UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS UEA FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS FMTAM MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS

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1 UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS UEA FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS FMTAM MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS APLICAÇÃO DA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) NO DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA MÔNICA REGINA FARIAS COSTA MANSO MANAUS 2004

2 MÔNICA REGINA FARIAS COSTA MANSO APLICAÇÃO DA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) NO DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação da Universidade do Estado do Amazonas, para obtenção do grau de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas. Orientadora: Profª Dr a Maria das Graças Costa Alecrim Colaborador: Marcus Vinícius Guimarães de Lacerda MANAUS 2004

3 ii FICHA CATALOGRÁFICA MANSO, Mônica Regina Farias Costa Aplicação da Reação em Cadeia da Polimerase no Diagnóstico de Malaria/Mônica Regina Farias Costa Manso. Manaus. AM: UEA; FMTAM, p.:il. Dissertação (Mestrado em Doenças Tropicais e Infecciosas) 1. Reação em cadeia da polimerase 2. Malária 3. Infecção mista I. Título

4 iii Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório da Gerência de Malária da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas-FMTAM, com recursos parcialmente providos pela Superintendência da Zona Franca de Manaus através do convênio nº 035/2002.

5 iv Aos meus pais Stanley Rebello Costa e Marineusa Carneiro de Farias, pela vida, amor e carinho sempre dedicados a mim. A vocês devo minha formação pessoal e profissional. À minha irmã Rita de Cássia (em memória). Às minhas filhas amadas, Luana Cássia e Izabella Mercedes, razão da minha vida. Ao Marcus, pelo apoio e incentivo na conclusão deste trabalho. Dedico.

6 v AGRADECIMENTOS A Universidade do Estado do Amazonas e a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, pela criação do Curso de Mestrado em Doenças Tropicais e Infecciosas. À Dra Graça Alecrim, pela orientação e contribuição na realização deste trabalho. Ao Dr. Pedro Paulo Ribeiro Vieira e Dra. Joselita Maria Mendes dos Santos, por aceitarem participar como membros da banca e pelas sugestões dadas ao presente trabalho. Ao Dr. Marcus Vinícius Guimarães de Lacerda, pela orientação e auxílio na análise estatística. Às companheiras de mestrado Ana Ruth, pela colaboração em vários momentos da realização deste trabalho, Márcia Araújo, Ruth Milagros e Rossicléa Monte, pela amizade e companheirismo partilhados principalmente nos momentos de angústias. A Patrícia Dantas Santos, farmacêutica-bioquímica, responsável pela padronização da Reação em Cadeia da Polimerase no laboratório de malária da FMTAM. Ao Sr. Jubal Gonzaga Simões, pela colaboração na revisão das lâminas. Aos funcionários do Laboratório de Malária pelos procedimentos de coleta de sangue nas enfermarias. A Sra. Raimunda Ericilda Soares de Araújo, pela amizade e valiosa colaboração na coleta de sangue, preparo de soluções e tantos outros procedimentos no laboratório. À aluna de iniciação científica Cynthia Oliveira, pelo auxílio durante a execução prática deste trabalho. Ao Dr. José Joaquim Fonseca Sandoval, sempre disposto a colaborar. À bibliotecária Artemisa Seabra da Silva, pelo empenho na pesquisa bibliográfica. Às funcionárias responsáveis pelo Arquivo Médico, Senhoras Iracema Libório e Maria Albuquerque de Souza. A Prof.ª Maria do Socorro Nobre Tavares pela revisão do texto. A todos aqueles que, em algum momento, com uma palavra de carinho e coragem, me incentivaram a concluir este trabalho.

7 vi Eu pedi FORÇA... e Deus me deu dificuldades para me fazer forte. Eu pedi PROSPERIDADE... e Deus me deu cérebro e músculos para trabalhar. Eu pedi SABEDORIA... e Deus me deu problemas para resolver. Eu pedi CORAGEM... e Deus me deu perigo para enfrentar. Eu pedi AMOR... e Deus me deu pessoas com problemas para eu ajudar. Eu pedi AJUDA... e Deus me prometeu, desde que me esforçasse.

