PRODUÇÃO DE POLI(3-HIDROXIBUTIRATO) POR Cupriavidus necator EM PROCESSO DESCONTÍNUO ALIMENTADO COM PULSO DE GLICEROL

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1 PRODUÇÃO DE POLI(3-HIDROXIBUTIRATO) POR Cupriavidus necator EM PROCESSO DESCONTÍNUO ALIMENTADO COM PULSO DE GLICEROL Bruna R. Sombrio, Tamiris Schoereder, Michele C.F. Garcia, Giannini P. Apati, Andréa L.S. Schneider e Ana Paula T. Pezzin Laboratório de Biopolímeros - Universidade da Região de Joiniville UNIVILLE Rua Paulo Malschitski, 10 Joinville Bom Retiro - SC *anapezzin@yahoo.com.br RESUMO O poli(3-hidroxibutirato), PHB, é um poliéster natural e biodegradável, produzido e acumulado como reserva energética por diversos micro-organismos. É considerado um atrativo substituto para os polímeros petroquímicos, devido a vantagem de ser degradado no solo em poucos meses pela ação de micro-organismos. Em decorrência da política nacional de adição de biodiesel nos combustíveis fósseis o glicerol, principal subproduto do biodiesel, está sendo produzido em larga escala, sendo necessário encontrar utilizações comerciais para essa produção. Uma delas é sua utilização como fonte de carbono no cultivo de micro-organismos. O objetivo deste trabalho foi sintetizar PHB a partir do cultivo da bactéria Cupriavidus necator tendo glicerol como cosubstrato. Após o cultivo, foram preparados filmes de PHB e caracterizados por espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), calorimetria exploratória diferencial (DSC) e análise termogravimétrica (TGA) e verificou-se que não houve modificação das propriedades dos filmes de PHB obtido em meio contendo glicerol. Palavras-chave: P(3HB), Cupriavidus necator, glicerol. INTRODUÇÃO A elevada utilização de materiais poliméricos vem crescendo nos últimos anos devido às suas características, tais como, durabilidade, facilidade de processamento e resistência à biodegradação. No entanto, esse fato é preocupante, pois a maioria dos plásticos convencionais são produzidos a partir de derivados do petróleo, um recurso não renovável. O uso de polímeros biodegradáveis vem despertando interesse de pesquisadores de todas as áreas, devido à diversidade de suas aplicações nos campos da biotecnologia, medicina, farmácia e agricultura, em produtos de rápido descarte, como barbeadores, embalagens de cosméticos, copos e talheres plásticos [1, 2]. Os polímeros biodegradáveis possuem propriedades que se assemelham aos de origem petroquímica, além de serem degradados no solo pela ação de micro-organismos em poucos meses, sendo transformados em água e gás carbônico [3]. 8083

2 Uma classe de polímeros bacterianos que vem se destacando são os polihidroxialcanoatos (PHAs). O termo PHA constitui uma classe de poliésteres que são produzidos por diversas bactérias e acumulados na forma de grânulos intracelulares de reserva de carbono, energia e equivalentes redutores [4]. Cupriavidus necator é o micro-organismo mais atraente para a produção industrial por acumular mais de 80% de sua massa celular em P(3HB), poli(3-hidroxibutirato), com alta massa molar, utilizando diferentes substratos [5] como a glicose ou a frutose (espécie mutante), [6], glicerol [7], óleos vegetais [8], também a partir de um efluente rico em ácido graxo obtido da produção de azeite de oliva [9]. O acúmulo de PHA, na forma de grânulos, em C. necator geralmente ocorre quando existe excesso de fonte de carbono e limitação de algum nutriente essencial à multiplicação das bactérias. Trata-se de uma síntese que ocorre em duas etapas. Na primeira etapa, na maioria dos micro-organismos, procura-se favorecer ao máximo o crescimento celular e assegurar, ao mesmo tempo, que a síntese do polímero seja a menor possível. Inversamente, na segunda etapa, interrompe-se o crescimento celular e estimula-se ao máximo o acúmulo de polímero nas células [10]. O P(3HB) possui propriedades que se assemelham às do polipropileno (poliéster de origem petroquímica). No entanto suas aplicações são limitadas, pois trata-se de um material rígido e quebradiço [1], que apresenta também maior grau de cristalinidade em relação aos copolímeros de PHAs. O alto custo de produção dos PHAs, também tem limitado seu uso para a grande maioria das aplicações. Aproximadamente 45 % dos custos totais de produção podem ser atribuídos à matéria prima, na qual a fonte de carbono é a mais consumida, portanto torna-se interessante o desenvolvimento de processos de produção baseados em fontes de carbono residuais. Por outro lado, o crescimento da produção de biodiesel, na qual o principal coproduto é o glicerol, tem gerado um excedente deste composto levando, consequentemente, a um decréscimo no seu preço de venda. Diante deste contexto, a presente proposta tem como objetivo a produção de poli(3-hidroxibutirato) a partir de Cupriavidus necator tendo açúcar invertido como fonte de carbono na concentração inicial de 30 g L -1 com pulso de glicerol em diferentes estratégias de cultivo, para em seguida avaliar as propriedades destes polímeros por espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), análise termogravimétrica (TGA) e calorimetria diferencial exploratória (DSC). 8084

