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1 UNIVERSIDADE PAULISTA - UNIP PROGRAMA DE MESTRADO EM PATOLOGIA AMBIENTAL E EXPERIMENTAL Modulação da resposta inflamatória por preparações homeopáticas de Timulina e Antimonium crudum na leishmaniose experimental murina Dissertação apresentada ao programa de Pós-graduação em Patologia Ambiental e Experimental da Universidade Paulista UNIP para obtenção do título de mestre em Patologia Ambiental e Experimental. FABIANA RODRIGUES DE SANTANA SÃO PAULO 2013

2 UNIVERSIDADE PAULISTA - UNIP PROGRAMA DE MESTRADO EM PATOLOGIA AMBIENTAL E EXPERIMENTAL Modulação da resposta inflamatória por preparações homeopáticas de Timulina e Antimonium crudum na leishmaniose experimental murina Dissertação apresentada ao programa de Pós-graduação em Patologia Ambiental e Experimental da Universidade Paulista UNIP para obtenção do título de mestre em Patologia Ambiental e Experimental, sob orientação da Profa. Dra. Leoni Villano Bonamin FABIANA RODRIGUES DE SANTANA SÃO PAULO 2013

3 Santana, Fabiana Rodrigues de. Modulação da resposta inflamatória por preparações homeopática de Timulina e Antimonium crudum na leishmaniose experimental murina / Fabiana Rodrigues de Santana f. : il. color. + CD-ROM. Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Patologia Ambiental e Experimental da Universidade Paulista, São Paulo, Área de Concentração: Patologia Experimental. Orientadora: Profª. Dra. Leoni Villano Bonamin. 1. Leishmania (L) amazonensis. 2. Timulina. 3. Antimonium crudum. 4. Homeopatia. 5. Modelo experimental. I. Título. II. Bonamin, Leoni (orientadora).

4 FABIANA RODRIGUES DE SANTANA Modulação da resposta inflamatória por preparações homeopáticas de Timulina e Antimonium crudum na leishmaniose experimental murina Dissertação apresentada ao programa de Pós-graduação em Patologia Ambiental e Experimental da Universidade Paulista UNIP para obtenção do título de mestre em Patologia Ambiental e Experimental. Aprovada em: BANCA EXAMINADORA / / / Professora Dra. Leoni Villano Bonamin / / / Professora Dra. Cidéli Coelho / / / Professora Dra. Anete Lallo

5 DEDICATÓRIA À minha família, pela dedicação excepcional e apoio em todos os momentos. Aos meus pais, Esperança e João, e à minha irmã Carla, a minha base. À minha tia Lourdes e à minha prima Priscila, pelo auxílio em tudo.

6 AGRADECIMENTOS À minha orientadora, Prof. Dra. Leoni Villano Bonamin, pela oportunidade e ricos ensinamentos como profissional e ser humano. À Prof. Dra. Elisabeth Cristina Perez Hurtado, pelo aprendizado e dedicação com as técnicas de citometria de fluxo no Laboratório de Imunologia da Unifesp. À Prof. Dra. Márcia Dalastra Laurenti, pela oportunidade de estágio no Laboratório de Patologia de Moléstias Infecciosas (LIM-50) do Departamento de Patologia da FMUSP, contribuindo com seu amplo conhecimento na área de leishmanioses. À Universidade Paulista, por colocar à disposição o laboratório e apoio financeiro fornecido pela CAPES-PROSPUP em todo o período do mestrado, além de apoio financeiro da Fapesp. Aos funcionários do laboratório de Biologia Molecular da UNIP, pelo incondicional apoio e amizade: Ph. D. Fabiana Toshie de Camargo Konno, Suzana Bezerra e Cleide Santana. Aos funcionários do biotério, Wilton Pereira dos Santos, Michelle Sanchez e Claudemir Duran. Além dos funcionários de limpeza e portaria, especialmente à Marlene Maria de Jesus. Aos colegas do curso de mestrado: Renata Iovine, Tatiana Paixão, Ana Lúcia Aldrovandi, Maria Flávia Guerra e Andreza Santos. À Cidéli Coelho, pela colaboração neste projeto. Enfim, a todos os que auxiliaram de alguma maneira o meu aprendizado profissional e pessoal.

7 RESUMO A leishmaniose é uma zoonose causada por protozoários intracelulares do sistema fagocítico mononuclear. A modulação da atividade dessas células pode impactar a relação hospedeiro/parasita e o prognóstico da doença. O presente trabalho avaliou a atividade dos medicamentos homeopáticos Timulina 5 ch e Antimonium crudum 30 ch na infecção experimental por Leishmania (L.) amazonensis. Camundongos Balb/c, machos, foram inoculados com 2x10 6 promastigotas de Leishmania (L.) amazonensis no coxim plantar e, após 60 dias, foi feita a análise de citometria de fluxo das células do lavado peritoneal e do baço, além da colheita da pata com lesão, do linfonodo local e do baço, para análise histológica. Camundongos tratados com Timulina 5 ch apresentaram aumento de células B-1 no peritôneo e baço (X 2, p=0.0001). Além disso, observando-se as lesões plantares coradas pelo método Giemsa, a quantidade de formas amastigotas diminuiu nos animais tratados com Timulina 5 ch. No grupo tratado com Antimonium crudum 30 ch houve redução da resposta inflamatória local, evidenciada histologicamente, sem alteração no número de parasitas na lesão. A imuno-histoquímica seguida de histometria do coxim plantar evidenciou redução de células CD3+, C45RA+ e CD11b+ nesses animais. Portanto, os medicamentos homeopáticos Timulina 5 ch e Antimonium crudum 30 ch alteram o perfil de células inflamatórias envolvidas na resposta cutânea à Leishmania sp., interferindo na relação hospedeiro/parasita por mecanismos distintos, ora modulando a resposta imune, ora reduzindo a inflamação local e os sintomas da doença. Palavras-chave: Leishmania (L.) amazonensis, Timulina, Antimonium crudum, homeopatia, modelo experimental.

8 ABSTRACT Leishmaniasis is a zoonosis caused by an intracellular protozoan that invades the mononuclear phagocytic system, modulating the activity of these cells, causing impact in the host/parasite relation and in disease prognosis. This study evaluated the activity of homeopathic medicines Thymulin 5 ch and Antimonium crudum 30 ch on Leishmania (L.) amazonensis experimental infection. Balb/c mice were inoculated with 2x10 6 promastigotes of Leishmania (L.) amazonensis in the footpad and after 60 days. A flow cytometric analysis of peritoneal fluid and spleen was made. The footpad with injury, the local lymph node and the spleen were harvested for histological analysis. Thymulin 5 ch-treated mice showed increased B-1 cells in the peritoneum and spleen (X 2, p=0.0001). Furthermore, observing the plantar lesions stained with Giemsa, the number of amastigotes in treated animals decreased after Thymulin 5 ch treatment. The treatment with Antimonium crudum 30 ch reduced local inflammatory response, as evidenced histologically, and no change in the parasite number of local lesion. Immunohistochemistry followed by histometry the footpad showed reduction of CD3+, C45RA+ and CD11b+ these animals. Therefore, homeopathic Thymulin 5 ch and Antimonium crudum 30 ch alter the inflammatory cells profile involved in the cutaneous response to Leishmania sp., modulating the host/parasite relation by different mechanisms, either by increasing the immune response against the parasite, or reducing local inflammation and disease symptoms. Keywords: Leishmania (L.) amazonensis, Thymulin, Antimonium crudum, homeopathy, experimental model.