8 vii RESUMO O exame da gota espessa teste de referência para o diagnóstico da malária, é considerado satisfatório quanto à sensibilidade e especificidade. Porém, alguns aspectos como densidade parasitária baixa, infecções mistas, além dos relacionados à qualidade da amostra e coloração, devem ser considerados como fatores que dificultam o diagnóstico através desta técnica. Novas pesquisas têm sido realizadas para a padronização de técnicas que apresentem sensibilidade para o diagnóstico de malária. A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), por apresentar esta característica, vem sendo utilizada para o diagnóstico da malária, uma vez que o método baseia-se na amplificação de regiões específicas do genoma, tornando possível a identificação das espécies de plasmódio. Apesar de ser um método complexo, com custo elevado e exigir pessoas qualificadas para a sua realização, tem melhor sensibilidade e especificidade sobre a gota espessa. O estudo avalia a co-positividade, co-negatividade e concordância da PCR e da gota espessa. Todas as amostras foram testadas pelos dois métodos. Na gota espessa foram identificadas 74 amostras com Plasmodium falciparum, 45 com P. vivax, quatro infecções mistas e 98 negativas. A PCR identificou 61 amostras com P. falciparum, 31 P. vivax, 32 infecções mistas e 97 negativas. Várias divergências foram encontradas entre os dois métodos. A PCR apresentou co-positividade para malária falciparum de 96,7% e co-negatividade de 62,2%, com coeficiente kappa de 0,44. Para malária vivax, a PCR apresentou co-positividade de 100%, co-negatividade de 78,1% e coeficiente kappa de 0,56. Na malária mista, a co-positividade foi de 100% e a co-negatividade de 84,9%, com coeficiente kappa de 0,26. Os coeficientes kappa foram considerados baixos, refletindo a alta sensibilidade do método para detectar malária mista. Palavras-chaves: Malária, Reação em Cadeia da Polimerase, Diagnóstico, Infecção mista.

9 viii ABSTRACT The thick smear exam, a reference test for the diagnosis of malaria, is considered adequate in sensitivity and specificity. However, some aspects like low parasitemia, mixed infections and those related to the quality of the sample and staining should be considered as misdiagnosing factors through this technique. New research is on the way in order to standardize techniques with higher sensitivity for the malaria diagnosis. The polymerase-chain reaction (PCR), due to its higher sensitivity, is being used for the diagnosis of malaria, since the method is based in the amplification of gene-specific regions, making possible the identification of different plasmodia species. Despite the complexity of the technique, with high costs and the demanding of personal with experience, it has higher sensitivity and specificity than the thick smear technique. This study evaluates the co-positivity, co-negativity and concordance of the PCR in comparasion with the thick smear technique. All the samples were tested by both techniques. With the thick smear technique, it was detected 74 P. falciparum, 45 P. vivax, four mixed infections and 98 negative samples. PCR disclosed 61 with P. falciparum, 31 with P. vivax, 32 with mixed infections and 97 negative samples. Many divergences were found between the two methods. PCR presented co-positivity with the thick smear for falciparum malaria in 96,7% and co-negativity of 62,2% (kappa 0,44). For vivax malaria, PCR presented co-positivity of 100% and co-negativity of 78,1% (kappa 0,56). For mixed infections, co-positivity of 100% and co-negativity of 84,9% (kappa 0,26). Kappa were considered low, reflecting the high sensitivity of the technique for the diagnosis of mixed infections. Key words: Malaria, Polymerase-Chain Reaction, Diagnosis, Mixed infection.