3 MATERIAL E MÉTODOS Foi utilizada a bactéria mutante Cupriavidus necator DSM 545 e meio mineral como meio de cultivo [1]. Todos os ensaios foram conduzidos com a mesma concentração de meio mineral e substrato (30 g L -1 de açúcar invertido). Foram realizados três experimentos diferentes nas seguintes condições: cultivo sem adição de glicerol (SG); cultivo com adição de 20 g L -1 de glicerol puro na fase de produção do polímero (AG-FP) e cultivo com adição de 20 g L -1 de glicerol puro no início do cultivo (AG-IC). Sempre que a concentração de substrato se aproximava de 10 g L -1, foi feito pulso de açúcar a partir de uma solução a 500 g L -1, de forma a permitir que a concentração de açúcar no meio retornasse ao valor inicial (30 g L -1 ). A extração de P3(HB) foi realizada usando-se um novo método adaptado por Garcia (2006) [11]. Após, o P3(HB) foi purificado em n-hexano. Filmes de P3(HB) foram preparados por casting e secos em estufa a vácuo por 24 h a 30 ºC. FTIR foi realizado em equipamento Perkin Elmer Frontier, entre cm -1, utilizando o método ATR. As medidas no DSC foram realizadas em equipamento da TA Instruments. As amostras foram aquecidas, sob atmosfera de nitrogênio, de 25 a 190 C a 10 C min - 1, resfriadas a -100 C e aquecidas de -100 a 190 C a 10 C min -1. As análises de TGA foram realizadas em um equipamento TA Instruments, aquecidas de 25 a 600 C a 10 C min -1, sob atmosfera de nitrogênio. RESULTADOS E DISCUSSÃO Calorimetria Exploratória Diferencial Os dados obtidos das curvas de DSC em diferentes condições referentes ao primeiro e segundo aquecimentos estão sumarizados na Tab. 1. Observa-se que a temperatura de fusão (Tm) não sofreu alteração significativa em função da condição de cultivo testada. Os valores de Tm encontrados foram 171,8 C para a amostra SG, 173,4 C para AG-FP e 172,7 C para AG-IC. Lima (2004) [12] relata que a Tm do P(3HB) geralmente oscila entre 170 e 180 C, portanto todos os polímeros obtidos estão dentro da faixa esperada para o P(3HB). A temperatura de transição vítrea (Tg) obtida para as diferentes amostras de P(3HB) oscilaram de -13,9 a -7,6 C, 8085

4 situando um pouco abaixo da faixa geralmente reportada na literatura para este polímero, que varia entre 5 e 5 ºC [13]. O grau de cristalinidade (αc) para o P(3HB) foi calculado através da razão entre a variação do calor de fusão das misturas pela variação do calor de fusão dos polímeros 100% cristalinos, utilizando ΔHmº para o P(3HB) 100% cristalino igual a 146 J g -1. O grau de cristalinidade determinado para as três amostras foi 63,4 % para SG, 64,3 % para AG-FP e 59,9 % para AG-IC, valores que estão de acordo com a literatura especificada para o P(3HB). Segundo Khanna e Srivastava (2005) [14] o grau de cristalinidade do P(3HB) varia entre 60 e 80%. Tabela 1. Dados de temperatura de transição vítrea (Tg), temperatura de fusão cristalina (Tm), entalpia de fusão (ΔHm) e grau de cristalinidade (αc) para os polímeros sintetizados sem glicerol (SG) e com adição de glicerol puro na fase de produção (AG-FP) e no início do cultivo celular (AG-IC). Amostra T g ( C) T m ( C) ΔH m (J g -1 ) α c (%) SG -13,9 171,8 90,2 63,4 AG-FP -7,6 173,4 91,3 64,3 AG-IC -8,7 172,7 85,1 59,9 Espectroscopia no Infravermelho Os espectros de FTIR dos polímeros em diferentes condições estão apresentados na Fig. 1. Todas as amostras apresentaram os mesmos picos, característicos do P(3HB): deformações axiais simétrica e assimétrica da ligação C- H em 2976 e cm -1, deformações axiais da carbonila (C=O) em 1719 cm -1, pico atribuído à vibração da carbonila do grupo éster no estado cristalino (XU et al., 2002) [15] e deformação angular simétrica no plano dos grupos CH3 em 1379 cm -1. Foram observados ainda picos em 1275 e cm -1, atribuídos aos estiramentos simétricos e assimétricos, respectivamente, do grupo C-O-C. Estes picos também foram observados por Apati (2012) [16] e Garcia (2006) [11]. 8086

