ANÁLISE DE IMAGENS EM TECNOLOGIA DE SEMENTES

Transcrição

1 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz ANÁLISE DE IMAGENS EM TECNOLOGIA DE SEMENTES Francisco Guilhien Gomes Junior Depto de Produção Vegetal USP/ESALQ Disciplina: Produção de Sementes (LPV-5705) Pós-graduação - Fitotecnia Primeiro Semestre de 2013 A análise de imagens em Tecnologia de Sementes Princípios: Métodos não destrutivos. Análises automatizadas e assistidas por computador. Aplicações: Estudos de germinação de sementes. Classificação e aprimoramento da qualidade de lotes de sementes (com base em características físicas e morfológicas das sementes). Identificação de injúrias internas nas sementes. Identificação de sementes mal formadas. Estudos de maturação e secagem de sementes. Avaliação do vigor de sementes. 1

2 TESTE DE RAIOS X 2

3 Características dos raios X DESCOBERTA PRINCÍPIO Físico alemão Wilhelm Conrad Röntgen ( ); 8 de novembro de 1895: primeira chapa de raios X. Fonte: Google O TESTE DE RAIOS X: interpretação ISTA (2003) e RAS (2009) Recomendado com a finalidade básica de detectar sementes cheias, vazias, com injúrias mecânicas ou atacadas por insetos Plúmula Trinca 1 Trinca 2 Trinca 3 Raízes seminais Radícula 3

4 O TESTE DE RAIOS X: interpretação tegumento cotilédones radícula hipocótilo Crotalaria juncea L. plúmula 1 mm Fatores que determinam a potencialidade da utilização de raios X em sementes A pequena dose de radiação usada durante o teste NÃO exerce influência negativa sobre a germinação. NÃO inviabiliza a semente: relações de causas e efeitos. Radiografia de semente de milho doce CAUSA EFEITO 4

5 FATORES QUE AFETAM O NÍVEL DE ABSORÇÃO DOS RAIOS X PELA SEMENTE Composição da semente Proteínas, carboidratos e lipídios => diferentes graus de hidrofobicidade O teor de água da semente influencia a densidade óptica Tucumã (Astrocaryum aculeatum) Sementes de pimentão Gagliardi e Marcos Filho (2011) Visualização mais nítida das partes componentes de sementes de pimentão: 12% de água 35% de água 15% de água Espessura e densidade dos tecidos Comprimento de onda da radiação ionizante Raios X de menor comprimento de onda => maior poder de penetração EQUIPAMENTOS DE RAIOS X COM REVELAÇÃO DIGITAL 10 5

6 Raios X com revelação Etapa 1: obtenção da radiografia da semente. Equipamento de raios X Reveladora Faxitron X-Ray MX-20 USP/ESALQ Hope X-Ray 319 Micromax USP/ESALQ Etapa 2: digitalização da imagem radiográfica da semente. Etapa 3: análise da imagem radiográfica da semente na tela do computador. 6

7 Raios X digital A semente é radiografada e a imagem é automaticamente gerada na tela do computador. USP/ESALQ Foto: Francisco G. Gomes Junior Radiografias de semente de milho doce Radiografia - Com revelação Radiografia - Digital Fotos: Francisco G. Gomes Junior 7

8 Finalidades da utilização do teste de raios X em Tecnologia de Sementes Detecção de anormalidades em embriões. Determinação do estádio de desenvolvimento das sementes. Estudos de alterações fisiológicas durante os processos de maturação, secagem, germinação ou condicionamento fisiológico. Identificação de injúrias mecânicas, injúrias causadas por insetos ou injúrias decorrentes de outros fatores adversos em pré e pós-colheita. Seleção de sementes cheias. Embrião deformado PA Tecoma stans Embrião com pequeno defeito PA Embrião sem defeito PN Socolowski e Cicero (2008) 8

9 Morfologia interna de sementes de ipê Germinação (%) Oliveira et al. (2004) Quercus rubra L. Efeito da predação sobre a germinação e desempenho das plântulas Lombardo e McCarthy (2009) 9

10 Injúrias mecânicas em semente de milho Vista ventral Vista dorsal Raios X Raiz seminal Raiz primária Plântula anormal Cicero e Banzatto Junior (2003) Injúrias mecânicas em semente de milho doce Gomes Junior (2009) 10