9 LISTA DE QUADROS Quadro 1 - Marcadores utilizados na imuno-histoquímica Quadro 2 - Fotomicrografias representando cortes histológicos de patas coradas com hematoxilina/eosina em camundongos, após 60 dias de inoculação com Leishmania (L.) amazonensis. Objetiva de 10X Quadro 3 - Fotomicrografias evidenciando macrófagos com citoplasma vacuolizado marcados com anti-cd11b, após 60 dias de inoculação de Leishmania (L.) amazonensis. Objetiva 10X

10 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Gráfico de dispersão obtido pelo programa flow-jo para demonstração dos diferentes gates e suas populações, a partir dos procedimentos de citometria de fluxo. Na figura 1A tem-se a população celular do peritônio, e na figura 1B a população celular do baço, definida em dois gates distintos denominados linfócitos e linfócitos ativados. Essas populações foram analisadas 60 dias após a infecção experimental com Leishmania (L.) amazonensis Figura 2 - Aspecto ulcerado de lesão em pata de camundongo, após 60 dias de inoculação com Leishmania (L.) amazonensis do animal tratado com Antimonium crudum 30 ch Figura 3 - Diâmetro da pata (mm) utilizando micrômetro digital (Mitutoyo ), mensurado a cada 10 dias, após a inoculação com Leishmania (L.) amazonensis, no período total de 60 dias Figura 4 - Gráfico representando as populações celulares do baço, avaliadas por citometria de fluxo, comparando células B-1 e B-2 após 60 dias de inoculação dos camundongos com Leishmania (L.) amazonensis Figura 5 - Gráfico representando as populações celulares do baço avaliadas por citometria de fluxo, comparando células B e fagócitos após 60 dias de inoculação dos camundongos com Leishmania (L.) amazonensis Figura 6 - Gráfico representando as populações celulares do baço, no gate linfócitos ativados, avaliadas por citometria de fluxo, comparando células B e fagócitos após 60 dias de inoculação dos camundongos com Leishmania (L.) amazonensis Figura 7 - Gráfico representando as populações celulares do baço avaliadas por citometria de fluxo, comparando células B e T após 60 dias de inoculação dos camundongos com Leishmania (L.) amazonensis Figura 8 - Gráfico representando as populações celulares do baço no gate de linfócitos ativados avaliadas por citometria de fluxo, comparando células B e T após 60 dias de inoculação dos camundongos com Leishmania (L.) amazonensis Figura 9 - Gráfico apresentando as populações de linfócitos CD4+ e CD8+ do baço, avaliadas por citometria de fluxo, 60 dias após a inoculação com Leishmania (L.) amazonensis em camundongos Figura 10 - Gráfico representando as populações celulares do peritônio, avaliadas por citometria de fluxo, comparando células B-1 e B-2, após 60 dias de inoculação dos camundongos com Leishmania (L.) amazonensis Figura 11 - Gráfico representando as populações celulares do peritônio, avaliadas por citometria de fluxo, comparando células B-1a e B-1b após 60 dias de inoculação dos camundongos com Leishmania (L.) amazonensis Figura 12 - Gráfico representando as populações celulares do peritônio, avaliadas por citometria de fluxo, comparando células B e fagócitos após 60 dias de inoculação dos camundongos com Leishmania (L.) amazonensis Figura 13 - Gráfico apresentando as populações de linfócitos T e B de peritônio, 60 dias após a inoculação com Leishmania (L.) amazonensis em camundongos

11 Figura 14 - Gráfico apresentando as populações de linfócitos T CD4+ e CD8+ de peritônio, 60 dias após a inoculação com Leishmania (L.) amazonensis em camundongos Figura 15 - (A) Formas amastigotas de Leishmania (L.) amazonensis na lesão experimental coradas pelo método de Giemsa (seta), após 60 dias da inoculação, de camundongo tratado com Timulina 5 ch. Objetiva 100X. (B) Número de formas amastigotas por campo, analisadas pelo software Image J Figura 16 - (A) Formas amastigotas de Leishmania (L.) amazonensis no tecido adiposo adjacente a linfonodo poplíteo, de animal do grupo controle, coradas pelo método de Giemsa (seta), após 60 dias da inoculação. Objetiva 100X. (B) Número de formas amastigotas por campo, analisadas pelo software Image J Figura 17 - (A) Baço e seus folículos (polpa branca) foram delimitados após 60 dias de inoculação com Leishmania (L.) amazonensi, esta foto representa um dos animais do grupo tratado com Antimonium crudum 30 ch. Na figura B verifica-se o folículo no linfonodo, dividido conforme suas regiões, de um animal do grupo tratado com Timulina 5 ch: CG=Centro Germinativo, ZM=Zona do Manto e PR=Paracortical do grupo tratado com Timulina 5 ch Figura 18 - Imuno-histoquímica para CD3 (linfócitos T) (A), contagem de linfócitos T positivos por campo (B), na pata de camundongos após 60 dias de inoculação com Leishmania (L.) amazonensis. Objetiva 10X. Na figura A pata de animal do grupo controle. 42 Figura 19 - Imuno-histoquímica para CD45RA (linfócitos B) (A), contagem de linfócitos B positivos por campo (B), na pata de camundongos após 60 dias de inoculação com Leishmania (L.) amazonensis. Objetiva 10X. Em A pata de animal do grupo tratado com Timulina 5 ch

12 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Contagem de subtipos celulares presentes no baço e peritônio de camundongos provenientes de diferentes grupos experimentais. Os subtipos celulares foram caracterizados fenotipicamente por citometria de fluxo, cujos valores foram compensados para eventos do total. C=Controle, T=Timulina 5 ch, A=Antimonium crudum 30 ch, VR: valores de referência obtidos a partir de um pool de amostras provenientes de três camundongos não tratados (controle negativo). Valores expressos como média e desvio padrão Tabela 2 - Valores referentes à média e desvio padrão (SD) de células positivas por campo (pata) e escore (linfonodo e baço) (n=10 por grupo). C=Controle, T=Timulina 5 ch e A=Antimonium crudum 30 ch, VR= valores de referência de total de células positivas por campo (pata) e escore (linfonodo e baço) (n=3 por grupo) de camundongos não tratados (controle negativo +PBS). Os traçados indicam que a análise correspondente não foi possível

13 SUMÁRIO INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA ARTIGO INTRODUÇÃO MATERIAIS E MÉTODOS Animais Preparação dos medicamentos Tratamento Inoculação de Leishmania (L.) amazonensis e observação das lesões Histopatológico Imuno-histoquímica Histometria Citometria de fluxo Bioética e conflito de interesses RESULTADOS Macroscopia Citometria Histometria e imuno-histoquímica DISCUSSÃO E CONCLUSÃO REFERÊNCIAS ANEXO... 58

