UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE FARMÁCIA, ODONTOLOGIA E ENFERMAGEM PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA FILIPE NOBRE CHAVES

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE FARMÁCIA, ODONTOLOGIA E ENFERMAGEM PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA FILIPE NOBRE CHAVES ANÁLISE DA MARCAÇÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DO FATOR INDUZIDO POR HIPÓXIA-1α EM CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORAL E EM LESÕES POTENCIALMENTE MALIGNAS. FORTALEZA 2013

2 FILIPE NOBRE CHAVES ANÁLISE DA MARCAÇÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DO FATOR INDUZIDO POR HIPÓXIA-1α EM CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORAL E EM LESÕES POTENCIALMENTE MALIGNAS. Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Odontologia da Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem da Universidade Federal do Ceará, como um dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Odontologia. Área de Concentração: Clínica Odontológica Orientadora: Profa. Dra. Karuza Maria Alves Pereira FORTALEZA 2013

3 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará Biblioteca de Ciências da Saúde C438a Chaves, Filipe Nobre. Análise da marcação imunohistoquímica do fator induzido por hipóxia-1α em carcinoma epidermóide oral e em lesões potencialmente malignas. / Filipe Nobre Chaves f. : il. color., enc. ; 30 cm. Dissertação (mestrado) Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem. Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Fortaleza, Área de Concentração: Clínica Odontológica. Orientação: Profa. Dra. Karuza Maria Alves Pereira. 1. Subunidade alfa do Fator 1 Induzível por Hipóxia. 2. Neoplasias Bucais. 3. Lesões Pré- Cancerosas. 4. Carcinoma de células escamosas. I. Título. CDD

4 FILIPE NOBRE CHAVES ANÁLISE DA MARCAÇÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DO FATOR INDUZIDO POR HIPÓXIA-1α EM CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORAL E EM LESÕES POTENCIALMENTE MALIGNAS. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Odontologia. Aprovada em: 26 de dezembro 2013 BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Karuza Maria Alves Pereira (Orientadora) Universidade Federal do Ceará UFC campus Sobral Prof. Dr. Fábio Wildson Gurgel Costa Universidade Federal do Ceará UFC Profa. Dra. Roberta Barroso Cavalcante Universidade de Fortaleza - UNIFOR

5 A Deus e a Nossa Senhora, que tem a cada dia renovado minha força para vencer os obstáculos da vida e momentos de cansaço.

6 AGRADECIMENTOS Aos meus pais, Rosangela e Hélder, pela dedicação à nossa família e por demonstrarem, a cada dia, o valor do trabalho. À minha noiva Vilminha, que está comigo em todos os desafios, me fortalecendo e ajudando a vencê-los, além do amor incondicional. Ao meu irmão, Samir, um verdadeiro amigo e confidente. Aos meus familiares, por me darem uma base de pedra perante os ventos da vida, do estudo. Ao meu amigo Paulim, pela ajuda intelectual, estatística e pessoal durante o desenrolar À minha orientadora, Professora Karuza, pelos grandes ensinamentos científicos, pessoais e morais transmitidos. Sou imensamente grato pela sua disponibilidade, palavras de incentivo e ajuda profissional. Ao Professor Fábio, ao qual devo grande parte da minha formação profissional e pessoal. Obrigado pela confiança, oportunidades, além de me dar oportunidade de conhecer cada vez mais essa grande pessoa que você é, um ser humano impecavelmente inteligente, simples e acessível, não medindo esforços para transmitir toda a sua sabedoria. Ao meu irmão Samuel, um verdadeiro amigo, pronto para mover montanhas. À Professora Ana Paula e ao professor Fabrício Bitu, por investir e confiar neste projeto, bem como pelo nosso trabalho diário, formando um forte vínculo entre Laboratório de Patologia Bucodental e Universidade Federal do Ceará campus Sobral. Aos técnicos em anatomia patológica Alceu Machado e Júnior, não apenas pelos impecáveis cortes histológicos e análise imunohistoquímica, mas especialmente pela paciência.

7 À bolsista Sthefane pela ajuda e disponibilidade interminável. Aos colegas e amigos do Laboratório de Patologia Bucodental Artur, Clarissa, Thales, Malena, Carol, Ealber, Mariana, Laryssa, Camila e Erasmo pela amizade, companhia e troca de experiências. Aos bolsistas de iniciação científica Khalil, Larissa e Laís. Sem seu esforço esse trabalho não seria possível. Obrigado por transformar todos os momentos de trabalho de bancada em instantes de alegria e descontração. Ao Programa de Pós-graduação em Odontologia da UFC, Clínica de Métodos Diagnóstico I e II e ao Laboratório de Patologia Bucodental, por me permitir fazer parte e ajudar no crescimento e reconhecimento do serviço. Ao programa REUNI, pela concessão da bolsa de estudos. A Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico FUNCAP, pelo apoio financeiro e por acreditar em nossa pesquisa.

8 Importante é ser feliz

9 RESUMO Introdução: Hipóxia constitui em uma característica comum de tumores sólidos, como em cânceres de cabeça e pescoço, e nessas condições, uma via de sinalização envolvendo um regulador de resposta a oxigênio, chamado de Fator Induzido por Hipóxia-1 (HIF-1) tem-se destacado, na tentativa de permitir uma melhor compreensão sobre a biologia tumoral do câncer. Objetivo: Investigar o papel do HIF-1 em carcinoma epidermóide oral (CEO) e em lesões potencialmente malignas que apresentam displasia epitelial oral (DEO). Métodos: Estudo observacional, analítico e transversal, através do diagnóstico e análise imunomolecular de lesões malignas e potencialmente malignas. Foram incluídos 10 casos biopsiados com diagnóstico histopatológico de CEO e 10 casos de DEO. Utilizou-se a técnica imunohistoquímica da Estreptoavitina-Biotina com o anticorpo HIF-1 (marca Abcam, diluição 1:200, 60 minutos, recuperação antigênica com citrato ph6 Pascal), analisando 05 campos de cada caso no aumento de 400X. O número de células em cada um dos cinco campos foi somado e considerou-se como unidade amostral o percentual de células imunopositivas para HIF-1α conforme marcação nuclear e citoplasmática, bem como intensidade desta última. Os resultados foram obtidos e comparados entre grupos por meio dos testes t de Student e ANOVA multifatorial, seguido do pós-teste de Bonferroni, tomando como base os níveis de significância de 5%. Resultados: Foi observado uma expressão citoplasmática de HIF-1α em 58.4±6.0% das células epiteliais das DEO e em 77.8±3.9% das células dos CEO, com diferença significante (p=0.022). O percentual de células positivas para HIF-1α com marcação nuclear também mostrou diferença significante (p=0.021) entre DEO (0.2±0.1%) e CEO (2.4±0.8). Não houve diferença significante entre o percentual de células com imunomarcação positiva fraca em citoplasma entre DEO e CEO (p=0.337), no entanto, houve aumento significante no percentual de células com marcação citoplasmática moderada (p=0.029) e forte (p=0.031) entre DEO e CEO. Conclusão: Foi observada uma aumento da expressão, nuclear e citoplasmática, de HIF-1α de DEO para CEO, sugerindo seu envolvimento em estágios iniciais da carcinogênese oral. Relevância Clínica: Buscar o entendimento das complexas vias de sinalização, bem como do microambiente tumoral, e diferentes comportamentos biológicos no câncer oral. Palavras-chave: Subunidade alfa do Fator 1 Induzível por Hipóxia. Neoplasias Bucais. Lesões Pré-Cancerosas. Carcinoma de Células Escamosas.