11 Injúrias causadas por secagem em semente de arroz Raios X Plântula anormal Semente de arroz: secagem a 50 o C Fonte: Menezes et al. (2005) Injúrias mecânicas em semente de soja Injúrias mecânicas no eixo embrionário Plântula anormal Pinto (2006) 11

12 Injúrias por umidade em sementes de soja Injúrias não severas no eixo embrionário Injúrias severas no eixo embrionário Plântula normal Injúrias não severas na região dos cotilédones Injúrias severas no eixo embrionário Injúrias severas na região dos cotilédones Semente morta Plântula anormal Injúrias severas na região dos cotilédones Forti (2010) Danos causados por caruncho em sementes de feijão-caupi Melo et al. (2010) 12

13 Danos causados por larva de insetos em semente de palmeira Brancalion et al. (2011) Tomografia computadorizada de raios X em semente de Syagrus flexuosa (Coco do Vaquiero) Stuppy e Dransfield (2002) 13

14 AVALIAÇÃO DA MORFOLOGIA INTERNA DE SEMENTES POR DENSITOMETRIA DE RAIOS X Janela de análise indicando o perfil de densidade de uma sementedeabóbora Espécie Massa da sem. (g) ABÓBORA Densidade média (g.cm -3 ) Área do embrião (%) Comprimento da plântula (cm) Abóbora 4 dias 8 dias S1 0,2007 0,97 55,4 12,2 48,7 (N) S2 0,2328 1,13 62,5 5,8 36,5 (N) S3 0,1863 0,85 52,2 8,8 44,6 (N) S4 0,073 0,38 18,4 0 0,3 (A) S5 0,2031 0,96 58,3 5,1 41,6 (N) S6 0,0796 0,43 44,1 0,9 0,9 (A) 2 Densidade (g.cm -3 ) 1,6 1,2 0,8 0, Comprimento (cm) 1 cm 4 cm Gomes Junior et al. (2012) AVALIAÇÃO DA MORFOLOGIA INTERNA DE SEMENTES POR DENSITOMETRIA DE RAIOS X MELÃO Densidade (g.cm -3 ) 1,6 1,2 0,8 0,4 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S Comprimento (cm) Espécie Massa da sem. (g) Densidade média (g.cm -3 ) Área do embrião (%) Comprimento da plântula (cm) Melão 4 dias 8 dias S4 0,0423 0,57 59,7 10,4 21,7 (N) S9 0,0152 0, Melancia 5 dias 10 dias S2 0,0616 0,72 67, ,7 (N) S4 0,0365 0, S6 0,0392 0,48 54,1 17,3 23,2 (N) Gomes Junior et al. (2012) MELANCIA 14

15 PROCEDIMENTOS COMPUTADORIZADOS PARA A DETERMINAÇÃO DE VARIAÇÕES NA MORFOLOGIA INTERNA DE SEMENTES ASSOCIADAS COM A GERMINAÇÃO Variações na área embrionária identificadas em lote comercial de sementes de alface Aumento da área ocupada pelo embrião 67% 73% 77% 80% 83% 85% Imagem: Francisco G. Gomes Junior EFEITOS SOBRE O DESEMPENHO DAS PLÂNTULAS? 15

16 AVALIAÇÃO AUTOMATIZADA DA ÁREA EMBRIONÁRIA OU DO ESPAÇO INTERNO LIVRE EM SEMENTES TOMATO ANALYZER IMAGE-PRO PLUS Tomato Analyzer (TA) Utilização do TA na pesquisa de Tecnologia de Sementes Primeiro trabalho de pesquisa utilizando o TA: Software tomato analyzer para a determinação do tamanho do embrião em sementes radiografadas (Marcos Filho et al., 2010). Radiografias de sementes de algodão analisadas pelo TA Pericarp Area = 0,14 Pericarp Area = 0,43 Pericarp Area = 0,59 Área do embrião = 86% Área do embrião = 57% Área do embrião = 41% Brewer et al. (2008) 16

17 IMAGE-PRO PLUS Espaço livre interno total = 1, mm 2 Espaço livre interno = 0,05916 mm 2 Xylopia aromatica (anonaceae) Imagem processada e analisada Imagem radiográfica original 1 mm Imagem: Fábio Socolowski IMAGE-PRO PLUS Dell Aquila (2007) Sementes de pimentão 17

