA II: Influência dos óleos vegetais sobre a fase de produção. CONCLUSÕES A influência de óleos vegetais como suplementos nutricionais em culturas de Ralstonia eutropha, tendo como referência a concentração de ácido oléico presente, não se mostrou positiva com relação ao incremento do crescimento microbiano em nenhuma das temperaturas testadas. Também não houve uma influência perceptível da presença do óleo vegetal sobre a fase de produção do polímero para as duas temperaturas testadas, no entanto, a temperatura de 37º favorece a produção do polímero em cerca de 400%. Isto pode estar diretamente ligado ao fato de que em 37ºC as bactérias apresentaram maior velocidade de crescimento e com isso, ao final da fermentação produziram mais polímero, ou ainda, ao fato de que a diferença de temperatura interfere diretamente na assimilação dos óleos pelos microrganismos. Porém seriam necessárias mais análises para confirmar estas hipóteses.

5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BRANDL, H., BACHOFEN, R.; MAYER, J.;WINTERMANTEL, E. Minireview: Degradation and applications of polyhydroxyakanoates. Can. J. Microbiol. 41: BRAUNNEG, G., SONNLEITNER, B., LAFFERTY, R. M. A rapid gas chromatographic method for the determination of poly- ß hydroxybutyric acid in microbial biomass. Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 6: 29 37, BRAUNEGG, G.; LEFEBVRE, G. & GENSER, K.F.; Review article: Polyhydroxyalkanoates, biopolyesters from renewable resources: Physiological and engineering aspects, Journal of Biotechnology. 65: , GOMES, J. G. C. & BUENO NETTO, C. L. Produção de plásticos biodegradáveis por bactérias. Revista Brasileira de Eng. Química. 17: 24-29, LEE, S.Y. Plástic bacteria progress and prospects fo polyhydroxyalkanoate production in bacteria. Trends Biotechnology. 14: MIRALLES, J. Ecologia Para Organizações Juvenis. Lisboa: APCC, REIS, R. L.; CUNHA, A. M. Caracterization or two biodegradable polymers of potencial application within the biomaterials field. Journal of Materials in Medicine. 6: , SILVA, L. F., WADA, M. A. A., KLOSS, J., GOMEZ, J. G. C., ZAWADZSKI, S., WANG, S. H., AKCELRUD, L. Avaliação da biodegradabilidade de Poli (ε- caprolactona b poliuretano) através do teste STURM. In: 6º Congresso de Polímeros, Anais. Belo Horizonte, Associação Brasileira de Polímeros. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem ao FAP/UNIVILLE e à FUNCITEC pelo apoio financeiro.