10 ABSTRACT Introduction: Hypoxia is a common feature in solid tumors, such as head and neck cancers, and in these conditions a signaling pathway involving a response regulator oxygen, called hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) we have highlighted in an attempt to provide a better understanding of tumor biology of cancer. Objective: To investigate the role of HIF-1 in oral squamous cell carcinoma and premalignant lesions presenting oral epithelial dysplasia. Methods: Observational, analytical and cross through the diagnosis and immuno-molecular analysis of malignant and premalignant lesions. 10 biopsied cases with histopathological diagnosis of the CEO and DEO 10 cases were included. It was used the technique of immunohistochemistry Estreptoavitina-Biotin with HIF-1 antibody (Abcam mark, 1:200 dilution, 60 min ph6 citrate antigen retrieval Pascal) analysis of 05 fields each case at 400X magnification. The number of cells in each of five fields was added and the sample was considered as a unit the percentage of positive cells immuno-hif-1α nuclear and cytoplasmic as well as intensity thereof. The results were obtained and compared between groups by the Student and multifactor ANOVA followed by Bonferroni post-test t test, based on the significance levels of 5%. Results: Cytoplasmic expression of HIF-1α was observed in 58.4 ± 6.0% of the epithelial cells of the DEO and 77.8 ± 3.9% of the cells of the CEO, with a significant difference (p = 0.022). The percentage of cells positive for HIF-1α nuclear staining also showed significant difference (p = 0.021) between DEO (0.2 ± 0.1%) and CEO (2.4 ± 0.8). There was no significant difference between the percentage of cells with weak positive immunostaining in the cytoplasm between DEO and CEO (p = 0.337), however, a significant increase in the percentage of cells with moderate cytoplasm staining (p = 0.029) and strong (p = 0.031) between DEO and CEO. Conclusion: One increasing the expression, nuclear and cytoplasmic HIF-1α DEO to CEO was observed, suggesting their involvement in the early stages of oral carcinogenesis. Clinical Relevance: Seek understanding of the complex signaling pathways, as well as the tumor microenvironment, and different biological behaviors in oral cancer. Keywords: Hypoxia-Inducible Factor-1α, Alpha Subunit. Mouth Neoplasms. Precancerous Condition. Carcinoma, Squamous Cell.

11 LISTA DE ILUSTRAÇÕES FIGURA 1 - Mecanismo de ação do fator induzido por hipóxia-1 (HIF-1) em ambientes normóxico e hipóxico FIGURA 2 - Percentual de Células Epiteliais Imuno-marcadas por HIF-1α em Citoplasma FIGURA 3 - Percentual de Células Epiteliais Imuno-marcadas por HIF-1α em núcleo FIGURA 4 - Percentual de Células Epiteliais Imuno-marcadas Qualitativamente por HIF-1α em Citoplasma FIGURA 5 - Percentual de Células Epiteliais Imuno-marcadas por HIF-1α em Citoplasma por Gênero FIGURA 6 - Percentual de Células Epiteliais Imuno-marcadas Qualitativamente por HIF-1α em Citoplasma por Gênero FIGURA 7 - Percentual de Células Epiteliais Imuno-marcadas por HIF-1α em Nucleo por Gênero FIGURA 8 - Detecção da expressão do Fator Induzido por Hipóxia-1 (HIF-1α) em espécimes de displasia epitelial oral (DEO) FIGURA 9 - Detecção da expressão do Fator Induzido por Hipóxia-1 (HIF-1α) em espécimes de carcinoma epidermóide oral (CEO)... 50

12 LISTA DE TABELAS TABELA 1 - Perfil de Imunomarcação por HIF-1α mediante caracterização por localização topográfica da peça de biópsia... 42

13 LISTA DE ABREVIATURAS ARNT bhlh CEO CSC DEO DNA EPO Arylhidrocarbon-receptor translocador nuclease Basic helix-loop-helix Carcinoma epidermóide oral Células tronco cancerígenas Displasia epitelial oral Ácido desoxirribonucleico Eritropoietina GLUT-1 Transportador de glicose - 1 HIF HPV HRE INCA LPM PCNA pvhl VEGF Fator induzido por hipóxia Papilomavirus Humano Complexo de resposta a hipóxia Instrituto Nacional de Câncer Lesões potencialmente malignas Antígeno de proliferação nuclear Proteína supressora tumoral de von Hippel-Lindau Fator de crescimento vascular endotelial

14 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO GERAL Fator Induzido por Hipóxia (HIF) 15 2 PROPOSIÇÃO Objetivo Geral Objetivos Específicos CAPÍTULOS CAPÍTULO 1: Análise da marcação imunohistoquímica do Fator Induzido por Hipóxia-1α em carcinoma epidermóide oral e em lesões potencialmente malignas CONCLUSÃO GERAL REFERÊNCIAS ANEXOS... 56

