Universidade do Vale do Paraíba Faculdade de Educação e Artes Curso de Ciências Biológicas. Aline Sousa Gomes Correia

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1 Universidade do Vale do Paraíba Faculdade de Educação e Artes Curso de Ciências Biológicas Aline Sousa Gomes Correia ESTUDO DA MIOTOXICIDADE INDUZIDA POR A PEÇONHA DE Bothrops fonsecai: ANÁLISE QUANTITATIVA DE FIBRAS LESIONADAS. Jacareí- SP 2012

2 Aline Sousa Gomes Correia ESTUDO DA MIOTOXICIDADE INDUZIDA POR A PEÇONHA DE Bothrops fonsecai: ANÁLISE QUANTITATIVA DE FIBRAS LESIONADAS Relatório final apresentado como parte das exigências da disciplina Trabalho de Conclusão de Curso à banca avaliadora do curso de Ciências Biológicas da Faculdade de Educação e Artes da Universidade do Vale do Paraíba. Orientador: Dr. José Carlos Cogo Jacareí SP 2012

3 Aline Sousa Gomes Correia ESTUDO DA MIOTOXICIDADE INDUZIDA POR A PEÇONHA DE Bothrops fonsecai: ANÁLISE QUANTITATIVA DE FIBRAS LESIONADAS Relatório final aprovado como requisito parcial à obtenção do grau de Bacharel em Ciências Biológicas da Faculdade de Educação e Artes da Universidade do Vale do Paraíba, São José dos Campos, SP, pela seguinte banca examinadora: Orientador: Dr. José Carlos Cogo Banca Examinadora: Prof. Dr. Frederico Lencioni Neto Prof. Dr. Wellington Ribeiro Nota do trabalho...(...) Jacareí, SP 2012

4 DEDICATÓRIA Dedico esse trabalho aos meus pais como forma de gratidão à tudo que fize- ram por mim.

5 AGRADECIMENTOS Agradeço em primeiro lugar a Deus que me deu forças para realizar os meus sonhos e me sustentou em todos os momentos. Agradeço ao Dr. José Carlos Cogo, pela orientação e ensinamentos. Ao Msc. Antônio Carlos Guimarães Prianti Júnior e ao Dr. Wellington Ribeiro, por todas as dicas, momentos de bom humor e a disponibilização do laboratório para as técnicas de histologia. Ao Dr. Marco Antônio de Oliveira pelas dicas de histologia. As amigas de laboratório Amanda, Carla e Fernanda por toda a ajuda, momentos de descontração e amizade. A Elaine Couto, pelas caronas, lanches e conselhos. Por ter sido muitas vezes, uma mãezona para mim. MUITO OBRIGADO MESMO! As colegas do Serpentário Edvana e Silara, pela contribuição na parte experimental. Ao colega de laboratório Vanderson, por me ensinar a realizar as dosagens de Creatina Quinase. Aos meus pais, pelo incentivo e por me ensinarem a batalhar pelos meus sonhos. Eu amo vocês. OBRIGADO! Aos meus pais postiços Edison e Sônia, por terem permitido que eu residisse com eles durante a realização da graduação. Certamente, sem essa ajuda, eu não teria chegado até aqui. Á vocês meu sincero OBRIGADO! A Evelyn e ao Everton, por terem se tornado meus irmãos e terem divido comigo casa, quarto e pais. Ao meu noivo Leandro, pela paciência, companheirismo, dedicação e amor. A bibliotecária Rúbia, pela paciência e ajuda. Ao meu amigo Allan Maurício, pela ajuda com as traduções em inglês. Aos meus amigos da turma de Ciências Biológicas do Vila Branca, por todas as palavras de incentivo. A todos que de forma direta ou indireta, contribuíram para realização deste trabalho.

6 RESUMO A serpente Bothrops fonsecai (B. fonsecai) é encontrada na região sudeste do Brasil, ao leste de São Paulo, sul do Rio de Janeiro e ao extremo sul de Minas Gerais. Neste trabalho, os objetivos foram avaliar quantitativamente e morfologicamente a extensão da lesão promovida pela ação da peçonha de B. fonsecai em fibras musculares, através do estudo morfométrico para quantificar as fibras musculares lesadas e do estudo morfológico através da análise da morfologia das células musculares. A análise histológica nos músculos incubados com 40 e 80 µg/ml de B. fonsecai apresentou lesões do tipo delta, vacuolização, hipercontração das miofibrilas e células com mionecrose. O número de fibras lesadas foi dado pelo número total de células lesadas e expresso como porcentagem do número total de células. Os músculos do grupo controle, incubados apenas com solução de Krebs apresentaram poucas lesões (5,60 ± 1,68%), os músculos incubados com 40 µg/ml apresentaram 54,90 ± 2,87% e os músculos incubados com 80 µg/ml 88,70 ± 2,19. A liberação de Creatina Quinase que é um indício de lesão celular mostrou-se crescente durante os 120 minutos de incubação em todos os tratamentos, porém, de forma mais intensa para a dose de 80 µg/ml da peçonha de B. fonsecai. Concluímos desta forma que a peçonha de B. fonsecai tem ação miotóxica semelhante a ação observada com venenos de outras serpentes botrópicas. Palavras chaves: Bothrops fonsecai, mionecrose, peçonha, serpente.