10 ix LISTA DE ABREVIATURAS a. C. Antes de Cristo ADN Ácido Desoxirribonucleico bp Base pairs (pares de base) C- Controle negativo DNA Desoxiribonucleic acid dntps Deoxinucleotídeos Trifosfatados DP Desvio Padrão D- Dia da negetivação da gota espessa D0 D zero primeiro dia F+ Controle positivo de P. falciparum F+V falciparum+vivax (infecção mista) FAL1 e FAL2 Iniciadores que amplificam região específica do gene SSUrRNA de P. falciparum FMTAM Fundação de Medicina Tropical do Amazonas FNS ou FUNASA Fundação Nacional de Saúde IF-Ag Imunofluorescência-pesquisa de antígeno LSU Large subunit (subunidade maior) M+ Controle positivo de P. malariae MAL1 e MAL2 Iniciadores que amplificam região específica do gene SSUrRNA de P. malariae ml Mililitro mm 3 Milímetro cúbico OMS Organização Mundial de Saúde P. falciparum Plasmodium falciparum P. malariae Plasmodium malariae P. vivax Plasmodium vivax PCR Polymerase Chain Reaction PLU5 e PLU6 Iniciadores que amplificam região gênero-específica de Plasmodium spp PM Peso molecular Q.B.C. Quantitaive Buffy Coat RNA Ribonucleic acid rrna RNA ribossômico SIVEP_Malária Sistema de Informações de Vigilância Epidemiológica Nacional- Notificação de Caso de Malária SSU Small subunit (pequena subunidade) SSUrRNA Small subunit RNA ribossomic (subunidade menor do rrna) Taq Thermus aquaticus V+ Controle positivo de P. vivax VIV1 e VIV2 Iniciadores que amplificam região específica do gene SSUrRNA de P. vivax WHO World Health Organization µl Microlitro

11 x LISTA DE FIGURAS Figura 1 Ciclo biológico do plasmódio Figura 2 Esquema da reação em cadeia da polimerase Figura 3 Sensibilidade dos métodos de diagnósticos para malária Figura 4 Negativação da gota espessa nos pacientes com malária vivax e malária falciparum Figura 5 Distribuição dos resultados da PCR e gota espessa na população de estudo Figura 6 Parasitemia/mm 3 na gota espessa de acordo com o tipo de malária na PCR Figura 7 Intensidade do amplicon (produto de PCR) em relação à densidade parasitária na gota espessa (malária falciparum) Figura 8 Intensidade do amplicon (produto de PCR) em relação à densidade parasitária na gota espessa (malária vivax)... 30

12 xi LISTA DE TABELAS Tabela 1 Interpretação de kappa Tabela 2 Distribuição quanto à faixa etária em 221 pacientes o grupo de estudo Tabela 3 Comparação da gota espessa e PCR nas 344 amostras coletadas de 221 pacientes Tabela 4 Co-positividade e co-negatividade da PCR com a gota espessa na malária falciparum Tabela 5 Co-positividade e co-negatividade da PCR com a gota espessa na malária vivax Tabela 6 Co-positividade e co-negatividade da PCR com a gota espessa na malária mista Tabela 7 Resultado da PCR em D0 e da PCR no dia da negativação da gota espessa (D-)... 28

13 xii SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO A Doença Os Vetores Ciclo Biológico Epidemiologia da Malária Na Amazônia Diagnostico da Malária Reação em Cadeia da Polimerase OBJETIVOS Geral Específicos METODOLOGIA Modelo de estudo Universo de estudo População de referência População de estudo Procedimentos Pacientes com malária Pacientes sem malária Gota espessa Extração de DNA Reação em cadeia da polimerase PCR Condições de amplificação Análise do produto de PCR Análise dos resultados RESULTADOS Características da população de estudo quanto ao gênero e faixa etária Pacientes com malária Pacientes sem malária Resultados na gota espessa Densidade parasitária na gota espessa Negativação da gota espessa nos pacientes com malária Anti-maláricos utilizados no tratamento Análise da reação em cadeia da polimerase Comparação entre gota espessa e PCR Malária mista na PCR Densidade parasitária dos pacientes com P. vivax e P. falciparum na PCR Concordância entre os métodos Parasitemia X intensidade do fragmento alvo no gel de agarose DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS OBRAS CONSULTADAS ANEXOS... 46