15 13 1 INTRODUÇÃO GERAL Câncer tem sido grande alvo de estudos e investigações científicas por ser uma importante causa de morbidade e mortalidade em todo mundo, sendo, atualmente, considerado como a segunda maior causa de morte no mundo, atrás de mortalidades relacionadas a doenças coronarianas; por isso os fatores relacionados ao câncer apresentam grande relevância em pesquisas científicas. (SCULLY, 2005). Cânceres orais continuam sendo uma doença letal para mais de 50% dos casos diagnosticados anualmente e, em grande parte, isso se deve ao fato de a maioria dos casos serem diagnosticados em estágios avançados da doença (WARNAKULASURIYA, 2009). O CEO representa o sexto câncer mais frequente no mundo, abrangendo uma ampla variação geográfica. Em países de alto risco (Sri Lanka, Índia e Paquistão), câncer oral pode ser a neoplasia maligna mais comum entre homens e contribuir com até 25% de todos os novos casos de câncer (WARNAKULASURIYA, 2010). França, Austrália, Hungria, Espanha, Canadá e Brasil também apresentam altas taxas de incidência de tumores em cavidade oral (WARNAKULASURIYA, 2009). De acordo com o Instituto Nacional do Câncer do Brasil (INCA), em previsão para o ano de 2012, estimou-se novos casos de câncer oral em homens e em mulheres. Esses valores correspondem a um risco estimado de 10 novos casos a cada 100 mil homens e 4 a cada 100 mil mulheres, sendo essa predileção pelo sexo masculino observada na maioria dos países. No Nordeste, excluindo os tumores da pele (não melanoma), o câncer da cavidade oral é o quarto mais comum entre homens (6 casos/100 mil homens) e oitavo mais comum entre mulheres (3 casos/100 mil mulheres). No Ceará, estimam-se 430 novos casos para 2012, estando entre os três estados com maior incidência da região Nordeste, atrás apenas de Bahia e Pernambuco (INCA, 2012a; INCA, 2012b). O Carcinoma Epidermóide Oral (CEO) representa aproximadamente 90% das neoplasias em cavidade oral, apresentando uma etiologia multifatorial. Não há um agente ou fator causador isolado, claramente definido ou aceito, mas tanto fatores extrínsecos quanto intrínsecos podem estar associados (SCULLY, 2005). Agentes químicos (fumo e álcool), físicos (radiação) e infecciosos (vírus oncogênicos) podem alterar a estrutura genética promovendo múltiplas alterações no genoma celular. O acúmulo dessas alterações genéticas, incluindo ativação ou supressão de oncogenes e genes supressores tumorais, leva ao desequilíbrio no ciclo celular, gerando danos ao DNA celular e a perda do controle do ciclo

16 14 de divisão da célula, favorecendo uma instabilidade genética (NAGPAL, 2003). Normalmente, o prognóstico do câncer de boca no Brasil é considerado ruim. Embora a cavidade oral seja facilmente acessível à exploração, o que torna mais fácil a detecção de lesões incipientes, o diagnóstico do câncer oral, em estágio assintomático é incomum (NEVILLE et al., 2009; CARVALHO et al., 2011). CEO apresenta um prognóstico bastante oneroso, sendo observado severas sequelas terapêuticas em decorrência dos tratamentos tardios associados a graves comprometime ntos psíquicos desses pacientes, encorajando pesquisas adicionais sobre fatores que podem modificar a evolução da doença (MASSANO et al., 2006). Apesar dos grandes avanços e descobertas, o prognóstico desse tipo de câncer ainda é pobre, com taxa de sobrevida estimada de 56% em cinco anos (KADEMANI et al., 2005). Desordens potencialmente malignas também estão associadas a carcinogênese oral, sendo que CEOs têm sido documentados em associação ou precedidos por uma lesão potencialmente maligna (LPM). Leucoplasia, eritroplasia, eritroleucoplasia e queilite actínica são as principais desordens envolvidas no surgimento de lesões malignas intraorais (BARNES et al., 2005; WARNAKULASURIYA, 2007). Quando o desfecho de um grande número de lesões potencialmente malignas é revisto, a freqüência de transformação em lesão maligna é maior do que o risco associado a uma mucosa normal ou não-alterada, ressaltando a importância do diagnóstico precoce dessas lesões para o correto tratamento e acompanhamento dessas patologias (WARNAKULASURIYA, 2008). LPMs podem apresentar alterações morfológicas e citológicas que caracterizam um quadro histopatológico de displasia epitelial oral (DEO), o qual demonstra um maior potencial de transformação maligna para CEO quando comparado com o tecido epitelial normal (WARNAKULASURIYA, 2007; SILVEIRA et al., 2009). Histologicamente, as células epiteliais malignas invadem a lâmina própria subjacente, organizadas em ninhos, cordões e/ou lençóis, ou isoladamente. Estas células exibem atipias, tais como: pleomorfismo celular, aumento da relação núcleo/citoplasma, hipercromatismo nuclear, formação de pérolas de ceratina, dentre outras (SCULLY, 2005). Assim, o diagnóstico histopatológico de DEO é considerado um importante indicativo de transformação para CEO (BARNES et al., 2005; BRENNAN et al., 2007; WARNAKULASURIYA, 2007). Carcinoma epidermóide evolui a partir de um complexo processo resultante da exposição a agentes carcinogênicos e inclui várias etapas constituídas de mudanças genéticas, epigenéticas e metabólicas. Exposição crônica a esses agentes levam a instabilidade genética