7 ABSTRACT The Bothrops fonsecai (B. fonsecai), can be found in the southeastern area of Brazil, east of São Paulo, south of Rio de Janeiro and in the extreme south of Minas Gerais. In this study,, the objectives were to morphologically and quantitatively assess the extent of injury promoted by the action of the venom of B. fonsecai in muscle fibers, through the morphometric analysis to quantify the damaged muscle fibers and through the analysis of the muscle cell morphology. The histological analysis in incubated muscle with 40 and 80 µg/ml of B. fonsecai presented delta type injuries, vacuolization, hipercount of myofibrils and cells with myonecrosis. The number of injured fibers was given by the total number of injuried cells, and expressed as percentage of total cell number. The muscles of the control group, only incubated with Krebs solution, presented few injuries (5.60 ± 1.68%), incubated muscles with 40 µg/ ml presented ± 2.87% and incubated muscles, with 80 µg/ml ± The release of Kinase Creatine, which is an indication of cellular injury, proved to be increasing during the 120 minutes of incubation in all treatments, but more intensely for the dose of 80 µg/ml venom of B. fonsecai. We conclude therefore that the venom of B. fonsecai has myotoxic action similar to the observed action of other biotropic snake venoms. Keywords: Bothrops fonsecai, myonecrosis, venom, snake.

8 Lista de Ilustrações Figura 1: Bothrops fonsecai adulta pertence ao Serpentário da Univap Figura 2. Corte transversal do músculo biventer cervicis, após 120 minutos em solução de Krebs Figura 3. Morfologia do músculo biventer cervicis, após 120 minutos de incubação com 40 µg/ml de peçonha de B.fonsecai Figura 4. Morfologia do músculo biventer cervicis, após 120 minutos de incubação com 80 µg/ml de peçonha de B. fonsecai Gráfico 1: Curva de liberação de Creatina Quinase (CK) pela ação da peçonha de B. fonsecai em preparação de biventer cervicis de pintainho Gráfico 2: Determinação do índice de mionecrose em músculo biventer cervicis de pintainho, após 120 minutos com as doses estudadas

9 Lista de Tabelas Tabela 1: Índice de mionecrose do músculo biventer cervicis de pintainho durante 120 minutos

10 Sumário 1 INTRODUÇÃO Objetivo geral Objetivos específicos REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Serpentes brasileiras Gênero Bothrops Atividades biológicas e constituição química da peçonha botrópica Bothrops fonsecai Hoge & Belluomini (1959) MATERIAL E MÉTODOS Comitê de Ética em Pesquisa Animais Protocolo de Eutanásia Peçonha Preparação do músculo biventer cervicis de Pintainho Estudo bioquímico: Dosagem de Creatina Quinase (CK) Técnica histológica- análise morfológica Determinação do índice de mionecrose: análise quantitativa de fibras lesadas Análise estátistica RESULTADOS Estudo bioquímico: liberação de Creatina Quinase (CK) Índice de mionecrose Análise morfológica DISCUSSÃO CONCLUSÕES: REFERÊNCIAS ANEXO A: CEP... 40

11 11 1 INTRODUÇÃO Os acidentes causados por serpentes peçonhentas, ainda são problema de Saúde Pública em regiões tropicais do mundo sendo dessa forma de grande importância a realização de estudos que caracterizem os sintomas e efeitos locais do envenenamento, bem como os constituintes químicos dos mesmos. As peçonhas ofídicas são misturas complexas, que quando injetadas em animais, ou humanos no caso de acidentes, produzem sintomas variados (MEBS; OWNBY, 1990). Entre eles, efeitos agudos que podem ser fatais, como falência cardiovascular ou renal, choque, paralisia e outras manifestações, como edema hemorrágico (OWNBY et al, 1992; MEBS; EHRENFELD, SAMEJIMA, 1983). Existem atualmente cerca de espécies de serpentes no mundo, distribuídas em 465 gêneros e 20 famílias. No Brasil, há representantes de nove famílias, 75 gêneros e 321 espécies, ou seja, cerca de 10% do total de espécies descritas atualmente (FRANCO, 2003). No Brasil ocorrem, aproximadamente, 70 espécies que oferecem riscos potenciais para o homem (FREITAS, 1999). De todo esse elenco, as serpentes peçonhentas existentes no Brasil pertencem a duas famílias, Elapidae e Viperidae (subfamília Crotalinae). O único gênero da família Elapidae, no Brasil, é o Micrurus, cujas espécies são conhecidas popularmente por corais (MELGAREJO, 2003). A posição e anatomia dos dentes inoculadores de peçonha (presas) constituem uma das principais características taxonômicas distintivas de Elapidae e Viperidae. Existe uma relação direta entre o número de acidentes ofídicos e as características da dentição e a eficiência da inoculação da peçonha. Essas características permitem a classificação dessas serpentes em Solenóglifas, Proteróglifas, Opistóglifas e Áglifas. Os caracteres que nos permitem diferenciar a família Viperidae são: 1) fosseta loreal, 2) cabeça triangular recoberta com escamas pequenas, 3) dentes inoculadores de veneno (presas) grandes, pontiagudos, móveis e ocos, situados na frente da boca (solenoglifodontes), 4) parte superior do corpo recoberta por escamas sem brilho, em forma de quilha, e 5) cauda diferenciada para cada gênero da família, ou seja, cauda lisa, com guizo ou chocalho ou cauda com escamas arrepiadas no final (MANUAL DE DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO DE ACIDENTES POR ANIMAIS PEÇONHENTOS, 2011)