14 INTRODUÇÃO 12

15 13 INTRODUÇÃO A leishmaniose é uma zoonose presente em diversos países. As áreas endêmicas são divididas em Velho Mundo, que compreende África, Ásia e Europa, e Novo Mundo, pertencente às Américas (GENARO, 2005). Neste trabalho usou-se um modelo experimental de Leishmania sp. frente a tratamento homeopático com enfoque na resposta imunológica e efeitos clínicos, sugerindo alternativas para o tratamento da doença. A leishmaniose no Brasil é um sério problema de saúde pública, em decorrência da polêmica sobre a eutanásia de animais soropositivos e o tratamento não autorizado com medicamentos convencionais preconizados pelos órgãos federais, como Ministério da Saúde e Conselho Federal de Medicina Veterinária. Além do mais, a terapêutica convencional de leishmaniose, principalmente com o uso do Antimonial Pentavalente (Glucantime ), apresenta resistência na cura das lesões, como em pacientes acometidos com leishmaniose cutânea difusa por Leishmania (L.) amazonensis. Esses pacientes desenvolvem resposta imunológica anérgica, não apresentando melhora clínica (GENARO et al., 2005; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007; SILVEIRA et al., 2009; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2012). Cresce o uso de tratamentos de medicina complementar que auxiliam de maneira adicional o paciente em diferentes enfermidades. Uma dessas opções é a homeopatia, preconizada por Hahnemann desde 1796 (ADLER et al., 1996; TEIXEIRA, 2006). Sua eficácia em diferentes situações clínicas e experimentais tem sido demonstrada ao longo dos últimos anos, com diversos trabalhos publicados na área da medicina, medicina veterinária e agricultura (PEREIRA et al., 2005; MERLINO et al., 2007; BONAMIN, 2008; RODRIGUES DE ALMEIDA, et al., 2008; KASSAB et al., 2009; SMIT et al., 2009; RETTAGLIATI et al., 2012; SATO et al. 2012). Em face de tais problemas e potenciais alternativas, o presente estudo analisou a influência dos medicamentos homeopáticos com relação à resposta imunológica, avaliando o recrutamento celular e as características das lesões histopatológicas na infecção experimental por leishmaniose murina.

16 1. REVISÃO DE LITERATURA 14

17 15 1. REVISÃO DE LITERATURA As leishmanioses são consideradas grande problema de saúde pública, sendo doenças inflamatórias crônicas da pele, das membranas mucosas ou das vísceras, causadas por protozoários do sistema fagocítico mononuclear (KUMAR et al, 2005, MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007). A classificação taxonômica, o parasito pertence ao gênero Leishmania, ordem Kinetoplastida, família Trypanossomatidae. Os hospedeiros vertebrados incluem grande variedade de mamíferos, sendo as infecções mais comuns nos roedores, canídeos e no homem. Como hospedeiros invertebrados, são identificadas exclusivamente fêmeas de insetos hematófagos conhecidos como flebotomíneos, ordem Diptera, família Psychodidae, subfamília Phlebotominae e gênero Lutzomyia (MICHALICK, 2005; GENARO et al., 2005). Na ocorrência de leishmaniose cutânea, Brasil, Colômbia, Peru, Bolívia e Nicarágua estão entre os 12 países do mundo que concentram 90% dos casos. Estima-se que ocorram cerca de 1,5 milhões de casos novos a cada ano (WHO, 2012). Ao analisar a evolução da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) no Brasil, observa-se sua expansão geográfica, sendo que no início da década de 80 foram registrados casos autóctones em 19 unidades federativas e, no ano de 2003, foi confirmada autoctonia em todas as unidades federativas do país. No período de 1991 a 2010, a LTA apresentou média anual de casos registrados e coeficiente de detecção médio de 16,4 casos por 100 mil habitantes (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2012). Uma das espécies causadoras da LTA é a Leishmania (L.) amazonensis, que apresenta duas formas clínicas denominadas leishmaniose cutânea e leishmaniose cutânea difusa. A leishmaniose cutânea caracteriza-se pela formação de úlceras únicas ou múltiplas confinadas na derme, com a epiderme ulcerada. Na leishmaniose cutânea difusa ocorre infecção confinada na derme, formando nódulos não ulcerados e disseminação (GENARO et al., 2005). Adicionalmente, há registros de felinos e cães domésticos como portadores (SOUZA et al., 2005; TOLEZANO et al., 2007). No contexto da resposta imune, a Leishmania (L.) amazonensis induz uma resposta imune inata e adquirida (PEREIRA et al., 2008). Em camundongos Balb/c com deficiência da atividade do sistema complemento, no local da inoculação, há diminuição da resposta

18 16 inflamatória e aumento de carga parasitária na fase aguda, evidenciando o papel do complemento no controle da propagação do parasita (LAURENTI et al., 2004). Em estudo in vitro, com co-culturas de macrófagos infectados com Leishmania (L.) amazonensis murina e neutrófilos, houve a destruição de formas amastigotas (CARMO et al., 2010). Em outro experimento com L (L.) amazonensis observou-se a participação de células B e anticorpos na infecção experimental. Comparando duas linhagens de camundongos, houve aumento na titulação de anticorpos mais evidente em camundongo Balb/c em relação ao C3H. Adicionalmente, a severidade da doença parasitária foi significativamente reduzida na ausência de células B em camundongo JhD, este apresentando lesões cutâneas menores (WANASEN et al., 2008). Na análise, avaliando os subtipos de células B, durante a infecção experimental por Leishmania major, os camundongos Balb/c demonstraram aumento significativo de populações de células B CD5+ e altos níveis de anticorpos naturais, sugerindo que as células B-1 seriam ativadas em animais parasitados (BABAI et al., 1999). Na leishmaniose cutânea há o desenvolvimento de nódulos seguidos por ulcerações no local da infecção. Experimentos relatam que camundongos imunodeficientes (SCID) demonstraram lesões cutâneas não ulceradas, sugerindo o envolvimento de linfócitos B e T durante a formação da ulceração (TERABE et al., 1999; TERABE et al., 2000). Em relação à suscetibilidade e resistência do hospedeiro, na estimulação CD4+ do tipo Th1 há produção de IL-2, IL-12, INF-γ e TNF-α para promover a ativação do macrófago e a eliminação do parasita. No caso de estimulação Th2, as citocinas envolvidas são IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, inibindo a ativação do macrófago e contribuindo para a sobrevivência do parasita (ABBAS et al., 2011). Contudo, a competência imunogênica se distingue nas diferentes espécies causadoras de Leishmaniose Tegumentar Americana, como Leishmania (L.) amazonensis e Leishmania (V.) braziliensis, apresentando características de perfil imunológico e sintomas clínicos em humanos diferentemente. Tem-se como exemplo a característica de hipossensibilidade de células T na infecção por Leishmania (L.) amazonensis em casos de leishmaniose cutânea difusa anérgica (SILVEIRA et al., 2009). Além disso, os linfócitos CD8+ possuem mecanismos efetores por INF- γ e perforina, contribuindo para uma resposta imune protetora contra os parasitas (COLMENARES et al., 2003; RUIZ et al., 2007; SANABRIA et al. 2007). A homeopatia é considerada alternativa eficiente e segura ao tratamento de doenças crônicas, aumentando a eficácia clínica quanto à qualidade de vida, diminuindo os custos e os