17 15 nas células epiteliais da mucosa oral, desenvolvimento de lesões potencialmente malignas e, posteriormente, ao carcinoma invasivo. Muitos estudos tem revelado o importante papel desempenhado por proto-oncogenes e genes supressores tumorais durante o curso de evolução do câncer oral (JADOTTE; SCHWARTZ, 2012). Anormalidades afetando proteínas relacionadas à proliferação celular, angiogênese e metástase também tem sido reportadas e relacionadas com o prognóstico do tumor (BRINKMAN; WONG 2006; JADOTTE; SCHWARTZ, 2012). Na prática clínica, o planejamento do tratamento e avaliação do prognóstico para CEO é principalmente baseado no estadiamento tumoral (sistema TNM). No entanto, essa classificação fornece informações limitadas sobre a resposta do tratamento à agressividade biológica e prognóstico (HEO et al., 2012). Portanto, novos marcadores moleculares que buscam prever o prognóstico e a agressividade tumoral devem ser estudados de forma individualizada, procurando estabelecer e definir prognóstico e, assim, buscar alternativas ao tratamento do câncer oral. Esforços tem sido direcionados tanto à descoberta de proteínas e moléculas que funcionam como alvos terapêuticos quanto ao melhor entendimento das vias de sinalização moleculares funcionantes durante a inicialização e progressão tumoral. Estudos recentes evidenciam novos achados sobre câncer de cabeça e pescoço, conduzindo a uma melhor compreensão das características biológicas desses tumores, bem como fornecendo mais opções de tratamento, como novos agentes terapêuticos dirigidos contra múltiplos alvos moleculares (HADDAD et al., 2008). Nesse contexto uma das vias que já vem sendo estudada, inclusive para o CEO, é do Fator Induzido por Hipóxia. 1.1 Fator Induzido por Hipóxia (HIF) O comportamento biológico das neoplasias malignas, incluindo o CEO, é complexo, pois o crescimento e a disseminação do câncer dependem não só da proliferação celular neoplásica, mas também das respostas dos tecidos normais do hospedeiro. É necessário, para tal, que uma variedade de interações ocorra entre as células tumorais, a rede vascular, o sistema imune e o tecido conjuntivo (NAGPAL, 2003). Mais recentemente, tem-se destacado o estudo sobre o metabolismo enérgico das células tumorais, buscando uma melhor compreensão sobre a biologia tumoral do câncer (MORENO-SÁNCHEZ et al., 2007). A carcinogênese oral é um processo complexo e vários genes podem estar alterados. A

18 16 evolução e progressão do carcinoma oral são promovidas por múltiplas alterações celulares e moleculares no epitélio oral. Proteínas geneticamente alteradas podem exercer efeitos importantes nas neoplasias malignas. Mais recentemente, têm-se destacado as proteínas do metabolismo celular (STRYER, TYMOCZO, JEREMY 2004; DEMASI et al., 2010). Hipóxia é uma situação comum nos cânceres, importante nos tumores localmente agressivos, pois com o crescimento tumoral, a lesão rapidamente ultrapassa sua vascularização, gerando déficit de nutrientes e oxigênio, principalmente em tumores sólidos. Lembrando que todas as células do nosso organismo necessitam de oxigênio para exercer sua função metabólica normal, incluindo a fosforilação oxidativa, a capacidade das células cancerosas de adaptação à hipóxia, transitória ou extensa, é essencial para a sobrevivência tumoral (BRAHIMI-HORN; POUYSSÉGUR 2006; RYU et al., 2010; PEREZ-SAYANS et al., 2011; OLIVEIRA; RIBEIRO-SILVA, 2011). CEO é caracteristicamente uma neoplasia localmente agressiva com rápida progressão; nesses tumores, a concentração de oxigênio (O 2 ) é significantemente reduzida. Sugere-se que o caráter invasivo e metastático do CEO esteja relacionado a uma consequência de sua adaptação ao microambiente hipóxico (RYU et al., 2010; ECKERT et al., 2011; PEREIRA et al., 2013). Resposta celular aos níveis de oxigênio é monitorada, em parte, pela atividade transcricional dos fatores induzidos por hipóxia. Nessas condições, uma via de sinalização envolvendo um regulador da resposta ao oxigênio, chamado de Fator Induzido por Hipóxia (HIF), é ativada (BRAHIMI-HORN et al., 2006; HEDDLESTON et al., 2010; SUN et al., 2012). HIF é um fator de transcrição que, em hipóxia, coordena a indução e repressão de vários genes que controlam múltiplas funções celulares tais como angiogênese, metabolismo, invasão/metástase e apoptose/sobrevida celular (BRAHIMI-HORN et al., 2006). O HIF-1 é um fator transcricional que exerce um papel essencial na resposta adaptativa das células em meio à baixa concentração de oxigênio (BRENNAN et al., 2005). Em alguns cânceres, a superexpressão de HIF-1 é associada ao aumento da mortalidade (BRENNAN et al., 2005, ECKERT et al., 2011). Recentemente descoberto, o complexo molecular do HIF-1 consiste em uma base, hélice-alça-hélice-pas, heterodímera composta de duas subunidades, uma alfa (α) e beta (β), a subunidade α não é constitutiva e é sensível ao oxigênio, já a subunidade β, também chamada de ARNT (arylhidrocarbon-receptor translocador nuclease), é expressa constitutivamente na célula, expressando uma proteína de kda. O gene que codifica HIF-1α está localizado no cromossomo 14 (14q21-q24) e sob hipóxia, o núcleo celular gera uma resposta por meio da mensagem transmitida por HIF-1α (BRENNAN et al., 2005;

19 17 ECKERT et al., 2012; PEREIRA et al., 2013). O Fator induzido por hipóxia-1α (HIF-1 α) é um fator de transcrição que exerce um papel na homeostase celular em resposta a hipóxia, desempenhando papel relevante na carcinogênese (HEDDLESTON et al., 2010; KEITH, B. et al., 2011; SUN et al., 2012; PEREIRA et al., 2013), através da sobre regulação de mais de 100 genes envolvidos na adaptação tumoral como no transporte glicolítico, alterando o microambiente tumoral, estabilização de ph, angiogênese e agindo sobre células-troncos cancerígenas (ECKERT et al., 2012; PEREIRA et al., 2013). Tem sido relatado que certos fatores de crescimento (como fator de crescimento endotelial), citocinas (como prostraglandinas E2), e sobre-expressão da proteína ras podem aumentar a expressão de HIF-1α em células tumorais, bem com perda do gene supressor tumoral p53. Além disso, HIF-1α pode controlar a expressão de genes da VEGF e EPO, que possuem capacidade de proliferação e migração de células endoteliais, resultando na promoção da angiogênese e EPO, promovendo o aumento da proliferação e crescimento tumoral. Assim expressão de HIF-1α pode aumentar a progressão câncer bucal através da promoção da angiogênese tumoral e estimulação direta do crescimento de célula tumoral (LIN et al., 2008; PEREIRA et al., 2013). Normalmente, em células bem oxigenadas, a molécula de HIF-1α é hidroxilada através da enzima prolil hidroxilase em resíduos de prolina 402 (Pro-402) e de prolina 564 (Pro-564) (ECKERT et al., 2012). Após hidroxilação, os resíduos de HIF-1α ligam-se a uma proteína supressora tumoral de von Hippel-Lindau (pvhl), que promove a degradação e eliminação do fator através da complexo enzimático ligase E3-ubiquitina (SEMENZA et al., 2010; PEREIRA et al., 2013). Outra possibilidade de inibição do HIF-1α é através do fator de inibição do HIF-1, que hidroxila Asparagina 803 por meio de domínio de transativação e consequentemente bloqueia a ligação de co-ativadores de p300 e CBP (PEREIRA et al., 2013) (Figura 1).