14 1. INTRODUÇÃO 1.1 A DOENÇA A malária, doença infecciosa não contagiosa, com manifestações episódicas de caráter agudo, causada por protozoários do gênero Plasmodium, é transmitida ao homem através da fêmea do mosquito do gênero Anopheles no momento do repasto sanguíneo (KROGSTAD,1995). São reconhecidas quatro espécies de plasmódio que infectam o homem: Plasmodium falciparum (WELCH, 1897), Plasmodium vivax (GRASSI E FELETTI, 1880), Plasmodium malariae (LAVERAN,1881) e Plasmodium ovale (STEPHENS, 1922), sendo esta a única espécie não encontrada no Brasil (REISBERG, 1997). A doença produzida no homem é caracterizada por um quadro clínico onde predominam a febre, calafrio e cefaléia. Qari et al., (1991,1993 a,b) identificaram o P. vivax-like, um parasito de malária humana com morfologia semelhante ao P. vivax, porém com características genéticas diferentes. Conhecida desde a antigüidade e por sua ampla distribuição e alta morbidade, a malária humana é considerada uma das mais importantes doenças tropicais. Provavelmente originada na África, de onde se espalhou para regiões tropicais e subtropicais de todo o mundo (Roll Back Malaria-WHO, 2003). Existem relatos e evidências arqueológicas que desde a pré-história o homem do Velho Mundo já estava exposto à malária, visto que foram encontradas múmias com esplenomegalia e relatos em papiros mencionando a ocorrência de pacientes com esplenomegalia e febre. Na China e Índia, textos médicos descrevem sobre febres intermitentes, condizendo com o quadro característico de malária, embora não se tivesse a certeza de que se tratava dessa doença (DEANE, 1992; FERRARI, 1994). No século IV a.c., os gregos associaram a doença à exposição aos pântanos com subseqüente aparecimento de febre e esplenomegalia. Naquela mesma época, na Grécia, médicos caracterizam a malária descrevendo os tipos febris: cotidiano, terçã e quartã. Hipócrates (século. IV a.c.) descreveu clinicamente a malária com quadros febris típicos e enfatizou claramente a esplenomegalia e hepatomegalia, além de relacionar a cura do doente à redução do baço e do fígado (KROGSTAD, 1995; DEANE, 1992). Em 1874, Meckel observou grânulos de pigmentos no sangue e em órgãos de indivíduos que foram vítimas da malária e mostrou que a cor escura desses órgãos

15 2 era devido a esses pigmentos intracelulares. Esse achado permitiu que os estudos para elucidar o agente causador da malária se intensificassem. Em 1880, Charles Louis-Alphonse Laveran, examinando esfregaço de sangue periférico de um paciente com malária, viu pela primeira vez corpos esféricos pigmentados em eritrócitos e a formação de gametas, evidenciando o fenômeno de exoflagelação. Esse marco na história da protozoologia esclareceu definitivamente o agente causador da doença (SOUZA, 1997; FERRARI, 1994). Patrick Manson, em 1894, sugeriu que o mecanismo de transmissão da malária ocorria por meio de insetos hematófagos, provavelmente mosquitos. Essa teoria foi tão convincente que levou Ronald Ross a investigar o assunto, confirmando-o através de estudos com malária aviária. A transmissão da malária humana só foi confirmada em 1898 quando Ronald Ross demonstrou o desenvolvimento de oocistos na parede do estômago de mosquitos do gênero Anopheles. Mas coube a Giovanni Batista Grassi, entre 1898 e 1899, a descrição completa do ciclo dos parasitos da malária humana no anofelino (PESSOA, 1978). 1.2 OS VETORES Os anofelinos transmissores da malária pertencem à família Culicidae, subfamília Culicinae, tribo Anophelini, distribuídas em dois gêneros: Chagasia e Anopheles, e este último em sete subgêneros. A. Chagasia Cruz, 1906 B. Anopheles Meigen, Anopheles s. str. Meigen, Stethomyia Theobald, Nyssorhynchus Blanchard, Arribalzagia Theobald, Kerteszia Theobald, Myzorhynchella Theobald, Lophopodomyia Antunes, 1937 Das 53 espécies de anofelinos conhecidas no Brasil, nove são transmissoras da malária humana e estão distribuídas nos subgêneros Nyssorhynchus e Kertezia. Segundo sua importância epidemiológica, estão divididas em dois grupos: o dos vetores primários, representados pelo A. (N.) darlingi, A. (N.) albitarsis domesticus, A. (N.) aquasalis, A. (K.) cruzii e A. (K.) bellator, considerados os grandes