19 17 efeitos colaterais da terapêutica farmacológica convencional (TEIXEIRA, 2006). Os medicamentos homeopáticos são preparados em doses infinitesimais e dinamizados (ADLER et al., 1996), sendo aplicados para enfermidades parasitárias, virais, neoplásicas, psicocomportamentais, entre outras (ULLMAN, 2003; PEREIRA et al., 2005; PILKINGTON et al., 2005; SUNILA et al.; 2007; KASSAB et al., 2009; FERRAZ et al., 2011; SIQUEIRA et al., 2013). Como matéria-prima de produtos homeopáticos utilizam-se substâncias imunomoduladoras, visando à recuperação do equilíbrio do sistema imunológico, além de garantir a proteção do indivíduo contra vários agentes de diferentes origens (GARRITANO, 2007). Entre esses produtos, há a Timulina. A ação da Timulina no sistema imune é bem ampla, em várias espécies. Em aves, observam-se aumento da citotoxicidade de células Natural Killer (MERLINO et al., 2001) e da analgesia (KANAAN et al., 2002; SAFIEH- GARABEDIAN et al., 2002; DARDENNE et al., 2006). Além disso, quando em preparações homeopáticas na potência 5 ch, a Timulina melhora significativamente os índices zootécnicos, potencializando a resposta linfoide esplênica e reduzindo a incidência de artrite viral na semana pré-abate em frangos de corte (SATO et al., 2012). O princípio de semelhante cura semelhante é entendido como a intercorrelação entre os sintomas manifestados espontaneamente por um paciente e os sintomas provocados por uma substância de acordo com seus aspectos toxicológicos e patogenéticos (BONAMIN, 2008). Baseado nesse conceito da homeopatia, o Antimonium crudum ocasiona em indivíduo sadio fraqueza, erupções crostosas, espessas e duras na pele, onicogrifose, entre outros (DUJANY, 1995). Sendo essa sintomatologia descrita em portadores de Leishmania sp., assume-se que a aplicação do princípio de similitude seja estratégia possível para o tratamento da enfermidade. São poucos os estudos descritos na literatura sobre o tratamento de infecções parasitárias com homeopatia. Contudo, em estudos anteriores, o efeito de medicamentos homeopáticos em doenças parasitárias mostrou-se benéfico em camundongos com infecção com Trypanosoma cruzi. Nesse caso, o tratamento com Phosphorus gerou aumento no número de monócitos no 42º dia pós-infecção e ausência de mortes (RODRIGUES DE ALMEIDA et al., 2008). Em relato de caso, o uso do medicamento homeopático Zincum Iodatum utilizado em cão portador de Leishmania sp. resultou em melhora clínica (RETTAGLIATI et al., 2012).

20 18 O objetivo deste estudo é analisar os mecanismos imunomoduladores da Timulina 5 ch e do Antimonium crudum 30 ch na infecção experimental de camundongos Balb/c com Leishmania (L.) amazonensis, tendo como ferramentas marcadores celulares capazes de identificar linfócitos e os subtipos como célula B-1 e fagócitos.

21 2. ARTIGO 19

22 20 2. ARTIGO 2.1. INTRODUÇÃO As leishmanioses são consideradas grande problema de saúde pública, sendo doenças inflamatórias crônicas da pele, das membranas mucosas ou das vísceras, causadas por protozoários do sistema fagocítico mononuclear (KUMAR et al, 2005, MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007). Uma das espécies causadoras da doença cutânea é a Leishmania (L.) amazonensis. A leishmaniose cutânea caracteriza-se pela formação de úlceras únicas ou múltiplas confinadas na derme, com a epiderme ulcerada. Na leishmaniose cutânea difusa ocorre infecção confinada na derme, formando nódulos não ulcerados e disseminação (GENARO et al., 2005). Baseando-se no princípio da similitude, o Antimonium crudum ocasiona em paciente sadio fraqueza, erupções crostosas, espessas e duras na pele, onicogrifose, entre outros (DUJANY, 1995). Sendo essa sintomatologia descrita também em portadores de Leishmania sp., assume-se que a aplicação da homeopatia seja estratégia possível para o tratamento da enfermidade, embora sejam poucos os estudos descritos na literatura sobre o tratamento de infecções parasitárias com homeopatia. Em estudos anteriores, o efeito de medicamentos homeopáticos em doenças parasitárias mostrou-se benéfico clinicamente, tanto em camundongos portadores de infecção por Trypanosoma cruzi (RODRIGUES DE ALMEIDA et al., 2008) quanto em um cão tratado portador de Leishmania sp. tratado com Zincum Iodatum dinamizado (RETTAGLIATI et al., 2012). Outra possível abordagem homeopática para o tratamento da leishmaniose experimental murina é o uso de substâncias endógenas imunomoduladoras dinamizadas, como a timulina. Estudos anteriores demonstram que, quando em preparações homeopáticas na potência 5 ch, a timulina melhora significativamente os índices zootécnicos, potencializando a resposta linfoide esplênica e reduzindo a incidência de artrite viral na semana pré-abate em frangos de corte (SATO et al., 2012). Da mesma forma, a timulina 5cH também foi capaz de reduzir a infecção murina experimental com BCG, por modular a atividade de linfócitos e fagócitos (BONAMIN et al., 2013). A escolha de tais medicamentos como possíveis agentes imunorreguladores na infecção por Leishmania (L.) amazonensis tem como respaldo o fato desta induzir resposta

23 21 imune inata e adquirida (PEREIRA et al., 2008), em que se observa o papel do sistema complemento (LAURENTI et al., 2004), bem como de fagócitos (macrófagos e neutrófilos), na destruição de formas amastigotas (CARMO et al., 2010). Sabe-se que a severidade da doença parasitária é significativamente reduzida em camundongo JhD, este deficiente em células B e anticorpos, apresentam lesões cutâneas menores (WANASEN et al., 2008). Avaliando os subtipos de células B, durante a infecção experimental por Leishmania major, os camundongos Balb/c demonstraram aumento significativo de populações de células B CD5+ e altos níveis de anticorpos naturais, sugerindo que as células B-1 seriam ativadas em animais parasitados (BABAI et al., 1999). Na leishmaniose cutânea há o desenvolvimento de nódulos seguidos por ulcerações no local da infecção. Experimentos relatam que camundongos imuno-deficientes (SCID) demonstraram lesões cutâneas não ulceradas, sugerindo o envolvimento de linfócitos B e T durante a formação da ulceração (TERABE et al., 1999; TERABE et al., 2000). Por outro lado, a infecção por Leishmania (L.) amazonensis em casos de leishmaniose cutânea difusa anérgica é condicionada à deficiência de linfócitos T (SILVEIRA et al., 2009). Os linfócitos CD8+ possuem mecanismos efetores por INF- γ e perforina, contribuindo para uma resposta imune protetora contra os parasitas (COLMENARES et al., 2003; RUIZ et al., 2007; SANABRIA et al. 2007). O objetivo deste estudo, portanto, é analisar os mecanismos imunomoduladores da Timulina 5 ch e do Antimonium crudum 30 ch na infecção experimental de camundongos Balb/c com Leishmania (L.) amazonensis, tendo como ferramentas marcadores celulares capazes de identificar linfócitos e os respectivos subtipos, como células B-1 e fagócitos MATERIAIS E MÉTODOS Animais Foram utilizados camundongos de linhagem Balb/c, SPF (Specific pathogen free), machos e adultos, provenientes do Centro de Desenvolvimento para Modelos Experimentais Cedeme, da Unifesp, e mantidos em microisoladores (Techniplast ), no Biotério de Experimentação Animal - SPF do Centro de Pesquisa da UNIP, onde receberam água e ração esterilizados ad libtum, sendo mantidos em temperatura e iluminação controlados, com