12 12 A família Viperidae possui aparelho peçonhífero complexo, são solenóglifas ou solenoglifodontes, dentre a qual se encontra o gênero Bothrops (BORGES, 2001). Os viperídeos representam o mais importante grupo de serpentes para a saúde pública, pois são responsáveis pela maioria e os mais graves acidentes ofídicos registrados, não só no Brasil, mas também em outros países americanos (MELGAREJO, 2003). São relatados aproximadamente acidentes por serpentes peçonhentas, com mais de 100 mortes anuais, em todo território brasileiro (MANUAL DE DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO DE ACIDENTES POR ANIMAIS PEÇONHENTOS, 2011) No Estado de São Paulo, nos casos em que houve a identificação da serpente que causou o acidente, as serpentes do gênero Bothrops foram responsáveis por 83,3% dos casos notificados à São Paulo. Secretaria de Saúde (1993), entre os anos de 1986 a De acordo com a WHO. Organização Mundial da Saúde (OMS- 1981), em outras regiões brasileiras, a mortalidade tem sido estimada em 2,4 %, podendo ser mais alta que 8%, quando o indivíduo vitimado não recebe tratamento com o antiveneno adequado. Estudos realizados por Pires (2004) na região do Vale do Paraíba observaram que no período de 1999 a 2003 foram notificados 140 acidentes no Hospital Municipal de São José dos Campos, SP. Destes, 56% foram considerados leves e 27% moderados, sendo que a maior parte dos acidentes (76%) ocorreram em zonas rurais e 22% em zonas urbanas. 59% dos casos registrados foram atribuídos às serpentes do gênero Bothrops, 17% ao gênero Crotalus, 8% a serpentes não-peçonhentas e 3% ao gênero Micrurus. Os acidentes causados por serpentes peçonhentas, ainda são problema de Saúde Pública em regiões tropicais do mundo, sendo dessa forma de grande importância a realização de estudos que caracterizem os sintomas e efeitos locais do envenenamento, bem como os constituintes químicos dos mesmos. 1.1 Objetivo geral Estudar quantitativamente a extensão da lesão promovida pela ação do veneno de Bothrops fonsecai em fibras musculares.

13 Objetivos específicos 1) Realizar o estudo morfométrico pela quantificação de fibras musculares lesadas e morfológico pela análise da morfologia das células musculares. 2) Realizar o estudo do aspecto bioquímico pela determinação dos níveis de Creatina Quinase (CK).

14 14 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Serpentes brasileiras Existem atualmente cerca de espécies de serpentes no mundo, distribuídas em 465 gêneros e 20 famílias. No Brasil, há representantes de nove famílias, 75 gêneros e 321 espécies, ou seja, cerca de 10% do total de espécies descritas atualmente (FRANCO, 2003). No Brasil ocorrem, aproximadamente, 70 espécies que oferecem riscos potenciais para o homem (FREITAS, 1999). De todo esse elenco, as serpentes peçonhentas existentes no Brasil pertencem a duas famílias, Elapidae e Viperidae (subfamília Crotalinae). O único gênero da família Elapidae, no Brasil, é o Micrurus, cujas espécies são conhecidas popularmente por corais (MELGAREJO, 2003). A posição e anatomia dos dentes inoculadores de peçonha (presas) constituem uma das principais características taxonômicas distintivas de Elapidae e Viperidae. Existe uma relação direta entre o número de acidentes ofídicos e as características da dentição e a eficiência da inoculação da peçonha. Essas características permitem a classificação dessas serpentes em Solenóglifas, Proteróglifas, Opistóglifas e Áglifas. Os caracteres que nos permitem diferenciar a família Viperidae são: 1) fosseta loreal, 2) cabeça triangular recoberta com escamas pequenas, 3) dentes inoculadores de veneno (presas) grandes, pontiagudos, móveis e ocos, situados na frente da boca (solenoglifodontes), 4) parte superior do corpo recoberta por escamas sem brilho, em forma de quilha, e 5) cauda diferenciada para cada gênero da família, ou seja, cauda lisa, com guizo ou chocalho ou cauda com escamas arrepiadas no final (MANUAL DE DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO DE ACIDENTES POR ANIMAIS PEÇONHENTOS, 2011) A família Viperidae possui aparelho peçonhífero complexo, são solenóglifas ou solenoglifodontes, dentre a qual se encontra o gênero Bothrops (BORGES, 2001). Os viperídeos representam o mais importante grupo de serpentes para a saúde pública, pois são responsáveis pela maioria e os mais graves acidentes ofídicos registrados, não só no Brasil, mas também em outros países americanos (MELGAREJO, 2003).