16 3 responsáveis pela transmissão da malária e de maior importância epidemiológica; e o dos vetores secundários, formados pelo A. (N.) strodei, A. (N.) noroestensis, A. (N.) brasiliensis e A. (K.) homunculus, também chamados de locais ou acidentais (FERREIRA, 1964; CONSOLI E OLIVEIRA, 1998). De acordo com o trabalho desenvolvido por Tadei e Tatcher (2000), que tinha o objetivo de determinar a importância da transmissão da malária, várias espécies de Anopheles foram estudadas e das 33 espécies de ocorrência na Amazônia, apenas oito foram encontradas infectadas por Plasmodium, sendo Anopheles darlingi, o principal vetor. O subgênero Nyssorhynchus foi o de maior ocorrência. 1.3 CICLO BIOLÓGICO Todas as espécies de Plasmodium possuem um ciclo assexuado, desenvolvido no vertebrado, denominado endógeno ou esquizogônico, e outro ciclo sexuado de desenvolvimento no mosquito, denominado exógeno ou esporogônico. O ciclo esquizogônico tem início quando os esporozoítos, formas infectantes do parasito contidas na saliva dos mosquitos, são inoculados no homem durante o repasto sanguíneo de mosquitos fêmeas do gênero Anopheles. Uma vez inoculados, os esporozoítos deixam o tecido subcutâneo e caem na corrente circulatória, onde permanecem livres durante cerca de meia hora. Grande parte dos esporozoítos é eliminada da corrente circulatória pelos fagócitos no fígado e baço. Alguns desses organismos penetram nas células hepáticas onde se desenvolvem por esquizogonia. Cada esquizonte tecidual formado dá origem a milhares de merozoítos, que são liberados na circulação após ruptura do hepatócito. Na malária causada pelo P. vivax, muito desses merozoítos penetram novamente em outras células hepáticas, onde permanecem em estado latente. A essas formas denominadas hipnozoítos, são atribuídas as recaídas tardias da malária vivax. Parte dos merozoítos resultantes do processo esqujizogônico é rapidamente destruída, mas um número significante se liga a receptores específicos na superfície dos eritrócitos (Figura 1). O P. vivax liga-se à glicoproteína Duffy e o P. falciparum às glicoforinas A, B e C, dando continuidade ao ciclo eritrocítico (MILLER et al., 2002). Após a internalização nos eritrócitos, o parasito evolui para trofozoíto, jovem, na forma de anel, desenvolve-se e posteriormente, ocorre divisão do núcleo, dando origem aos esquizontes. Estes amadurecem e passam a ter um número variável de núcleos que, nesse estágio, recebem o nome de rosácea ou merócito. Completada a