24 22 temperatura fixada em 22±2 o C, e o período de luz em 12h, das 6h30 às 18h30. O ciclo de trocas de ar nas caixas foi fixado em 75 ciclos/hora Preparação dos medicamentos A Timulina 5 ch foi preparada a partir da solução estoque 4 ch (Boiron Brasil), a qual foi obtida de peptídeo sintético livre de zinco (serum thymic factor, peso molecular = 858,85), com pureza de 98.66%, segundo dados do fornecedor. O Antimonium crudum 30 ch foi preparado a partir de matriz adquirida de farmácia homeopática credenciada pela Anvisa, na potência 29 ch. A última diluição de ambos os medicamentos foi realizada no momento da administração em solução hidroalcoólica 30% e sucussionada mecanicamente com o auxílio de braço mecânico automatizado (Autic ). Os procedimentos de preparo e estocagem seguiram as normativas descritas na Farmacopeia Homeopática Brasileira (3ª edição). A solução controle foi feita utilizando apenas o veículo (solução hidro-alcoólica 30%), submetido aos mesmos procedimentos de diluição e sucussão, até a potência 5 ch. Para garantir que não houve contaminação com zinco no momento da administração da Timulina, amostras de Timulina 5 ch e do veículo foram encaminhadas a laboratório certificado (CBO Análises, Brasil) para mensuração da sua concentração. Não foram encontradas quantidades significativas de zinco em nenhuma das amostras Tratamento Os animais foram tratados diariamente com Timulina 5 ch (grupo B), Antimonium crudum 30 ch (grupo C) ou veículo (grupo A), via água de bebida, em cego, durante 60 dias; 0.1mL da preparação A, B ou C foi misturado diariamente a 250mL de água de bebida em garrafa estéril, de forma que a concentração teórica final de Timulina fosse 4x10-13 M. Para o procedimento em cego, os frascos contendo Timulina 5 ch, Antimonium crudum 30 ch e veículo foram identificados aleatoriamente com as letras A, B e C por um funcionário do laboratório não envolvido em nenhuma etapa do processo experimental. Os códigos foram revelados somente após a análise estatística.

25 Inoculação de Leishmania (L.) amazonensis e observação das lesões A inoculação na dose de 2x10 6 promastigotas de Leishmania (L.) amazonensis MHOM/BR/73/M2269 foi no coxim plantar esquerdo dos camundongos Balb/c, em volume de 50 microlitros de inóculo total. As cepas de Leishmania (L.) amazonensis foram fornecidas pela Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo - FMUSP. Os parasitas provinham de cultura mantidos em meio RPMI (10 ml), 25ºC, suplementados com 10% de soro fetal bovino, 1% de penicilina (100U/ml) e gentamicina (0.1mg/ml) Histopatológico Aos 60 dias após a inoculação, 10 animais de cada grupo foram eutanasiados em câmara de CO 2, necropsiados e fragmentos histológicos da lesão, do linfonodo poplíteo ipslateral e do baço foram colhidos e fixados em paraformaldeído 8%. Os fragmentos dos tecidos foram cortados com micrótomo, desparafinizados e corados pelo método Giemsa e pela imuno-histoquímica Imuno-histoquímica Para preparar os cortes histológicos para a imuno-histoquímica, todas as amostras de tecido subcutâneo de pata esquerda, local onde foram inoculadas formas prosmatigotas de Leishmania (L.) amazonensis, foram preparadas de forma a obter cortes de 5 microns de tecido incluído em parafina. Para remover a parafina, foram feitas duas lavagens de aproximadamente 2 minutos cada, com xilol absoluto, seguidas de duas passagens em álcool absoluto por 3minutos cada. Os cortes foram então lavados em água corrente. Para o desmascaramento antigênico por calor úmido foi utilizado tampão citrato próprio para essa finalidade (DAKO), preparado segundo as instruções do fornecedor. As lâminas foram incubadas em panela elétrica aquecida a 80ºC (PANASONIC) por 30 minutos, lavadas em PBS, ph = 7.2 (SIGMA), durante 5 minutos em agitação, secas com papel fino, e as amostras de tecido foram delimitadas com Pap-pen (AbCAM).

26 24 A atividade de peroxidase endógena foi bloqueada pela incubação das lâminas com H 2 O 2 5% em metanol, durante 15 minutos. Após nova lavagem com PBS, ph = 7.2 (SIGMA), os cortes histológicos foram incubados com soro heterólogo de equino (VECTOR) durante 20 minutos, para bloqueio dos sítios inespecíficos. Os tecidos foram imediatamente tratados com os anticorpos primários anti-igg de rato cujas diluições, feitas em diluente próprio para redução de fundo (DAKO), estão descritas no Quadro 1. Essa incubação foi realizada em 4 o C, durante toda noite, em câmara úmida. O controle negativo das reações foi feito pela substituição do anticorpo primário pelo diluente. No dia seguinte, os cortes foram lavados em PBS, ph = 7.2 (SIGMA) por 5 minutos e tratados por 30 minutos com anticorpo secundário (anti-igg de rato) conjugado a polímero (VECTOR). Após nova lavagem em PBS, ph = 7.2 (SIGMA) por 5 minutos, os cortes foram incubados com DAB (DAKO) por alguns segundos. As lâminas foram lavadas em água corrente, contracoradas com hematoxilina de Harris, lavadas novamente e montadas com lamínula e resina (VECTOR). As observações referentes à atribuição de escores para a análise dos cortes histopatológicos marcados com anti-cd3, CD45RA e CD11b por imuno-histoquímica foram feitas por dois observadores diferentes, a fim de evitar vieses de interpretação de positividade. Quadro 1 - Marcadores utilizados na imuno-histoquímica Marcador Célula Fabricante Alvo Clone Espécies de origem e alvo Diluição Anti-CD3 Linfócitos T Serotec CD 3 CD3-12 1:40 Anti-CD11b Fagócitos Serotec CD11b M1/70.15 Ratocamundongo Ratocamundongo 10% Anti-CD45RA Linfócitos B apenas Serotec LCA (proteína de superfície) RA3-6B2 Ratocamundongo 0,5%