5 Figura 1. Espectros de FTIR para os filmes de P(3HB) para as amostras SG; AG-FP e AG-IC. Análise Termogravimétrica A Tabela 2 mostra os dados obtidos das curvas TG e DTG. Pode-se observar que todos os polímeros sintetizados apresentaram apenas um estágio de perda de massa, atribuído à decomposição do P(3HB), com valores de 91,2 % para SG, 96,9 % para AG-FP e 100 % para AG-IC. Os polímeros apresentaram Tonset de 211,5 C para a amostra SG; 222,2 C para AG-FP e 218,9 C para AG-IC, evidenciando menor estabilidade térmica em relação ao valor encontrado por Vogelsanger et al. (2004) [17] para P(3HB) industrial que foi de 264,7 C. A temperatura de degradação máxima apresentada pelas amostras foi de 234,6 C para SG, 246,9 C para AG-FP e 243 C para AG-IC. Estes valores também foram inferiores aos encontrado por Duarte (2004) [18] para o P(3HB) com massa molar igual a g mol -1, que apresentou Tonset = 269,6 C e Tmáx = 288,1 C. No entanto, Apati (2012) [15] já havia observado valores inferiores de estabilidade térmica tanto para P(3HB) sintetizado tendo apenas açúcar invertido como fonte de carbono (Tonset = 242,8 C e Tmáx = 256,3 C), quanto para o polímero sintetizado com açúcar invertido e 15 g L -1 de glicerol puro adicionado como cosubstrato (Tonset = 242,7 C e Tmáx = 254, 2 C). 8087

6 Tabela 2. Dados de perda de massa, Tonset e Tmáx obtidos das curvas de TG e DTG para as amostras SG, AG-FP e AG-IC. Amostra % perda de massa T onset ( C) T máx ( C) SG 91,2 211,5 234,6 AG-FP 96,9 222,3 246,9 AG-IC ,8 243,0 CONCLUSÃO Neste trabalho P(3HB) foi sintetizado em diferentes condições de cultivo com o objetivo de avaliar as propriedades do polímero obtido. Os resultados demonstraram que as condições de cultivo com e sem adição de glicerol favoreceram a biossíntese de P(3HB) com temperatura de fusão muito próxima à reportada na literatura e temperatura de transição vítrea um pouco abaixo da faixa especificada para o P(3HB). As amostras também apresentaram temperatura máxima de degradação e estabilidade térmica um pouco inferior ao resultado encontrado por outros autores, fato que pode limitar suas aplicações industriais. AGRADECIMENTOS À CAPES e ao Fundo de Apoio a Pesquisa/UNIVILLE pelo apoio financeiro. REFERÊNCIAS 1. SCHNEIDER, A. L. S. Síntese, caracterização e biodegradação de poli-3-hidróxibutirato P(3HB) de Ralstonia eutropha e blendas de P(3HB)/PCL (poli-e-caprolactona) Tese de Doutorado, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis. 2. CALVÃO, P. S. Obtenção e caracterização de misturas do polímero biodegradável P(3HB) e seu copolímero P(3HB-co-3HV) com elastômeros Tese de Doutorado, Escola Politécnica da Universidade de São Paulo. 3. PRAZERES, L.; GRIGULL, V. H.; GARCIA, M. C. F.; DUEK, E. A. R.; SCHNEIDER, A. L. S.; PEZZIN, A. P. T. Avaliação da miscibilidade de blendas de poli(p-dioxanona) e poli(3- hidroxibutirato). In: Congresso Brasileiro de Polímeros - CBPol, Campina Grande, 2007, Vol SILVA, L. F.; GOMEZ, J. G. C. Produção biotecnológica de poli-hidroxialcanoatos para a geração de polímeros biodegradáveis no Brasil. Química Nova, 2007, 30(7), BYROM, D. Polymer synthesis by microorganisms; technology and economics. Trends Biotechnology, 1987, 5,