17 4 esquizogonia eritrocítica, o eritrócito rompe-se liberando os merozoítos, que invadem outros eritrócitos, reiniciando o ciclo. Cada parasito maduro é capaz de produzir em torno de 20 merozoítos. Após sucessivas esquizogonias, um número pequeno de merozoítos evolui para gametócitos (masculino e feminino), que permanecem envolvidos pela membrana dos eritrócitos até serem ingeridos pelos mosquitos. Depois de ingeridos por espécies de Anopheles susceptíveis, os gametócitos dão início ao ciclo sexuado do parasito e, quando maduros, rompem-se liberando os esporozoítos. Estes podem permanecer ativos por cerca de dois meses nas células das glândulas salivares dos mosquitos, até serem injetados no homem, no momento do repasto sangüíneo (REISBERG,1997). Figura 1: Ciclo biológico do plasmódio (adaptado de Miller, 2002).

18 5 1.4 EPIDEMIOLOGIA DA MALÁRIA A malária encontra-se amplamente distribuída nas regiões tropicais e subtropicais, em especial nas regiões quentes e pantanosas. Cerca de 40% da população mundial vive em áreas de transmissão e exposta ao risco de contrair a doença. O maior foco de transmissão é a África Subsahariana, onde ocorrem 90% dos casos no mundo. Cerca de 101 países são considerados endêmicos, comportando 112 áreas endêmicas, todas localizadas na área tropical. A maioria dos países da África, América do Sul, América Central, Ásia e Oceania são os mais acometidos pela doença (Roll Back Malaria-WHO, 2003). A malária é uma doença infecciosa que apresenta grande impacto no desenvolvimento social e econômico da população, representando importante e grave problema de saúde pública em inúmeras regiões do mundo. Países com alta transmissão têm seu crescimento econômico diminuído em torno de 1% a 3% a cada ano (Roll Back Malaria-WHO, 2003). Estima-se que sua ocorrência no planeta fique próxima dos 500 milhões de casos (mais de 5% da população mundial), com 1,5 a 2,7 milhões de óbitos anuais. Cerca de 90% desses óbitos ocorrem na África e as crianças com idade inferior a cinco anos são as mais atingidas. (Roll Back Malaria-WHO, 2003) Na Amazônia A história da endemia malárica na Amazônia está diretamente relacionada ao ambiente natural, onde as condições climáticas e ecológicas, com altas temperaturas, umidade, grande potencial hídrico e topografia do solo, contribuem e favorecem a evolução, manutenção e reprodução de parasitos e vetores (MARQUES, 1994). A situação econômica, social, hábitos e condições de vida contribuem para menor ou maior exposição aos riscos de infecção. No Brasil, a malária encontra-se basicamente concentrada na região Amazônica, sendo compreendida pelos estados do Acre, Amapá, Amazonas, Maranhão, Mato Grosso, Pará, Rondônia, Roraima e Tocantins. Em 2003 esta região registrou casos de malária, cerca de 99,7%, dos registros de malária do país (FUNASA, 2003). A grande extensão de seu território, com regiões de difícil acesso, baixa densidade demográfica, processo migratório de grupos populacionais da própria região, da área rural para o espaço urbano, grande número de habitações