15 Gênero Bothrops O gênero Bothrops (ordem Squamata, família Viperidae) é constituído por várias espécies de serpentes que estão distribuídas nas Américas desde o México até a Argentina (HOGE; ROMANO-HOGE, 1972), E engloba, neste país, 30 espécies de acordo com a Fundação Nacional de Saúde (1998). Os ofídios desse gênero são encontrados em todo o território nacional. Preferem, em geral, locais úmidos, campos, plantações, pastagens ou regiões limítrofes da mata. Possuem hábitos noturnos, alimentam-se principalmente de pequenos roedores e atacam subitamente, erguendo o terço anterior do corpo sem serem percebidos (SOERENSEN, 1990; BOFF; MARQUES, 1996). Segundo Borges (2001), Bothrops é o gênero mais agressivo de tanatofídeos brasileiros, sendo responsável por praticamente 90% dos acidentes. A amplitude de acidentes pode ser atribuída a este comportamento agressivo, assim como a sua ampla distribuição geográfica. Os acidentes ocorrem, principalmente, nos meses mais quentes do ano, devido a um aumento da atividade do animal e ao maior afluxo de pessoas para o campo (BORGES, 2001). As características das serpentes variam dependendo da espécie e da região onde vivem, porém de forma geral, possuem cauda lisa, sem chocalho e são conhecidas popularmente como jararaca, ouricana, jararacuçu, urutu-cruzeira, jararaca do rabo branco, malha de sapo, patrona, surucucurana, combóia e caiçaca (CUPO et al, 1990). 2.3 Atividades biológicas e constituição química da peçonha botrópica As peçonhas das serpentes do gênero Bothrops contêm diferentes toxinas e natureza protéica, algumas com atividade enzimática, que podem atuar conjuntamente e são responsáveis pelos principais efeitos lesivos, sistêmicos e locais (MOURA-DA-SILVA et al., 1991). A composição química destas proteínas tóxicas é muito variável, refletindo grandes alterações em efeitos específicos e na toxicidade das peçonhas (CHIPPAUX; WILLIANS; WHITE, 1991). Essas moléculas compreendem cerca de 90 a 95% do peso seco do veneno, incluindo muitas enzimas, toxinas não enzimáticas e proteínas não tóxicas. As frações não proteicas são compostas por cátions metálicos, carboidratos,

16 16 nucleosídeos, aminas biogênicas e níveis menores de aminoácidos livres e lipídios. (CAPRONI, 2009). A peçonha das espécies pertencentes ao gênero Bothrops tem efeito predominantemente proteolítico, coagulante, hemorrágico, inflamatório, edematogênico e miotóxico (DA SILVA; LOPES; GODOY, 1979; FURTADO; COLLETTO; SILVA, 1991; SECRETARIA DE ESTADO DE SAÚDE DE SÃO PAULO, 1993; SOUZA et al., 2001; TEIBLER et al., 2001; MONTEIRO et al., 2002). Os sinais clínicos exibidos pelo envenenamento botrópico são decorrentes dos diversos componentes que já foram isolados dessas secreções, tais como o fator hemorrágico (MANDELBAUM; ASSAKURA; REICHL, 1984), proteases que atuam em etapas da coagulação sanguínea, causando distúrbios de coagulação (NAHAS; KAMIGUTI; BARROS, 1979; HOFMANN; BON, 1987), enzimas proteolíticas (ASSAKURA et al., 1985) e as miotoxinas (GUTIÉRREZ; CERDAS, 1984; GUTIÉRREZ; LOMONTE, 1989; HOMSI-BRANDENBURGO et al., 1988; MOURA- DA-SILVA et al., 1991). O quadro clínico observado no envenenamento botrópico pode ser didaticamente dividido em sistêmico e local (MANUAL DE DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO DE ACIDENTES POR ANIMAIS PEÇONHENTOS, 2011). As manifestações sistêmicas são caracterizadas principalmente por distúrbios na hemostasia, caracterizados por deficiência na coagulação, alteração na agregação plaquetária e depleção de fibrinogênio (HATI et al., 1999). A seqüência desses eventos culmina em sangramentos de ferimentos cutâneos préexistentes e hemorragias à distância, como por exemplo, a gengivorragia. Ainda em nível sistêmico é observado sudorese, hipotensão arterial e hipotermia (CARDOSO, 1997). As manifestações locais são caracterizadas por dor e edema persistentes na região da picada, de intensidade variável e, em geral, de instalação precoce e caráter progressivo. Equimoses e hemorragias no ponto da picada são freqüentes e bolhas podem aparecer na evolução do quadro clínico, acompanhado ou não de necrose (CARDOSO, 1997). Nos casos mais graves, o dano tecidual pode resultar em sérias seqüelas, tais como a perda funcional ou permanente do tecido ou do membro afetado (FRANÇA, 1997). A magnitude dos efeitos locais em envenenamentos botrópicos depende basicamente da quantidade de peçonha inoculada, do tempo entre a picada e o início da soroterapia, do peso e idade do paciente, da região anatômica onde ocorreu a picada e do eventual uso de torniquete (FRANÇA, 1997).