20 18 Figura 1: Mecanismo de ação do fator induzido por hipóxia-1 (HIF-1) em ambientes normóxico e hipóxico. PHD, domínio hidroxilase prolil; PRO 402, prolina 402; pvhl, von Hippel-Lindau supressor de tumor; E3UB, E3 ubiquitina ligase; HRE, elemento de resposta a hipóxia; CA IX, anidrase carbônica IX; VEGF, fator de crescimento endotelial vascular; PDGF-β, derivado de plaquetas growth factor-β; GLUT 1, transportador de glicose 1; CSC, de células-tronco do câncer. Fonte: (PEREIRA et al., 2013). Os HIFs também têm a atividade basal aumentada no compartimento neoplásico. Porém, esse nível de reforço da atividade transcricional ainda não é completamente entendido. O fluxo de tensão de oxigênio utilizado pelas células neoplásicas é consequência de algumas características do meio tumoral, como vascularidade, difusão do oxigênio deficiente em virtude da expansão tumoral e fluxo sanguíneo irregular. Tem sido descrito, também que ciclo constante de hipóxia no tumor permite o reforço do potencial metastático e atividade transcricional do HIF (HEDDLESTON et al., 2010; PEREIRA et al., 2013). Uma variedade de alterações genéticas no interior das células tumorais podem ocorrer sob condições de hipoxia celular. Essas alterações podem ajudar a células tumorais a sobreviverem em um microambiente hipóxico através do aumento da indução ou estabilização do HIF-1α, que é um importante ativador da transcrição de um grande número de genes (KIN

21 19 et al., 2007; PEREIRA et al., 2013). Observa-se que o oxigênio é uma molécula essencial para muitos processos biológicos, como metabolismo, proliferação e sobrevida celular. Hipóxia também está associada com resistência a radioterapia e quimioterapia, e também contribui para manutenção das célulastroncos cancerígenas, bem como promove o estado indiferenciado destas (HEDDLESTON et al., 2010; SUN et al., 2012). Células neoplásicas necessitam e fazem uso da sensibilidade ao oxigênio das proteínas induzidas por hipóxia, representadas pelo HIF, que também mostra uma atividade basal aumentada no compartimento neoplásico. Porém, esse nível de reforço da atividade transcricional ainda não é completamente entendido. Considerando o papel da hipóxia na progressão tumoral e a escassez de estudos utilizando esses marcadores para estes eventos biológicos em DEO e CEO, o propósito desse estudo foi analisar a imunoexpressão do HIF-1α em casos de DOE e CEO, visando contribuir para o entendimento do comportamento biológico do câncer oral, além da busca por marcadores de prognóstico para esta neoplasia.

22 20 2 PROPOSIÇÃO 2.1 Objetivo Geral Analisar a participação do fator induzido por hipóxia-1α (HIF-1α) em casos de carcinomas epidermóides orais, bem como em lesões potencialmente malignas associadas a displasia epitelial oral. 2.2 Objetivos Específicos Avaliar a expressão imunohistoquímica da proteína HIF-1α em carcinomas epidermóides orais; Avaliar a expressão imunohistoquímica da proteína HIF-1α em displasias epiteliais orais; Comparar a expressão imunohistoquímica da proteína HIF-1α entre os casos de displasias epiteliais orais e carcinoma epidermóide oral; Correlacionar a imunoexpressão do HIF-1α segundo sexo, idade e localização; Correlacionar a imunoexpressão do HIF-1α com classificação histopatológica das displasias epiteliais.

23 21 3 CAPÍTULO Esta dissertação está baseada no Artigo 46 do Regimento Interno do Programa de Pós- Graduação em Odontologia da Universidade Federal do Ceará, que regulamenta o formato alternativo para dissertações de Mestrado e teses de Doutorado, e permite a inserção de artigos científicos de autoria ou coautoria do candidato (Anexo A). O projeto de pesquisa foi submetido a apreciação pelo Comitê de Ética em Pesquisa Universidade Federal do Ceará / PROPESQ do Departamento de Medicina Clínica da Universidade Federal do Ceará sob o número do parecer , sendo aprovado em 01/11/12 sob o CAAE: (Anexo B). O participante da pesquisa é convidado como voluntário e esclarecido sobre as informações dos dados e objeto de estudo do referido projeto. Em caso de aceite, é assinado o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo C), que está em duas vias. Uma delas será entregue ao pesquisado e a outra pertence ao pesquisador responsável. Foi ressaltado que em caso de recusa não haverá penalizações nem alteração no plano de tratamento. Foi também fornecido o telefone, para dúvidas, do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Ceará pelo telefone. Assim sendo, esta dissertação é composta por um capítulo contendo um artigo científico que será submetido para publicação no periódico Oral Oncology (Anexo D), conforme descrito abaixo: Immunohistochemistry analysis of hypoxia induced factor-1α in oral squamous cell carcinoma and potentially malignant lesions. Chaves FN, Alves KMA.