18 Avaliação automatizada do vigor de sementes Década de técnicas de análise de imagens foram desenvolvidas para a avaliação do vigor de sementes de alface (McCormac et al., 1990; Howarth e Stanwood, 1993b), de cenoura (McCormac et al., 1990) e de sorgo (Howarth e Stanwood, 1993b). Processamento digital das cores de imagens com diferentes padrões de coloração de tetrazólio avaliação do vigor de sementes de milho (Howarth e Stanwood, 1993a) Utilização de escaner para aquisição de imagens de sementes e plântulas e posterior análise computadorizada (Geneve e Kester, 2001; Sako et al., 2001). SEED VIGOR IMAGING SYSTEM (SVIS) PARA AVALIAÇÃO DO VIGOR DE SEMENTES DE ALFACE (Sako et al., 2001). SVIS Processamento computadorizado de imagens escaneadas de plântulas, gerando valores numéricos que representam, coletivamente, o potencial fisiológico do lote de sementes (índice de vigor). Índice de vigor (IV): parâmetros estatísticos obtidos a partir de características morfológicas das plântulas. comprimento do hipocótilo e da raiz primária. desvio padrão do comprimento do hipocótilo, da raiz primária e total. comprimento da raiz primária em relação ao comprimento do hipocótilo. IV = PESO c x C + PESO u x U C = crescimento (índice de 0 a 1000) U = uniformidade de crescimento (índice de 0 a 1000) IV = índice de 0 a

19 SVIS sementes de alface Plântulas de alface Hipocótilo Raiz primária Baalbaki et al. (2009) Fotos: Miller B. McDonald SVIS Ohio, EUA Aquisição das imagens de plântulas de soja Baalbaki et al. (2009) Foto: Miller B. McDonald 19

20 SVIS USP/ESALQ Aquisição das imagens de plântulas de soja Imagem escaneada na tela do computador e pronta para ser analisada pelo SVIS Fotos: Francisco G. Gomes Junior Plântulas de soja analisadas pelo SVIS Marcos Filho et al. (2009) Índice de vigor 84,58mm Os valores do índice de vigor são baseados na rapidez e uniformidade de desenvolvimento das plântulas da amostra, em relação ao máximo valor possível para plântulas de soja com 3 dias de idade, parâmetros estabelecidos na programação do software. A uniformidade é estabelecida em função do desvio em relação ao desenvolvimento padrão de plântulas com 3 dias de idade, programado no software. 20

21 SVIS - índices de vigor para soja (plântulas com três dias de idade) Proposta da Ohio Seed Improvement Association Alto vigor: > 500 Vigor médio: Baixo vigor: < 200 Proposta da Ohio State University Vigor excepcional: Alto vigor: Bom vigor: Baixo vigor: Grãos: < 200 Análise SVIS Plântulas de arroz Quatro dias de idade Imagem: Francisco G. Gomes Junior 21

22 Cuidados e limitações na utilização do SVIS A temperatura no germinador não pode oscilar durante o período de germinação. Parâmetros SVIS Milho Temperatura C Soja 24 C 25 C 26 C 24 C 25 C 26 C Crescimento 531 B 459 B 734 A 612 B 573 B 731 A Uniformidade 832 B 861 A 859 A 867 A 872 A 870 A Vigor 621 B 579 B 765 A 739 B 722 B 800 A Otoni e McDonald et al. (2005) Deve-se atentar para a uniformidade de umedecimento do substrato. Para que se possa fazer comparações entre lotes, as imagens devem ser escaneadas considerando o mesmo período de germinação para cada lote. Inapropriado para a avaliação de lotes com sementes dormentes. Inviável quando o objetivo for comparar cultivares que naturalmente apresentem diferentes taxas de crescimento. Finalidades da utilização do SVIS em Tecnologia de Sementes Avaliação do vigor das sementes para determinar o potencial de desempenho das plântulas em campo e o estabelecimento do estande. Auxiliar os melhoristas na seleção de genótipos com rápida emergência de plântulas ou com tolerância à seca ou temperaturas altas. Monitoramento do desempenho de lotes de sementes ao longo do armazenamento. Avaliar a eficiência do tratamento fungicida, da peletização e do condicionamento fisiológico de sementes. 22