17 17 Efeitos neurotóxicos foram observados, em ratos, para as serpentes Bothrops jararacussu (OSHIMA-FRANCO et al., 2004); Bothrops insularis (COGO et al., 1993; COGO; PRADO-FRANCHESCHI; RODRIGUES-SIMIONI, 2001), Bothrops neuwiedii paoloensis (ZAMUNER; PRADO-FRANCHESCHI; RODRIGUES-SIMIONI, 1996) e Bothrops leucurus (PRIANTI et al., 2003), porém este efeito aparentemente não participa nas manifestações clínicas do envenenamento. O envenenamento de mamíferos causado pela peçonha de serpentes do gênero Bothrops se caracteriza, entre outras coisas, por um proeminente efeito local com edema, hemorragia e necrose do tecido muscular e conjuntivo (GUTIÉRREZ; CHAVEZ, 1980; GUTIÉRREZ; OWNBY; ODELL, 1984a,b; QUEIROZ; PETTA, 1984). Entre os componentes desta peçonha estão: (1) a hialuronidase, que condiciona a difusão dos constituintes do veneno no tecido conjuntivo, devendo contribuir, em conseqüência, para a extensão de seus efeitos locais e para a rapidez de absorção; (2) hemotoxinas, miotoxinas e citolisinas que causam inflamação local, necrose muscular e dano ao epitélio vascular; (3) Fosfolipase A e Estearase, que alteram a permeabilidade da membrana e liberam histaminas, bradicininas, prostaglandinas e leucotrienos. O veneno possui, também, (4) ação proteolítica ou necrosante, que determina edema inflamatório na região da picada; (5) coagulante, atuando através de uma ou mais ações como trombina símile (semelhante à ação da trombina), ativadora de protrombina e do fator X, promovendo consumo de fatores de coagulação com conseqüente alteração da coagulação sangüínea; (6) hemorrágica, atuando na microvasculatura do local da picada e, provavelmente, também na sistêmica e (7) nefrotóxica. Outras atividades que podem participar da fisiopatologia do envenenamento são a fibrinogenolítica, fibrinolítica e agregadora de plaquetas (RIBEIRO; JORGE, 1990; SECRETARIA DE SAÚDE DO ESTADO DE SÃO PAULO, 1993; BOFF; MARQUES, 1996; MÉNDEZ, 1998). Classicamente, as miotoxinas são responsáveis pelas manifestações dos principais sintomas do envenenamento botrópico. É considerado miotoxina o componente do veneno que tem ação direta e específica sobre o músculo esquelético e que pode levar a degeneração e morte celular (mionecrose) (MEBS, D.; OWNBY. C.L, 1990). Várias pesquisas demonstram que todas as miotoxinas dos venenos botrópicos apresentam estrutura de Fosfolipase A 2 (PLA 2 ). As PLA 2 são enzimas que hidrolisam a ligação éster do carbono 2 dos glicerolfosfolipídios resultando em fosfolipídio e ácido graxo, assim produzindo o efeito farmacológico mais característico do envenenamento botrópico, a miotoxicidade local e sistêmica (KINI, 1997).

18 Bothrops fonsecai Hoge & Belluomini (1959) A Bothrops fonsecai, é uma serpente de hábito terrícola. Pode ser encontrada na região sudeste do Brasil, ao leste de São Paulo, sul do Rio de Janeiro e ao extremo sul de Minas Gerais. Sua distribuição é restrita às áreas altas com domínio de Araucária na Serra da Mantiqueira, muito comum na região de Campos do Jordão e arredores. Chega a medir 0,70 metros de comprimento e seu padrão de coloração é basicamente marrom variando o tom entre escuro e claro (CAMPBELL; LAMAR, 1989; MUSEU DO INSTITUTO BUTANTAN, 2007). É uma espécie terrícola e de hábito noturno, portadora de dentição solenóglifa (dentes injetores anteriores ocos), que se alimenta de mamíferos (roedores e marsupiais). Para se defender de predadores usa como estratégia de defesa o achatamento dorsal (aplanamento horizontal de partes do corpo) e botes que incluem mordidas, injeção da peçonha e golpes com a cabeça (MARQUES et al., 2001). Em geral, existe uma ausência de informações na literatura sobre a composição, atividades biológicas, efeitos locais e sistêmicos promovidos pela ação da peçonha de Bothrops fonsecai. São encontradas informações sobre o efeito deste veneno sobre a cascata de coagulação, atuando sobre o fibrinogênio, a protrombina (Fator II) e o fator X (NAHAS; KAMIGUTI; BARROS, 1979), sobre os efeitos na resposta contrátil em músculo biventer cervicis de pintainho sob estimulação elétrica indireta (BUBELA, 2008) e sobre a ação edematogênica (SOUZA, 2007; PEREIRA, 2008).