24 CAPÍTULO 1: Análise da marcação imunohistoquímica do Fator Induzido por Hipóxia-1α em carcinoma epidermóide oral e em lesões potencialmente malignas. Este artigo seguiu as normas de publicação do periódico Oral Oncology (ISSN ) Autores: Filipe Nobre Chaves Grau acadêmico: Bacharel em Odontologia Posição: Estudante de Mestrado em Odontologia Afiliação institucional: Departamento de Clínica Odontológica, Setor de Diagnóstico Oral, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, Brasil. Karuza Maria Alves Pereira Grau acadêmico: Bacharel em Odontologia, Mestre em Patologia Oral; Doutora em Patologia Oral Posição: Professora Adjunta II da Universidade Federal do Ceará- Campus Sobral Afiliação institucional: Departamento de Clínica Odontológica, Setor de Patologia Oral, Universidade Federal do Ceará campus Sobral, Sobral, Brasil. Autor de Correspondência: Filipe Nobre Chaves Endereço: Rua Ministro Joaquim Bastos, Fátima Fortaleza, Ceará, Brasil. CEP: Telefone Residencial: filipenobrechaves@hotmail.com

25 23 Title page Immunohistochemistry analysis of hypoxia induced factor-1α in oral squamous cell carcinoma and potentially malignant lesions. Filipe Nobre Chaves DDS a *; Karuza Maria Alves Pereira DDS, MSc, PhD b a Postgraduate Student, School of Dentistry, Department of Clinical Dentistry, Federal University of Ceará, Fortaleza, Brazil. b Adjunct Professor, Division of Oral Pathology, School of Dentistry, Federal University of Ceará campus Sobral, Sobral, Brazil Competing interests: None declared Funding: None *Corresponding author.: Filipe Nobre Chaves Rua Alexandre Barauna, 949, Rodolfo Teofilo, , Fortaleza, Ceara, Brazil. Federal University of Ceará, Department of Dental Clinic, School of Dentistry. Phone/Fax: address: filipenobrechaves@hotmail.com

26 24 RESUMO Objetivos: Investigar o papel do HIF-1 em carcinoma epidermóide oral (CEO) e em lesões potencialmente malignas que apresentam displasia epitelial oral (DEO). Materiais e Métodos: Estudo observacional, analítico e transversal, através do diagnóstico e análise imuno-molecular de lesões malignas e potencialmente malignas. Foram incluídos 10 casos biopsiados com diagnóstico histopatológico de CEO e 10 casos de DEO. Realizou estudo imunohistoquímico com anticorpo anti-hif-1α, analisando 05 campos de cada caso no aumento de 400X. O número de células em cada um dos cinco campos foi somado e considerou-se como unidade amostral o percentual de células imuno-positivas para HIF-1α conforme marcação nuclear e citoplasmática, bem como intensidade desta última. Os resultados foram obtidos e comparados entre grupos por meio dos testes t de Student e ANOVA multifatorial, seguido do pós-teste de Bonferroni, tomando como base os níveis de significância de 5%. Resultados: Foi observado uma expressão citoplasmática de HIF-1α em 58.4±6.0% das células epiteliais das DEO e em 77.8±3.9% das células dos CEO, com diferença significante (p=0.022). O percentual de células positivas para HIF-1α com marcação nuclear também mostrou diferença significante (p=0.021) entre DEO (0.2±0.1%) e CEO (2.4±0.8). Não houve diferença significante entre o percentual de células com imunomarcação positiva fraca em citoplasma entre DEO e CEO (p=0.337), no entanto, houve aumento significante no percentual de células com marcação citoplasmática moderada (p=0.029) e forte (p=0.031) entre DEO e CEO. Conclusão: Foi observada uma aumento da expressão, nuclear e citoplasmática, de HIF-1α de DEO para CEO, sugerindo seu envolvimento em estágios iniciais da carcinogênese oral. Palavras-chave: fator induzido por hipóxia-1α, câncer oral, lesões pré-cancerosas, carcinoma de células escamosas

27 25 INTRODUÇÃO O comportamento biológico das neoplasias malignas é complexo, pois o crescimento e a disseminação do câncer dependem não só da proliferação celular neoplásica, mas também das respostas dos tecidos normais do hospedeiro. É necessário, para tal, que uma variedade de interações ocorra entre as células tumorais, a rede vascular, o sistema imune e o tecido conjuntivo [1]. Mais recentemente, tem-se destacado o estudo sobre o metabolismo enérgico das células tumorais, buscando uma melhor compreensão sobre a biologia tumoral do câncer [2]. Hipóxia focal é encontrada na maioria dos tumores sólidos, devido às alterações quantitativas e qualitativas na vasculatura do tumor, que promovem a uma redução local da disponibilidade de oxigênio. Isso constitui uma característica comum de tumores sólidos em câncer de cabeça e pescoço e outros tipos de câncer. Esse meio hipóxico é relevante em tumores localmente agressivos, que apresentam rápido crescimento tumoral que geralmente não são acompanhados pela vascularização ou neoformação vascular e, frequentemente, as células tumorais necessitam de suplementação de nutrientes e oxigênio para realizar seu metabolismo normal [3,4]. Essa baixa concentração de oxigênio estimula uma cascata de vias moleculares, resultando em angiogênese, glicólise e mudanças no ciclo celular. Nestas condições, uma via de sinalização envolvendo um regulador de resposta a oxigênio, chamado de Fator Induzido por Hipóxia (HIF), é ativada [3,5,6]. O Fator Induzido por Hipóxia-1 (HIF-1) é um fator transcricional que exerce um papel essencial na resposta adaptativa das células em meio à baixa concentração de oxigênio [3,6]. Quando ativado, HIF-1 pode induzir a transcrição de mais de 60 genes, como uma tentativa de evitar a morte celular pela hipóxia tumoral, importantes na proliferação celular e para a carcinogênese [4]. A expressão de HIF-1α pode, portanto, fornecer informações valiosas para informar a escolha do tratamento ou para avaliar o prognóstico [6], sendo considerado um

28 26 marcador de prognóstico tumoral para CEOs [7]. Diante da escassez de estudos evidenciando o papel do HIF-1 na biologia tumoral do câncer de boca, o presente estudo busca analisar a participação do HIF-1α em Carcinomas Epidermóides Orais, bem como em Lesões Potencialmente Malignas que apresentam graus histopatológicas com característica de Displasias Epiteliais Orais, visando contribuir para o melhor entendimento da carcinogênese oral. MATERIAIS E MÉTODOS O presente trabalho consistiu em um estudo observacional e prospectivo, analítico e transversal, através do diagnóstico e análise imuno-molecular de lesões malignas e potencialmente malignas. A população do estudo envolveu todos os espécimes cirúrgicos oriundos de lesões malignas (carcinomas epidermóides orais) e potencialmente malignas (que apresentem graus histopatológicos de displasias epiteliais) de pacientes atendidos no Ambulatório de Estomatologia / Métodos de Diagnóstico da Universidade Federal do Ceará - Campus Sobral durante o período de dezembro de 2012 a dezembro de Foram incluídos casos biopsiados com diagnóstico histopatológico de CEO e DEO, cujo os espécimes tenham quantidade suficiente de material disponível nos blocos de parafina para análises morfológica e imunohistoquímica. Foram excluídos da amostra os casos que apresentaram quantidade insuficiente de material emblocado em parafina para estudo morfológico e amostras com material insuficiente para realização da análise imunohistoquímica. Os casos em que os pacientes não permitiram a realização da pesquisa, bem como pacientes sem autorização do responsável também não foram incluídos na pesquisa. A amostra foi dimensionada para proporcionar um poder de 80% e uma confiança de 95% para detectar diferença imunohistoquímica (expressão dos marcadores estudados) relevante entre os grupos de pacientes com lesões bucais.