19 6 rudimentares, entre outros, são obstáculos que dificultam as operações de combate e controle da doença na região amazônica. Nessa área, a expansão de projetos agropecuários, colonização e mineração também favorecem a manutenção e disseminação da doença (MARQUES, 1994; SOUZA, 1997). Dados epidemiológicos da Fundação Nacional de Saúde (FUNASA) demonstram que, durante o período de 1995 a 1999, o estado do Amazonas apresentou um significativo aumento na incidência de casos de malária, passando de para no referido período. Vale ressaltar que no ano de 1999 foi registrado o maior número de casos de malária de toda história da endemia malárica no Amazonas (FMTAM/FUNASA, 2004). Em 2000 ocorreu uma redução da doença, sendo registrados nesse ano casos de malária no Estado. Manaus contribuiu com casos, dos quais por P. falciparum, por P. vivax e 280 infecções mistas. No ano de 2001 foram registrados casos de malária. Em 2002, o número de diagnósticos positivos foi de Deste total, estavam concentrados na cidade de Manaus, sendo infecções causadas por P. falciparum, por P. vivax e 50 infecções mistas (FMTAM/FUNASA, 2004). De 2002 a 2003 a região da Amazônia Legal registrou aumento de 15,3% dos casos de malária. E no ano de 2003 o Amazonas quase duplicou o número de casos de malária em relação ao ano anterior. Foram registrados casos, sendo , mais da metade, oriundos de Manaus. Neste ano o P. falciparum foi responsável por casos, o P. vivax por e 249 registros de infecção mista (SANDOVAL et al., 2004; FMTAM/FUNASA, 2004). Segundo dados da 5ª Reunião de Avaliação do Programa de Controle da Malária, o crescimento da doença no estado do Amazonas foi de 11,2%, no período de janeiro a maio de 2004, com queda de 10% na capital, onde se concentraram cerca de 40% do total de casos (Secretaria de Estado de Saúde, 2004). O P. vivax é a espécie responsável pelo maior número de adoecimentos no estado do Amazonas. Em 2002 representou 82,81% dos casos de malária, cabendo ao P. falciparum 16,62% dos diagnósticos positivos. Na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (FMTAM) foram notificados casos de malária, sendo por P. vivax e 992 por P. falciparum. Deste total, 410 pacientes foram internados, 301 com malária vivax e 109 com falciparum. Em 2003 a FMTAM notificou casos, dos quais casos por P. vivax, por P. falciparum

20 7 e 125 casos de infecção mista. Neste mesmo ano a FMTAM internou 789 pacientes com malária vivax e 190 com malária falciparum (FMTAM, 2003). A malária causada pelo P. falciparum é considerada a forma mais grave, porém, a gravidade e complicações clínicas causadas pelo P. vivax, embora não muito comuns já são relatadas na literatura (Alecrim, 2000). Decorrente dessas manifestações o P. vivax tem liderado a causa de internação na FMTAM. 1.5 DIAGNÓSTICO DA MALÁRIA O diagnóstico laboratorial da malária, tradicionalmente realizado pelo método da gota espessa, consiste na identificação dos parasitos no sangue periférico do doente por meio da microscopia óptica. O aperfeiçoamento da microscopia e a introdução de corantes biológicos que permitem identificar a espécie, estágio de desenvolvimento, viabilidade e quantificação do parasito, tornam o método simples, rápido, com sensibilidade e especificidade em torno de 80% e 90%, respectivamente. Na rotina, um exame por meio da gota espessa com boa coloração, desemoglobinização correta e microscopista bem treinado, proporciona a detecção de 5-10 parasitos/µl de sangue. Em razão disso, a gota espessa constitui o teste padrão para o diagnóstico da malária (WHO, 1999). Contudo, algumas desvantagens, como a perda de parasitos durante a coloração, baixas parasitemias e qualidade da amostra, devem ser consideradas como fatores que dificultam o diagnóstico através deste método (BRUCE-CHWATT, 1987; FERREIRA e ÁVILA, 1996). Nesse sentido, pesquisas têm sido realizadas para o desenvolvimento de novos métodos laboratoriais para o diagnóstico da malária, contudo, sem desprezar o valor do método convencional da gota espessa, pois ainda é a técnica de escolha para a realidade dos países em desenvolvimento. Nas últimas décadas a Biologia Molecular vem apresentando grandes avanços. Como resultado, técnicas têm sido estudadas para o desenvolvimento de métodos que viabilizem a pesquisa de microorganismos e seu material genético para o diagnóstico de algumas doenças. Como esses agentes possuem suas próprias expressões gênicas, é possível a obtenção de um diagnóstico exato, sensível e específico para um grande número de doenças infecciosas.