19 Figura 1: Bothrops fonsecai adulta pertencente ao Serpentário da Univap. Fonte: Silara Batista. 19

20 20 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Comitê de Ética em Pesquisa Os procedimentos utilizados neste projeto foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP), sob o número A-102/CEUA. 3.2 Animais Foram utilizados pintainhos da linhagem HY-LINE W36 (4 a 8 dias de idade) fornecidos pela Granja Ito S/A (Campinas). Os animais foram mantidos em gaiolas abastecidas com água e ração ad libitum. 3.3 Protocolo de Eutanásia Os animais foram anestesiados e eutanasiados com uma overdose de 0,1 ml/kg de cloridrato de xilazina para anestesia e 0,2 ml/kg de cloridrato de ketamina para analgesia. 3.4 Peçonha A peçonha da serpente Bothrops fonsecai foi gentilmente cedido pelo Dr. José Carlos Cogo, responsável pelo Serpentário do Centro de Estudos da Natureza (CEN). A extração da peçonha foi efetuada mensalmente com intervalo de pelo menos 15 dias depois da última alimentação. Após a extração, a peçonha foi liofilizada e mantida a 4º C. 3.5 Preparação do músculo biventer cervicis de Pintainho Após eutanásia dos pintainhos os músculos foram extraídos através de técnica cirúrgica e mantidos suspensos em 3 ml de solução de Krebs (composição, em mm: NaCl 118,6; KCl 4,69; CaCl 2 1,88; KH 2 PO 4 1,17; NaHCO 3 14,99 e glicose 11,65; ph 7,4) e

21 21 mantidos arejados a 37ºC. Concentrações de 40 e 80 µg/ml de peçonha foram adicionados ao banho para observação de seus efeitos no músculo durante 120 minutos. Os experimentos controle foram incubados apenas com solução de Krebs. 3.6 Estudo bioquímico: Dosagem de Creatina Quinase (CK) A quantificação da enzima CK liberada pela preparação biventer cervicis serve como indicador da ação miotóxica da peçonha sobre as fibras musculares. Durante os experimentos alíquotas de 0,2 ml do meio nutritivo foram retiradas do banho nos tempos 0, 15, 30, 60 e 120 minutos após a adição das diversas concentrações da peçonha. Para o grupo controle, amostras de 0,2 ml foram retiradas do banho nos tempos acima indicados, sem a adição da peçonha (completando-se, no entanto o volume da cuba com solução de Krebs). A atividade da CK foi dosada com o uso do kit comercial CK NAC da Laborlab S/A, conforme orientações do fabricante. 3.7 Técnica histológica- análise morfológica Após o tempo de incubação o músculo biventer cervicis de pintainho foi fixado em formaldeído 10% por um período de 24 a 48 horas e posteriormente submetido à realização da técnica histológica de rotina. A amostra foi lavada em água destilada antes de iniciar o processo de desidratação. Iniciou-se o processo de desidratação por álcool 70% por 1 hora, sendo posteriormente submetida a álcool 80%, 90%, 95%, 100% (2x) por 1 hora cada, em seguida banho no álcool+xilol por 30 minutos. Após a desidratação a preparação sofreu um processo de diafanização em um banho de xilol por 1 hora antes do banho com parafina (paraplast) em estado líquido (60º C) por 1 hora. Em seguida ocorreu a inclusão definitiva em parafina. Após, secções de 5 m foram obtidas em micrótomo, montadas em lâminas de microscópio e coradas com Hematoxilina e Eosina. Os cortes foram observados em microscópio Rm 2245 e fotografados com câmera acoplada.

22 Determinação do índice de mionecrose: análise quantitativa de fibras lesadas A determinação do índice de mionecrose foi realizada utilizando as lâminas confeccionadas por a técnica histológica descrita na seção anterior. O dano morfológico (índice de mionecrose) foi quantificado pela contagem do número total de células e expresso como porcentagem do número total de células em três áreas aleatórias de cada três cortes histológicos de um mesmo músculo. Para a contagem foram utilizadas 10 lâminas de cada tratamento. O índice foi determinado utilizando a fórmula abaixo: Índice de mionecrose = (Nº total de células lesadas / Nº total de células) x 100. Foram consideradas lesadas as células que apresentaram alterações como: células edemaciadas, lesões do tipo delta, degeneração de miofibrilas, mionecrose caracterizada por vacúolos e rompimento da membrana celular caracterizado por extravasamento de material citoplasmático. 3.9 Análise estátistica Os resultados foram expressos como média erro padrão da média (E.P.M.). A significância da diferença entre os grupos controle e tratados com peçonha ou fração foi determinada com o teste t-student, ou por ANOVA seguida pelo teste Tukey-Kramer de comparações múltiplas. Foram considerados estatisticamente significativos valores com p<0,05.

23 23 4 RESULTADOS 4.1 Estudo bioquímico: liberação de Creatina Quinase (CK) A liberação de CK no líquido do banho mostrou-se crescente durante 120 minutos de incubação, tanto para as doses de 40 µg/ml como para as doses de 80 µg/ml de peçonha de B. fonsecai. Porém, apenas a dose de 80 µg/ml mostrou valores estatisticamente significativos em relação ao controle. Os resultados revelaram uma dose-tempodependência na liberação de CK, o que pode ser mais bem visualizado no Gráfico 1. Concentração de CK UI/L * * * * Tempo (min) Controle (n=2) 40 g B. fonsecai (n=2) 80 g B. fonsecai (n=2) Gráfico 1: Curva de liberação de Creatina Quinase (CK) pela ação da peçonha de B. fonsecai em preparação de biventer cervicis de pintainho. O gráfico representa a liberação de CK no banho durante 120 minutos, mostrando-se dose-tempo-dependente para todas as doses, porém, estatisticamente significativa apenas para a dose de 80 µg/ml. Cada ponto representa a média ± o erro padrão da média (* p <0,05).