23 Avaliação do vigor de sementes de soja: SVIS X métodos tradicionais Lotes Germ. (%) PCG (%) EAT 48h (%) EASS 72h (%) EP (%) 1 93 AB* 91 A 86 A 92 A 90 A 2 87 B 76 B 77B 84 B 95 A 3 94 AB 92 A 85 A 94 A 94 A 4 97 A 94 A 86 A 94 A 90 A 5 91 AB 89 AB 83 AB 92 A 95 A C.V. (%) 5,5 6,3 3,6 3,3 9,1 Lotes SVIS (IV) SVIS (IU) SVIS CP (mm) A 897 A 105 A A 902 A 77 C A 913 A 107 A A 909 A 89 BC A 903 A 96 AB C.V. (%) 2,3 2,1 6,3 * Médias seguidas pela mesma letra dentro de cada coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey (p 0,05) Marcos Filho et al. (2009) Avaliação do vigor de sementes de melão: SVIS X métodos tradicionais Cultivar Nitro Lote Germ.(%) PCG (%) EASS (%) EP (%) IV IU 6 99 a* 96 a 97 a 99 a 902 ab 922 ab 7 88 b 80 b 77 b 92 b 752 c 882 c 8 99 a 97 a 97 a 100 a 918 a 907 bc 9 99 a 96 a 98 a 100 a 883 ab 934 a a 93 a 95 a 95 a 861 b 921 ab * C.V. Médias(%) seguidas pela mesma 5,5letra dentro de cada 5,5 coluna não diferem6,0 entre si pelo teste de Tukey 5,3 (p 0,05) 3,6 2,9 Marcos Filho et al. (2006) 23

24 Avaliação do vigor de sementes de feijão: SVIS X métodos tradicionais Lote G PCG EA EPA VEP CE % (índice) µs.cm -1.g b* 60 c 44 b 79 ab 5,5 bc 86,3 c 2 85 ab 73 b 44 b 84 ab 5,8 b 85,7 bc 3 80 b 54 c 22 c 65 b 4,2 c 77,8 ab 4 96 a 83 a 85 a 93 a 7,5 a 72,6 a 5 96 a 93 a 89 a 94 a 7,6 a 72,8 a C.V. (%) 7,1 6,4 9,5 11,9 10,1 4,8 IV Lote CP (cm) C U 30:70 40:60 50:50 60:40 70:30 1 4,4 c* 433 b 915 b 771 b 723 b 675 b 626 b 578 b 2 4,5 c 440 b 913 b 771 b 724 b 677 b 629 b 582 b 3 3,1 d 306 c 917 b 734 c 672 c 612 c 550 c 489 c 4 8,6 b 852 a 945 a 917 a 908 a 899 a 889 a 880 a 5 9,4 a 920 a 933 ab 929 a 927 a 927 a 925 a 924 a Média 6, CV (%) 5,6 5,6 1,4 1,4 1,7 2,1 2,7 3,2 * Médias seguidas pela mesma letra dentro de cada coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey (p 0,05) Gomes Junior et al. (submetido) Vantagens do SVIS em relação aos testes tradicionais Os resultados são obtidos com maior rapidez em relação aos testes de germinação, de envelhecimento acelerado e de frio. Os resultados são gerados por programa computadorizado, eliminando os erros de intrepretação humana. Possibilita o arquivamento das imagens das plântulas após a germinação, que é mais vantajoso em relação ao arquivamento de dados numéricos. É um método direto para avaliação do vigor pois determina o desempenho das plântulas. 24

25 Eficiência comprovada do SVIS para avaliação do vigor de sementes Alface - Sako et al. (2001) Soja - Hoffmaster et al. (2003); Marcos Filho et al. (2009) Milho - Otoni e McDonald (2005) Milho doce - Gomes Junior et al. (2009); Alvarenga et al. (2012) Melão - Marcos Filho et al. (2006) Crotalária - C.B. Silva et al. (2012) Pepino - Chiquito et al. (2012) Amendoin - Marchi et al. (2011) Trigo - V.N. Silva et al. (2012) Girassol Rocha (2012) Tomate e berinjela - V.N. Silva (2012) Software Vigor S Imagem: Francisco G. Gomes Junior 25

26 OBRIGADO PELA SUA ATENÇÃO 26