27 Histometria A quantificação das células marcadas foi feita pela determinação do número de células positivas por campo microscópico, sendo avaliados 5 campos por corte. O grau de infecção de fagócitos corados pelo método Giemsa foi determinado por escores, sendo dois observadores diferentes, para evitar vieses de interpretação. A proporção entre parênquima e folículo, nos órgãos linfoides, foi determinada em pixels pelo software Image J. Por se tratar de célula majoritária, a quantificação dos fagócitos CD11b+ no baço e linfonodo foi feita por escores de zero a três. No coxim plantar, a incidência destas células foi avaliada de forma descritiva Citometria de fluxo Dos camundongos eutanasiados após 60 dias de inoculação houve a retirada de lavado peritoneal e a suspensão de células do baço. Assim, 5ml de PBS, ph = 7.2 (SIGMA), adicionados a 1% de soro fetal bovino foi injetado na cavidade peritoneal, seguido de leve massagem para permitir o desprendimento celular. O lavado peritoneal foi colhido usando pipeta Pasteur de plástico, sendo transferido para tubos plásticos de Falcon imersos em gelo. Cada tubo correspondeu ao lavado de dois animais (pool), sendo analisados três tubos por grupo (N=6). A cavidade peritoneal foi aberta e o baço retirado, sendo macerado em solução de PBS, ph = 7.2 (SIGMA) adicionado a 1% de soro fetal bovino para produzir uma suspensão celular homogênea, a qual foi igualmente transferida para tubos de Falcon imersos em gelo. Ambas as amostras (peritônio e baço) seguiram as mesmas etapas definidas a seguir. Com os tubos de Falcon imersos em gelo, os mesmos foram centrifugados em 2000 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi desprezado e as células foram ressuspendidas em tampão hemolítico (GIBCO ). Novamente essas células foram centrifugadas e suspensas em PBS (GIBCO ) a 4 o C. O número de células viáveis foi avaliado pelo Azul de Tripan e contado em câmara de Neubauer modificada (HAUSSER SCIENTIFIC). Após nova centrifugação (2000 rpm, 5 min.), as células foram suspendidas em 100µl de PBS adicionados a 10µl de anticorpo antimouse CD16/CD32 (INVITROGEN) 1:100, para bloqueio de Fcγ II e III, sendo incubadas a 4 o C por 30 minutos. Após nova lavagem das células em PBS, as amostras foram suspendidas em 200µl de 1% PBS/BSA e divididas igualmente em três microtubos, um sem anticorpos, outro contendo 1% anti-cd19 PE Cy5.5, anti-cd23 FITC, anti-cd5 PE e anti-cd11b PB (INVITROGEN) e um terceiro tubo contendo 1% anti-cd25

28 26 AF488, anti-cd4 PE, anti-cd19 PE Cy5.5 e anti-cd8 AF 405, sendo todos incubados por cerca de 40 minutos a 4 o C. A última centrifugação foi realizada e as células fixadas em 400µl de paraformaldeído 1% misturados em 100µl de PBS, sendo mantidas a 4 o C até o momento da leitura em citômetro, não mais que 48h depois do processamento. No momento da leitura, as amostras sofreram nova centrifugação, foram suspendidas em 1ml de PBS e transferidas para tubos FACS (BD). A leitura das amostras foi feita em citômetro FACS CANTO (BD) realizado no laboratório de Imunologia da Unifesp São Paulo. A análise dos dados foi feita utilizando o software Flow Jo Na análise dos dados, inicialmente o tamanho e a granulosidade das células foram selecionados para determinar as populações celulares de linfócitos. A fluorescência obtida pelos marcadores foi usada para estabelecer os gates de células positivas. As amostras de baço apresentaram duas populações distintas de linfócitos, sendo uma delas de linfócitos ativados. As amostras de lavado peritoneal apresentaram uma única população homogênea dessas células (Figura 1). As subpopulações foram determinadas no gate de linfócitos pela expressão ou não de CD19 PE Cy5.5 (INVITROGEN), sendo as células positivas caracterizadas como linfócitos B e as células negativas caracterizadas como linfócitos T. A partir da população de linfócitos B, aquelas tidas como duplo-positivas (CD19 PE Cy5.5 + e CD11b PB +) foram consideradas como células B-1, e aquelas positivas apenas para CD19 PE Cy5.5 foram consideradas como B-2. Para analisar as subpopulações de B-1, B-1a e B-1b, utilizou-se a expressão de CD5 como critério, sendo as positivas B-1a e as negativas B-1b. As células positivas apenas para CD11b foram consideradas como fagócitos. A partir da população de células T (CD19 PE Cy5.5 negativas), identificaram-se as subpopulações de células CD4+ e CD8+. A compensação de cada fluorocromo foi realizada pela marcação simples para cada anticorpo utilizado. A positividade e negatividade de cada marcador foram determinadas a partir da fluorescência natural das células não expostas aos anticorpos. A transposição de dados para análise estatística foi feita para os softwares EXCEL 2007, INSTAT 3.0 e PRISM 5.04.

29 27 A B Figura 1 - Gráfico de dispersão obtido pelo programa flow-jo para demonstração dos diferentes gates e suas populações, a partir dos procedimentos de citometria de fluxo. Na figura 1A tem-se a população celular do peritônio, e na figura 1B a população celular do baço, definida em dois gates distintos denominados linfócitos e linfócitos ativados. Essas populações foram analisadas 60 dias após a infecção experimental com Leishmania (L.) amazonensis Bioética e conflito de interesses Este projeto foi autorizado pelo Comitê de Ética de Pesquisa da Universidade Paulista - UNIP, conforme legislação vigente de proteção aos animais, com o protocolo nº 026/11 CEP/ICS/UNIP. Não há conflitos de interesses relacionados a este trabalho de pesquisa.

30 RESULTADOS Macroscopia A evolução macroscópica da lesão foi feita pela medida da espessura da pata, utilizando um micrômetro digital (Mitutoyo ). As medidas foram feitas antes da inoculação e a cada 10 dias, durante 60 dias. Nesse período, os coxins já apresentavam sinais de necrose (Figura 2). Figura 2 - Aspecto ulcerado de lesão em pata de camundongo, após 60 dias de inoculação com Leishmania (L.) amazonensis do animal tratado com Antimonium crudum 30 ch Os animais do grupo tratado com Antimonium crudum 30 ch apresentaram aumento na espessura da pata 60 dias após a inoculação do parasita (Figura 3). Dado que a análise histológica revelou redução no número de células e maior dispersão das estruturas, atribui-se esse efeito à evolução da lesão para edema tardio (Quadro 2).

31 29 Figura 3 - Diâmetro da pata (mm) utilizando micrômetro digital (Mitutoyo ), mensurado a cada 10 dias, após a inoculação com Leishmania (L.) amazonensis, no período total de 60 dias Citometria Análise das células do baço As análises celulares do baço foram definidas em 2 gates, como demonstrado na Figura 1B. Os gráficos do gate de linfócitos e linfócitos ativados foram ainda divididos nas populações celulares de linfócitos B (CD19+), linfócitos T (CD19-) e fagócitos (CD11b+). Apenas traços de células B-1b (CD5-) foram identificados, o que impossibilitou a análise estatística. As amostras para a análise de citometria foram provenientes de um pool de 2 animais, essas amostras foram adicionadas em um tubo de Falcon identificados de acordo com o grupo, controle, Timulina 5 ch e Antimonium crudum 30 ch, respectivamente. Um resumo dessa análise por fluxo de citometria foi demonstrado na tabela 1. A análise do número médio de células e sua comparação entre os grupos (ANOVA) não demonstraram significância estatística; contudo, os desvios de proporções entre subtipos

32 30 celulares mostraram haver predomínio de linfócitos B-1 em ambos os grupos experimentais em relação ao controle (Figuras 4 a 9). Comparando-se as populações celulares de B-1 e B-2 houve aumento de B-1 nos grupos tratados com Timulina 5 ch e Antimonium crudum 30 ch em relação ao controle (Figura 4); contudo, essa diferença não foi observada no gate de linfócitos ativados. Por outro lado, os animais tratados com Timulina 5 ch apresentaram aumento da população de fagócitos (CD11b + / CD19 -) em relação à população de linfócitos B (CD11b- / CD19+) (Figuras 5 e 6). A análise das populações de linfóficos T e B e suas proporções nos diferentes grupos mostrou aumento na proporção de linfócitos B em relação aos linfócitos T nos animais tratados com Antimonium crudum 30 ch, nos dos dois gates (linfócitos e linfócitos ativados). Nos animais tratados com Timulina 5 ch esse aumento foi significativo apenas na população de linfócitos ativados (Figuras 7 e 8, respectivamente). A comparação das proporções entre células T CD4+ e CD8+ mostrou desvio para CD8+ nos animais tratados com Timulina 5 ch (Figura 9).