24 Índice de mionecrose Os músculos do grupo controle incubados com solução de Krebs durante 120 minutos, apresentaram poucas lesões (5,60 ± 1,68%). Já os músculos incubados com 40 µg/ml de B. fonsecai revelaram 54,90 ± 2,87% de fibras musculares lesadas, e os músculos incubados com 80 µg/ml de peçonha de B. fonsecai apresentaram 88,70 ± 2,19% de fibras musculares lesadas. Ambos os resultados estão representados na Tabela I e no Gráfico 1. Tabela I: Índice de mionecrose do músculo biventer cervicis de pintainho durante 120 minutos. Dose de B. fonsecai 120 minutos µg/ml Controle n=(10) 5,60 ± 1,68* 40 µg/ml B.fonsecai n=(10) 54,90 ± 2,87 * 80 µg/ml B.fonsecai n=(10) 88,70 ± 2,19* Nota: Os valores correspondem à média ± e o erro padrão da média. *p < 0,05.

25 25 Fibras musculares lesadas (%) * * Controle 40 g B.fonsecai 80 g B. fonsecai Gráfico 2: Determinação do índice de mionecrose em músculo biventer cervicis de pintainho, após 120 minutos com as doses estudadas. Os dados representam a média ± e erro padrão da média. p* <0, Análise morfológica Os músculos do grupo controle apresentaram poucas lesões, que foram provenientes da morte celular natural. As fibras musculares mostraram-se íntegras, com aspecto normal, estando agrupadas em feixes musculares, com núcleos dispostos na periferia e com arranjo poligonal das células (Figura 2). As preparações incubadas com 40 e 80 µg/ml durante 120 minutos apresentaram diferentes estágios do processo mionecrótico, como desintegração de miofibrilas, células edemaciadas, células mionecróticas e lesões do tipo delta, além de apresentarem células amorfas com perda total do arranjo poligonal (Figuras 3 e 4).

26 Figura 2. Corte transversal do músculo biventer cervicis, após 120 minutos em solução de Krebs. A) Corte transversalb:nota-se a presença de núcleos periféricos, arranjo poligonal das células e fibras musculares íntegras. B) Corte longitudinal: fibras musculares com aspecto normal, agrupadas, com membrana íntegra e núcleos bem dispostos (setas). Coloração: H.E. 26

27 Figura 3. Morfologia do músculo biventer cervicis após 120 minutos de incubação com 40 µg/ml de peçonha de B.fonsecai. A) Corte transversal: observam-se células com mionecrose (setas), células edemaciadas (e) e áreas com degeneração (*). B) Corte longitudinal: observam-se fibras rompidas (R), hipercontraídas (h) e fibras completamente desagregadas. Coloração: H.E. 27

28 Figura 4. Morfologia do músculo biventer cervicis, após 120 minutos de incubação com 80 µg/ml de peçonha de B. fonsecai. A): Corte transversal: observam-se células com intensa mionecrose (setas), lesões do tipo delta (D), células edemaciadas (e), células com vacúolo (V), rompimento de membrana (r) e total perda do aspecto poligonal das células. B): Corte longitudinal: observam-se fibras rompidas (R), presença de infiltrado infamatório (i) e hipercontração de miofibrilas. 28

29 29 5. DISCUSSÃO Os resultados obtidos demonstram que a peçonha de Bothrops fonsecai causa danos morfológicos as fibras musculares. No presente trabalho a miotoxicidade causada pela peçonha de B. fonsecai foi avaliada pela análise histológica usando a preparação do músculo biventer cervicis de pintainho. As análises histológicas apresentaram as características clássicas da miotoxicidade induzida pela peçonha de serpentes do gênero Bothrops, como a presença de lesões delta (MOKRI, ENGEL, 1975), células edemaciadas e a presença de infiltrado inflamatório; efeitos estes que estão de acordo com a literatura sobre o efeito da peçonha de serpentes do gênero Bothrops em células musculares (GUTIÉRREZ ; LOMONTE, 1989; COGO et al., 1993; CRUZ- HOFLING et al; 1990a, 1993), bem como vacuolização, áreas com degeneração, regiões com hipercontração e condensação das miofibrilas. Danos morfológicos semelhantes formam observados em estudos realizados utilizando o veneno de Bothrops leucurus em músculo de aves (PRIANTE et al., 2003), Bothrops insularis (COGO et al., 1993), Bothrops asper em músculo esquelético de rato (GUTIÉRREZ et al., 1980), Bothrops jararacussu em músculo tibial anterior de ratos (QUEIROZ et al., 1983), Bothrops alcatraz em aves (MORAES, D.S, 2001) e um estudo realizado por ZAMUNER, S.R et al., (2004) com veneno de Bothrops jararacussu, Bothrops moojeni, Bothrops erythromelas e Bothrops newuied mostraram que todos eles causam alterações mionecróticas nas fibras musculares. A quantidade de fibras lesadas com 80µg/mL de peçonha de B.fonsecai, foi semelhante ao encontrado em um estudo realizado por MOURA (2004) com músculo diafragma de camundongo, que revelou que após 120 minutos de incubação com a Bothropstoxina I na dose de 1,4 µm, principal componente da peçonha de Bothrops jararacussu ocorreram 82 ± 3,1 % de fibras lesadas. Muitos estudos têm sido realizados a fim de entender o complexo mecanismo que leva a necrose causada por picadas de serpente. Sabe-se que a necrose não é causada apenas por um fator, mas por a ação de fatores específicos e/ou da combinação de reações secundárias, não específicas nos tecidos afetados (OWNBY et al.; 1982, 1990). De acordo com a literatura a mionecrose é causada por miotoxinas com características de fosfolipases A 2 e atuam diretamente sobre a membrana da célula muscular, por se ligarem e alterarem a membrana plasmática (GUTIÉRREZ ; CERDAS, 1984), induzindo assim o dano tecidual