29 27 Dados prévios [7], [8], [9] e [10] foram utilizados, e para que tais requisitos sejam satisfeitos, o tamanho da amostra foi calculado em 10 casos de CEO e 10 casos de DEO. A esse valor, já foi avaliado 20% para suprir eventuais perdas, de modo que o tamanho final da amostra foi estimado em 20 pacientes. Amostra pode ser elevada em virtudo do número de casos observdaos na população do ESTUDO (do período já mencionado - 12/11 a 12/13) Essa pesquisa foi submetida à apreciação e aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa Universidade Federal do Ceará / PROPESQ do Departamento de Medicina Clínica da Universidade Federal do Ceará. Análise Imunohistoquímica Parte do tecido coletado emblocado em parafina foi utilizado para a confecção de lâminas, referentes aos casos selecionados. Estas foram avaliadas à microscopia de luz através de cortes histológicos de 5μm de espessura, corados pela técnica de Hematoxilina/Eosina (H/E), para o diagnóstico histopatológico e imuno-histoquímico. Após a confirmação diagnóstica, os espécimes foram novamente submetidos a cortes 5 μm de espessura e montados em lâminas de vidro previamente preparadas com adesivo à base de organosilano (3- aminopropyltriethoxi-silano, Sigma Chemical Co, St Louis, MO, USA). Os cortes foram submetidos ao anticorpo anti HIF-1α pela técnica imunohistoquímica da estreptoavidina-biotina (Labeled StreptAvidin Biotin LSAB). Esta consistiu resumidamente nos seguintes passos: as secções passaram por dois banhos em xilol, durante dez minutos cada. Em seguida, foram imersas em três passagens de álcool absoluto, sendo posteriormente lavadas em água corrente e, logo após, uma passagem em água destilada. A recuperação antigênica foi realizada com citrato ph 6.0, por 30 minutos a 99 o C. À temperatura ambiente, as secções foram mergulhadas em uma solução de bloqueio de peróxido de hidrogênio a 3% durante 10 minutos. Em seguida, realizou-se a incubação com o anticorpo monoclonal de coelho anti HIF-1 alpha (clone EP1215Y, Abcam, Cambridge,

30 28 MA, USA) por 60 minutos à Temperatura Ambiente (TA), na diluição de 1:200, e, posteriormente, lavadas com solução de tampão fosfato-salino, PBS (phosphate buffered saline). As amostras foram incubadas com o anticorpo secundário LSAB Kit (DAKO, Carpinteria, CA, USA) por 10 minutos à TA. Em seguida, foi feita a incubação em solução cromógena preparada com DAB, durante 10 minutos em câmara escura (DAKO, Carpinteria, CA, USA). Posteriormente, os espécimes foram lavados em água corrente e, em seguida, com água destilada. A contracoloração foi realizada com hematoxilina e depois foram desidratados em álcool e diafanizadas em xilol. Por fim, foi realizado a montagem em lâminas de vidro, as quais foram examinadas em microscópio óptico NIKON Eclipse E200. Como controle positivo, utilizaram-se carcinomas de fígado e pulmão, paralelamente ao controle interno por linfócitos, paralelamente às secções incubadas, foi realizado o controle negativo, excluindo-se a aplicação do anticorpo primário. Análise do padrão de marcação imunohistoquímica e de marcação quantitativa O parâmetro de positividade da marcação imunohistoquímica do antígeno em todos os espécimes incluídos na amostra consistiu nas células que exibiram coloração acastanhada em núcleo ou citoplasma, independentemente da intensidade da imunomarcação. Foram selecionados aleatoriamente cinco campos, no aumento de 400x, visualizando-se através do microscópio óptico supracitado, e fotografados em câmera digital SONY Cyber-shot DSC- H10 de 8,1 megapixeis, com zoom óptico 10x em máxima resolução. A análise quantitativa da expressão do anticorpo HIF-1α foi realizada através da contagem do número de células imunomarcadas. Essa contagem, em valores absolutos, foi realizada em células imunomarcadas dos casos de lesões potencialmente malignas que apresentavam microscopicamente graus de displasias epiteliais oral e nos casos de carcinomas

31 29 por um único observador, previamente calibrado, em momentos distintos, através do programa Image J (Image and Processing Analysis in Java Rasband, W.S., ImageJ, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, ). Na avaliação da qualidade de imunomarcação, foram atribuídos escores de acordo com o padrão de marcação imuno-histoquímico positivo, sendo o valor atribuído de acordo com a razão média entre a quantidade de células imunopositivas sobre o total de células contadas, modificado de [11], na qual a intensidade da imunomarcação foi descrita e dividida em: fraca imunomarcação (1), moderada (2) e intensa imunomarcação (3). O número de células em cada um dos cinco microcampos foi somado e considerou-se como unidade amostral o percentual de células imunopositivas para HIF-1α conforme marcação nuclear e citoplasmática, bem como intensidade desta última. Análise estatística Os dados categóricos (sexo) foram analisados por meio do teste Exato de Fisher e os dados quantitativos foram submetidos ao teste de normalidade de Kolmogorov-Smirnov, expressos em forma de média ± erro-padrão da média (dados paramétricos) e comparados entre grupos por meio dos testes t de Student e ANOVA multifatorial seguido do pós-teste de Bonferroni. Adotou-se índice de significância p < 0.05 para todas as avaliações, realizadas no software GraphPad Prism versão 5.0 para Windows. RESULTADOS Um total de 20 casos foi obtido neste estudo, sendo 10 amostras de CEO e 10 amostras de displasias. Destes, 11 eram homens e 9 mulheres; igualmente distribuídos em ambos os grupos (DEO: 5 homens e 5 mulheres / CEO: 6 homens e 4 mulheres) (p=1.000). A