33 31 Tabela 1 - Contagem de subtipos celulares presentes no baço e peritônio de camundongos provenientes de diferentes grupos experimentais. Os subtipos celulares foram caracterizados fenotipicamente por citometria de fluxo, cujos valores foram compensados para eventos do total. C=Controle, T=Timulina 5 ch, A=Antimonium crudum 30 ch, VR: valores de referência obtidos a partir de um pool de amostras provenientes de três camundongos não tratados (controle negativo). Valores expressos como média e desvio padrão. ANOVA. Baço Gate Linfócitos Baço Gate Linfócitos ativados Peritônio Célula C T A C T A VR C T A VR B total Média 2707,6 2466,5 2399, ,5 6254,5 4592,3 5366,3 4497,5 SD 910,2 520,3 335,2 719,6 1357,4 900,3 101,1 638,1 1576,1 853,6 50,2 B-1 Média SD 41,6 28,6 117,5 76,9 88,7 112, ,5 67,2 48,8 35,5 32, ,3 1703,7 1316, ,9 1686,3 1021, ,5 B-1a Média SD 11,6 18, ,5 44,5 62,8 14, ,2 26, ,6 16 0, ,6 229,6 224, , ,5 B-1b Média SD traços traços Traços traços traços traços 19 9, ,7 1014,6 698, , ,1 B-2 Média SD 1008,3 427,6 948,5 183,6 1013,5 312,7 2105,6 722,9 2452,7 1399,5 2374,2 870, ,2 2364,2 458, ,8 1948,3 757,5 2109,5 163,34 T total Média SD ,7 934,6 362, , , , ,5 6734,5 509, ,1 1283,3 832, , ,7 CD4+ Média SD ,4 499,3 151,9 446,7 81,9 446,6 198,1 585,3 284,8 611,2 149,6 1075,5 338,7 821,5 163,5 387,3 147,5 400,3 150,2 201,5 14,8 CD8+ Média SD ,5 404,6 215,5 275,2 75, ,9 229,3 151,6 231,2 91,8 433,5 111, ,3 76, ,3 44,1 107,5 13,4 Fagócitos Média SD ,3 555,2 356,7 569,6 558,7 1198,2 880,1 703,2 685, ,7 579,7 573,3 404,3 297, ,6 453,5 473,7

34 32 Cont (baço) Thym (baço) A crud (baço) 4% 11% 8% B1 B1 B1 B2 B2 B2 96% 89% 92% X2, p= rel cont X2, p= Figura 4 - Gráfico representando as populações celulares do baço, avaliadas por citometria de fluxo, comparando células B-1 e B-2 após 60 dias de inoculação dos camundongos com Leishmania (L.) amazonensis. Houve aumento significativo (p 0.05) na proporção de B-1 no grupo tratado com Timulina 5 ch (X 2, p=0.0001) e Antimonium crudum 30 ch (X 2, p=0.0001). Cont (baço) Thym (baço) A crud (baço) 20% B 24% B 19% B FAGO FAGO FAGO 80% X2, p= rel. cont 76% 81% Figura 5 - Gráfico representando as populações celulares do baço avaliadas por citometria de fluxo, comparando células B e fagócitos após 60 dias de inoculação dos camundongos com Leishmania (L.) amazonensis. Houve aumento significativo na proporção de fagócitos no grupo tratado com Timulina 5 ch (X 2, p=0.0001).

35 33 Cont (ativ) Thym (ativ) A crud (ativ) 13% B FAGO 22% B FAGO 14% B FAGO 87% 78% X2, p= rel. cont 86% Figura 6 - Gráfico representando as populações celulares do baço, no gate linfócitos ativados, avaliadas por citometria de fluxo, comparando células B e fagócitos após 60 dias de inoculação dos camundongos com Leishmania (L.) amazonensis. Houve aumento significativo na proporção de fagócitos no grupo tratado com Timulina 5 ch (X 2, p=0.0001). Cont (baço) 31% Thym (baço) 27% A crudum (baço) 26% LINF T LINF B LINF T LINF B LINF T LINF B 69% 73% 74% X2, p=0.001 Figura 7 - Gráfico representando as populações celulares do baço avaliadas por citometria de fluxo, comparando células B e T após 60 dias de inoculação dos camundongos com Leishmania (L.) amazonensis. Houve aumento significativo na proporção de células B em relação às células T no grupo tratado com Antimonium crudum 30 ch, comparado ao grupo controle (X 2, p=0,01).

36 34 Cont (ativ) Thym (ativ) A crudum (ativ) 39% 47% 46% LINF T LINF T LINF T 61% LINF B 53% LINF B 54% LINF B X2, p=0.001 X2, p=0.001 Figura 8 - Gráfico representando as populações celulares do baço no gate de linfócitos ativados avaliadas por citometria de fluxo, comparando células B e T após 60 dias de inoculação dos camundongos com Leishmania (L.) amazonensis. Os dados apresentaram aumento significativo da população de linfócitos B em relação aos linfócitos T, nos grupos de animais tratados com Timulina 5 ch e com Antimonium crudum 30 ch (X 2, p=0,001). Cont (baço) Thym (baço) A crudum (baço) 39% 61% CD4 CD8 45% 55% CD4 CD8 38% 62% CD4 CD8 Fisher, p=0.01 Figura 9 - Gráfico apresentando as populações de linfócitos CD4+ e CD8+ do baço, avaliadas por citometria de fluxo, 60 dias após a inoculação com Leishmania (L.) amazonensis em camundongos. Os dados apresentaram aumento significativo de células CD8+ em relação às células CD4+ nos grupos de animais tratados com Timulina 5 ch (Fisher, p=0,01).

37 35 Análise das células do peritônio O resultado global da análise da média das populações celulares do peritônio está expresso na Tabela 1. Considerando-se o balanço entre as diferentes subpopulações, observa-se que os animais tratados com Timulina 5 ch e Antimonium crudum 30 ch apresentam predomínio de células B-1 peritoneais em relação às células B-2 (Figura 10), em especial células B-1a, (12 a 18%) é constatado em ambos os grupos tratados (Figura 11). Os animais tratados com Antimonium crudum 30 ch igualmente apresentaram predomínio de linfócitos B totais em relação aos fagócitos (Figura 12). Houve aumento de linfócitos T no grupo tratado com Timulina 5 ch e aumento de linfócitos B no grupo tratado com Antimonium crudum 30 ch (Figura 13). Dentre as células T, nota-se predomínio de linfócitos CD8+ nos animais desse grupo (Figura 14). Cont (perit) Thym (per) A crud (per) 58% 42% B1 B2 42% 58% B1 B2 54% 46% B1 B2 X2, p= rel. cont X2, p= rel. cont Figura 10 - Gráfico representando as populações celulares do peritônio, avaliadas por citometria de fluxo, comparando células B-1 e B-2, após 60 dias de inoculação dos camundongos com Leishmania (L.) amazonensis. Houve aumento significativo na proporção B-1/B-2 no grupo tratado com Timulina 5 ch (X 2, p=0.0001) e Antimonium crudum 30 ch (X 2, p=0.0001) em relação ao controle.