30 30 proeminente, de forma que as alterações morfológicas são observadas a partir de 15 minutos de exposição à peçonha (GUTIÉRREZ ; LOMONTE, 1995). Há uma ausência de estudos quanto aos componentes da peçonha de B. fonsecai, portanto é necessária a realização de pesquisas para que se possam afirmar quais são os fatores que promovem a lesão. Porém, estudos realizados com o gênero Bothrops indicam que as alterações morfológicas além de serem causadas por miotoxinas (GUTIÉRREZ; CERDAS, 1984), podem ainda, ser consequência da isquemia dos vasos da microcirculação e de artérias intramusculares (GUTIÉRREZ; CERDAS, 1984; QUEIROZ; PETTA, 1984). Acredita-se que por afetarem drasticamente a microvasculatura, essas toxinas impedem a irrigação adequada de sangue, necessária para o processo de regeneração (GUTIÉRREZ; RUCAVADO, 2000). A mionecrose dos miofilamentos pode ser atribuída as miotoxinas com atividade fosfolipásica A 2 (PLA 2 ). As fosfolipases A 2 (PLA 2 ) hidrolisam fosfolipídios de membrana na posição sn2 liberando lisofosfolipídios e ácidos graxos. O ácido graxo é chamado de ácido araquidônico que uma vez liberado da posição sn2 dos fosfolipídios de membrana pela ação da PLA 2 pode ser metabolizado tanto pela lipooxigenase como por uma das isoformas da ciclooxigenase formando leucotrienos e prostaglandinas respectivamente (DENNIS, 2000). O mecanismo proposto para explicar essas alterações tem sido o de que haveria hidrólise dos fosfolipídios de membrana devido à atividade enzimática, ruptura do sarcolema e perda da habilidade da célula em regular o fluxo de cálcio extracelular (HARRIS; MACDONELL, 1981; GUTIÉRREZ et al., 1984). A técnica de determinação dos níveis de CK tem sido utilizada em estudos para avaliação da miotoxicidade (MELO; SUAREZ KURTZ, 1988; OSHIMA FRANCO et al., 1999, 2000). O aumento nos níveis de CK indica lesão na membrana celular devido aos componentes que estão presentes nas peçonhas botrópicas que levam ao rompimento da membrana. A enzima Creatina Quinase está presente nos filamentos de miosina e transfere grupos fosfatos da fosfocreatina ao ADP, transformando-o em ATP (reação de Lohmanm), que será utilizado pela célula como fonte imediata de energia para a contração muscular. A Creatina Quinase está presente essencialmente no citoplasma, e seu aparecimento no líquido nutritivo pode indicar alterações na permeabilidade da membrana e lesões celulares (SUAREZ KURTZ, 1983).

31 31 Como um marcador bioquímico quantitativo do dano do músculo esquelético, a liberação de CK promoveu um parâmetro adicional para confirmar os resultados histológicos. A peçonha de B. fonsecai apresentou atividade miotóxica dose-tempo-dependente referente à liberação de CK, semelhante à de Bothrops leucurus (PRIANTI et al., 2003) em músculo de ave; Bothrops asper em ratos (RUCAVADO et al.,2000) e Bothrops jararacussu (CALIL HELIAS et al., 2002). Os resultados demonstram que a liberação foi mais efetiva na dose mais alta utilizada (80 µg/ml de B. fonsecai). Valores elevados logo no início do período de incubação indicam que a peçonha já estaria agindo e promovendo a lesão da membrana das células musculares e/ou um aumento da permeabilidade das mesmas. O fato de a análise histológica ter evidenciado lesões celulares significativas na dose de 40 µg/ml e a liberação de CK não ter sido significativa, indicam que a liberação foi baixa e a técnica empregada para a análise de CK não conseguiu diferenciar os níveis de CK liberados.

32 32 6 CONCLUSÕES: Os resultados obtidos neste trabalho nos permitem afirmar que a peçonha de B.fonsecai apresenta aspectos do dano morfológico semelhantes à de outras serpentes botrópicas, em relação à presença de miotoxinas, componentes característicos das peçonhas desse gênero. O presente trabalhou, levou a conclusão que a peçonha de B. fonsecai promove: (1) Aumento dose-dependente referente à quantidade de fibras musculares lesadas; (2) Alterações morfológicas nas células musculares; (3) Liberação de Creatina Quinase evidenciando as lesões por ação de miotoxinas;

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