21 8 Na década de oitenta, muitos estudos de campo foram realizados utilizando a técnica de hibridização em nitrocelulose para identificar espécies de plasmódio por meio de sondas de DNA. Esta técnica empregada por Barker et al., em 1986, usou sonda de DNA específica para diagnosticar P. falciparum, detectando 10 picogramas de DNA purificado de P. falciparum (equivalentes a 100 parasitos); e em estudos de campo, a técnica detectou aproximadamente 40 parasitos/µl de sangue, usando 50µL de amostra, correspondendo a uma parasitemia de 0,0009%. Na Tailândia, em 1989, Barker et al. utilizaram sondas de DNA para diagnosticar P. falciparum e comparar sua sensibilidade e especificidade com os resultados da microscopia. As lâminas eram preparadas e examinadas por dois técnicos qualificados e a leitura realizada em um mínimo de 100 campos, com densidade parasitária quantificada em 200 leucócitos. A hibridização mostrou sensibilidade favorável em relação à rotina microscópica, detectando menos de 40 parasitos/µl de sangue. Algumas alterações no processo de hibridização melhoraram a sensibilidade e permitiram a detecção de parasitos/µl de sangue. Em busca de maior sensibilidade e especificidade em relação aos métodos já empregados, a técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) vem sendo utilizada para o diagnóstico da malária, uma vez que torna possível diferenciar com segurança todas as espécies de plasmódios, pois a reação amplifica regiões alvo do gene que diferenciam distintamente P. falciparum, P. vivax, P. malariae e P. ovale. 1.6 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Elaborada por Kary Mullis, essa tecnologia tem sido utilizada como uma das mais poderosas ferramentas da biologia molecular (SAIKI et al., 1985). Inúmeros estudos comprovam a melhor sensibilidade, especificidade do método e sua indiscutível utilidade como ferramenta na pesquisa e diagnóstico clínico (WILSON, 1993). Este método é empregado para amplificar seqüências específicas de DNA. A técnica é realizada em termociclador reproduzindo a habilidade natural de replicação do DNA. Esta tecnologia tem as mais diversas e importantes aplicações, dentre elas a pesquisa básica, diagnóstico clínico e genética humana. O DNA genômico em fita dupla, quando submetido ao calor (mais de 90º C), é desnaturado em fitas simples. As pontes de hidrogênio que ligam as bases nitrogenadas entre si são fracas e se rompem a altas temperaturas. Juntamente com

22 9 o DNA desnaturado estão oligonucleotídeos complementares às extremidades 3 do segmento de interesse do DNA-alvo, uma enzima termoestável, como a Taq DNA polimerase e deoxinucleotídeos (dntps). Em seguida, a temperatura é reduzida para 50º-60º C, permitindo que os oligonucleotídeos, que estão em concentração elevada, hibridizem-se às suas seqüências complementares no DNA genômico com alta especificidade. Os oligonucleotídeos hibridizados funcionam como iniciadores (primers). A Taq polimerase estende cada iniciador a partir de sua extremidade 3 por polimerização de dntp, gerando uma fita dupla complementar para cada uma das fitas simples, que se estendem na direção 3 até a extremidade 5 do segmento de DNA que funcionou como molde. Completada a síntese, a solução é aquecida a 95º C, para que se separem as fitas duplas de curta extensão do DNA. As fitas simples tornam-se moldes para outro ciclo de síntese de DNA que se repetem amplificando a seqüência-alvo de interesse, por meio de crescimento exponencial da mesma (Figura 2; LODISH ET AL., 2002). Extensão 72ºC Anelamento 50-60ºC DNA primer Desnaturação 95ºC 2 n n=número de ciclos Figura 2: Esquema da Reação em Cadeia da Polimerase (adaptado de Watson, J. D. et al., 1997). Desde 1990, vários estudos têm sido descritos na literatura mostrando a aplicação da PCR no diagnóstico molecular da malária, sua importância em inquéritos epidemiológicos, na determinação de malária assintomática e monitoramento da resposta terapêutica. Inúmeros relatos têm mostrado que a PCR