38 36 Contr (perit) 1% Thym (perit) 18% A crudum (perit) 12% B1a B1b B1a B1b B1a B1b 99% 82% X2, p=0,0001 rel cont 88% X2, p=0,0001 rel cont Figura 11 - Gráfico representando as populações celulares do peritônio, avaliadas por citometria de fluxo, comparando células B-1a e B-1b após 60 dias de inoculação dos camundongos com Leishmania (L.) amazonensis. Houve aumento significativo na proporção células B-1a (CD5+)/B-1b (CD5-) nos grupos tratados com Timulina 5 ch e Antimonium crudum 30 ch (X 2, p=0.0001). Cont (perit) 8% 8% Thym (perit) A crud (perit) 6% B FAGO B FAGO B 94% FAGO 92% 92% X2, p= rel. cont Figura 12 - Gráfico representando as populações celulares do peritônio, avaliadas por citometria de fluxo, comparando células B e fagócitos após 60 dias de inoculação dos camundongos com Leishmania (L.) amazonensis. Houve aumento significativo na proporção células B (CD19+)/fagócitos (CD11b+) no grupo tratado com Antimonium crudum 30 ch (X 2, p=0.0001).

39 37 Contr (perit) Thym (perit) A crudum (perit) 18% 22% 12% LINF B LINF T LINF B LINF T LINF B LINF T 82% 78% 88% X2, p=0,0001 rel cont X2, p=0,0001 rel cont Figura 13 - Gráfico apresentando as populações de linfócitos T e B de peritônio, 60 dias após a inoculação com Leishmania (L.) amazonensis em camundongos. Os dados apresentaram aumento de linfócitos T (X2, p=0.0001) no grupo tratado com Timulina 5 ch comparado aos demais grupos. Houve aumento de linfócitos B (X2, p=0.0001) no grupo tratado com Antimonium crudum 30 ch em relação ao grupo tratado com Timulina 5 ch e Controle. Cont (perit) Thym (perit) A crudum (perit) 16% 16% 20% CD4 CD4 CD4 84% CD8 84% CD8 80% CD8 Fisher test, p=0,03 rel controle Figura 14 - Gráfico apresentando as populações de linfócitos T CD4+ e CD8+ de peritônio, 60 dias após a inoculação com Leishmania (L.) amazonensis em camundongos. Os dados apresentaram aumento significativo de CD8+ em relação ao CD4+ no grupo de animais tratados com Antimonium crudum 30 ch (Fisher, p=0,03).

40 Histometria e imuno-histoquímica Análise de formas amastigotas de pata e linfonodo Na histometria foram analisadas de maneira quantitativa e semi-quantitativa a resposta inflamatória e a carga parasitária dos fagócitos. Em relação à carga parasitária da pata, verificou-se diminuição de formas amastigotas intracelulares dos fagócitos no grupo tratado com Timulina 5 ch comparado aos demais grupos, avaliado 60 dias após a inoculação do parasita (Figura 15). Dados similares foram apresentados no linfonodo poplíteo ipsilateral (Figura 16). Não foram avaliadas formas amastigotas no baço, por causa de a Leishmania (L.) amazonensis apresentar apenas comprometimento cutâneo. A phago B Figura 15 - (A) Formas amastigotas de Leishmania (L.) amazonensis na lesão experimental coradas pelo método de Giemsa (seta), após 60 dias da inoculação, de camundongo tratado com Timulina 5 ch. Objetiva 100X. (B) Número de formas amastigotas por campo, analisadas pelo software Image J. ANOVA, * p=0.05.

41 A phago B 39 Figura 16 - (A) Formas amastigotas de Leishmania (L.) amazonensis no tecido adiposo adjacente a linfonodo poplíteo, de animal do grupo controle, coradas pelo método de Giemsa (seta), após 60 dias da inoculação. Objetiva 100X. (B) Número de formas amastigotas por campo, analisadas pelo software Image J. ANOVA, **p<0.01, ***p< Coloração hematoxilina/eosina Em uma segunda análise, cortes histológicos de pata, baço e linfonodo foram corados pelo método hematoxilina/eosina. No grupo controle, observou-se infiltrado inflamatório predominantemente mononuclear, apresentando intensa vacuolização citoplasmática e distribuição difusa no subcutâneo, com grande concentração de células na intersecção dermeepiderme. Diferentemente, o grupo tratado com Timulina 5 ch apresentou células inflamatórias vacuolizadas e organizadas em camadas no tecido subcutâneo, concentrando-se na derme profunda. O grupo tratado com Antimonium crudum 30 ch mostrou reduzido recrutamento celular e edema subcutâneo (Quadro 2).

42 40 Quadro 2 - Fotomicrografias representando cortes histológicos de patas coradas com hematoxilina/eosina em camundongos, após 60 dias de inoculação com Leishmania (L.) amazonensis. Objetiva de 10X. Grupo descrição fotomicrografia Controle Processo inflamatório difuso com a presença de vacúolos citoplasmáticos. Timulina 5 ch Infiltrado inflamatório evidente na derme profunda, com células vacuolizadas e organização em camadas no tecido subcutâneo. Antimonium crudum 30 ch Processo inflamatório discreto, com evidência de planos profundos de camada muscular. Notar dispersão das estruturas vasculares e nervosas no tecido subcutâneo (edema). musculatura

43 41 Diâmetro de área folicular e total de baço e linfonodo A razão entre a área folicular sobre a área total de linfonodo e baço foi calculada em pixels, pelo software Image J, porém sem resultados significativos entre os grupos, conforme Tabela 2. A figura 17 (A) representa um corte histológico de baço, sendo circundada a área de polpa branca; em B nota-se um folículo de linfonodo e suas respectivas áreas: CG=centro germinativo, ZM=zona do manto e região paracortical. A phago B B Figura 17 - (A) Baço e seus folículos (polpa branca) foram delimitados após 60 dias de inoculação com Leishmania (L.) amazonensi, esta foto representa um dos animais do grupo tratado com Antimonium crudum 30 ch. Na figura B verifica-se o folículo no linfonodo, dividido conforme suas regiões, de um animal do grupo tratado com Timulina 5 ch: CG=Centro Germinativo, ZM=Zona do Manto e PR=Paracortical do grupo tratado com Timulina 5 ch.

44 42 Imuno-histoquímica A imuno-histoquímica confirmou os dados estabelecidos no Quadro 2, com diminuição de células positivas para CD3, CD45RA e CD11b por campo nas patas dos camundongos após 60 dias de inoculação com Leishmania (L.) amazonensis no grupo tratado com Antimonium crudum 30 ch, conforme resultados mostrados nas figuras 18 e 19, e Quadro 3. A contagem de macrófagos por campo não foi possível em função do número incontável de células por campo. A phago B B Figura 18 - Imuno-histoquímica para CD3 (linfócitos T) (A), contagem de linfócitos T positivos por campo (B), na pata de camundongos após 60 dias de inoculação com Leishmania (L.) amazonensis. Objetiva 10X (** p<0.01), em relação aos demais grupos. Na figura A pata de animal do grupo controle.

45 43 A phago B B Figura 19 - Imuno-histoquímica para CD45RA (linfócitos B) (A), contagem de linfócitos B positivos por campo (B), na pata de camundongos após 60 dias de inoculação com Leishmania (L.) amazonensis. Objetiva 10X (*** p<0.01, em relação aos demais grupos). Em A pata de animal do grupo tratado com Timulina 5 ch.

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