7 6. TANAK; K.; ISHIZAKI, A.; KANAMARU, T.; KAWANO, T. Production of poly-(d-3- hydroxybutirate) from CO 2, H 2 and O 2 by high cell density autotrophic cultivation of Alcaligenes eutrophus. Biotechnol. Bioeng., 1994, 45, CAVALHEIRO, J. M. B. T.; RAPOSO, R. S.; ALMEIDA, M. C. M. D.; CESÁRIO, M. T.; SEVRIN, C.; GRANDFILS, C.; FONSECA, M. M. R. Effect of cultivation parameters on the production of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) and poly(3-hydroxybutyrate-4- hydroxybutyrate-3-hydroxyvalerate) by Cupriavidus necator using waste glycerol. Bioresource Technology, 2012, 111, FUKUI, T.; DOI, Y. Efficient production of polyhydroxyalkanoates from plant oils by Alcaligenes eutrophus and its recombinant strain. Applied Microbiology and Biotechnology, 1998, 49, MARTINEZ, G. A.; BERTIN, L.; SCOMA, A.; REBECCHI, S.; BRAUNEGG, G.; FAVA, F. Production of polyhydroxyalkanoates from dephenolised and fermented olive mill wastewaters by employing a pure culture of Cupriavidus necator. Biochemical Engineering Journal, 2015, 97, GOMEZ, J. C. G.; BUENO NETTO, C. Produção de plásticos biodegradáveis por bactérias. Revista Brasileira de Eng. Química, 1997, 17, GARCIA, C. F. Proposta de um processo de extração de poli(3-hidroxibutirato) produzido por Cupriavidus necator e seu efeito sobre as características do polímero Dissertação de Mestrado, Universidade Federal de Santa Catarina. 12. LIMA, J. A. Blendas de poli(hidroxibutirato) e elastômeros de epicloridrina Dissertação de Mestrado, Universidade Estadual de Campinas. 13. ANDERSON, A. J.; DAWES, E. A. Occurrence, metabolism, metabolic role and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates. Microbial Review, 1990, 54, KHANNA, S.; SRIVASTAVA, A. K. Recent advances in microbial polyhydroxyalkanoates. Process Biochemistry, 2005, 40, XU, J.; GUO, B. H.; YANG, R.; WU, Q.; CHEN, G. Q.; ZHANG, Z. M. In situ FTIR study on melting and crystalization of polyhydroxyalkanoates. Polymer, 2002, 43, APATI, G. P. Síntese, caracterização e degradação de P(3HB) por Cupriavidus necator, utilizando glicerol como substrato Tese de Doutorado, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis. 17. VOGELSANGER, N. JR.; FURLAN, S. A.; SCHNEIDER, A. L. S.; PIRES, A. T. N.; PEZZIN, S. H.; PEZZIN, A. P. T. Filmes de P(3HB) e PCL: Acompanhamento da Biodegradação em Solo por Propriedades Térmicas e Morfológicas. Revista Matéria, 2004, 9 (4), DUARTE, M. A. T., Estudo do processamento e da degradação térmica do poli(3-hidroxibutirato) e de suas blendas com poli(ε-caprolactona) Dissertação de Mestrado, Universidade do Estado de Santa Catarina. TÍTULO EM INGLÊS ABSTRACT Plastics develop an important role in society and a part of this material is rapidly dropped, but the degradation is slower. The use of biodegradable polymers has attracted interest from researchers in all areas due to the diversity of its applications. In this context, Cupriavidus necator was cultivated in a batch process in a bioreactor fed with 30 g L -1 invert sugar as the carbon source and the addition of glycerol as a co-substrate in the concentration of 20 g L -1. After culture, films were prepared from P 8089

8 (3HB) and characterized by FTIR, DSC and TGA. The results demonstrated that the culture conditions with and without addition of glycerol led to biosynthesis of P (3HB) with similar properties. Keywords: P(3HB), Cupriavidus necator, glycerol. 8090