32 30 média de idade geral foi de 63.1±2.8 anos, sem diferença significante entre os dois grupos de estudo (DEO: 61.7±4.0 e CEO: 64.9±3.9 anos, p=0.585). Com relação ao perfil de imuno-marcação para HIF-1α, pôde-se observar que 58.4±6.0% das células epiteliais das displasias e 77.8±3.9% das células dos CEO avaliados mostraram imuno-marcação citoplasmática positiva, com diferença significante entre os dois grupos de estudo (p=0.022) (Figura 2). O percentual de células positivas para HIF-1α com marcação nuclear também mostrou diferença significante entre os grupos de DEO (0.2±0.1%) e CEO (2.4±0.8) (p=0.021) (Figura 3). Não houve diferença significante entre o percentual de células com imunomarcação positiva fraca em citoplasma entre DEO (34.5±2.1%) e os CEOs (30.5±3.6%) (p=0.337); no entanto, houve aumento significante no percentual de células marcadas com intensidade moderada no CEO (31.5±3.8%) em relação às displasias (17.7±4.2%) (p=0.029), bem como com intensidade forte (17.3±4.6% e 5.4±2.3%, respectivamente) (p=0.031) (Figura 4). O percentual de imunomarcação citoplasmática para HIF-1α não mostrou associação com os sexos masculino (DEO: 64.0±9.2% e CEO: 69.7±11.9%) e feminino (DEO: 54.7±8.1 e CEO: 76.5%) (p=0.350) (Figura 5). Quanto ao sexo, o percentual de imunomarcação citoplasmática fraca no sexo masculino (DEO: 35.6±3.8 e CEO: 23.3±4.0%) e no sexo feminino (DEO: 33.5±2.2% e CEO: 35.2±4.5%) não apresentaram diferenças significatica (p=0.093). Da mesma forma, o sexo não influenciou de forma significante o percentual de imunomarcação citoplasmática moderada, onde o sexo masculino DEO: 20.4±6.7 e CEO: 26.3±7.6%) apresentou imunomarcação sem diferença significativa em relação ao sexo feminino (DEO: 15.0±5.7 e CEO: 31.6±4.8%) (p=0.398). O perfil de percentual de células com imunomarcação citoplasmática forte também não mostrou diferença entre DEO e CEO mediante análise do sexo (p=0.415), sendo que o homens apresentaram uma imunoexpressão de 8.4±3.8% e 20.0±8.4%, em displasias e carcinomas respectivamente, e as mulheres

33 31 apresentaram uma imunomarcação de 6.2±4.0% e 9.7±4.2% em displasias e carcinomas respectivamente (Figura 6). Por outro lado, o percentual de imunomarcação nuclear para HIF-1α em homens mostrou aumento significante nos CEO (5.5±1.6%) em relação às DEO (0.1±0.1%) quando comparado ao aumento da imunomarcação nuclear nos CEO (1.2±0.5%) em relação às displasias (0.2±0.2%) de mulheres (p=0.003) (Figura 7). Com relação ao perfil de imunomarcação mediante localização topográfica, os dados se encontram dispostos na Tabela 1. DISCUSSÃO O Fator Induzido por Hipóxia-1 (HIF-1) é um fator transcricional que exerce um papel essencial na resposta adaptativa das células em meio à baixa concentração de oxigênio. Consiste em um complexo heterodimérico de transcrição que funciona como um reguladormestre da homeostase de oxigênio e é passível de sofrer mudanças conformacionais em resposta a diferentes concentrações de oxigênio [3,6,12]. O complexo transcricional HIF-1 consiste em duas subunidades, a subunidades α e β, que dimerizam para formar o complexo HIF-1. A subunidade HIF-1β, também conhecida como aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator ou ARNT, é expressa constitutivamente e está presente no núcleo celular. Já a subunidade HIF-1α, presente no citoplasma celular, é sensível ao oxigênio e têm como função o transporte da mensagem de hipóxia ao núcleo celular promovendo a geração de uma resposta celular ao meio de baixa concentração de oxigênio [5,12,13,14]. Ambas subunidades α e β consistem em uma base helix-loop-helix (bhlh) e PER-ARNT-SIM (PAS) de domínio, como bhlh e PAS, contendo factores de transcrição que mediam a ligação de DNA e a dimerização. O gene que codifica HIF-1α está localizado no cromossomo 14 (14q21-q24) [12,13].

34 32 Normalmente em células bem oxigenadas, HIF-1α é hidroxilada através da enzima prolil hidroxilase em resíduos de prolina 402 (Pro-402) e prolina 564 (Pro-564) [12,14]. Após hidroxilação, os resíduos de HIF-1α ligam-se a proteína supressora tumoral, o ligante von Hippel-Lindau (pvhl), que promove sua degradação através do complexo enzimático da E3- ubiquitina [12,15]. Outra possibilidade de inibição do HIF-1α é através do fator de inibição do HIF-1, que hidroxila Asparagina 803 por meio de domínio de transativação e consequentemente bloqueia a ligação de co-ativadores de p300 e CBP [14]. Em resposta à hipóxia tumoral, HIF-1α é ativado e translocado para o núcleo celular, onde dimeriza com HIF-β, recrutas co-ativadores p300/cbp e induz a expressão dos seus alvos transcricionais através da ligação a elementos que formam um complexo de resposta a hipóxia (HRE), que estão presentes no promotor ou regiões potenciadoras do HIF-1 genes alvo [12,13,16]. O papel do HIF-1α na cacinogênese se dá pelo transporte da mensagem de hipóxia ao núcleo celular, que promove uma resposta ao estresse hipóxico ao atuar no controle de mais de 100 genes envolvidos na adaptação tumoral, como o transporte glicolítico e relacionados à alteração do microambiente tumoral, por meio da ação na estabilização de ph e angiogênese [12,17,18,19]. A expressão/superexpressão de HIF-1α é comumente encontrada numa variedade de neoplasias malignas, incluindo várias neoplasias extra-gnáticas, como no carcinoma renal [20], de bexiga [21], em trato digestivo [22], câncer de mama [23], em ovário [24], do endométrio [25], do colo do útero [26], e em câncer de cabeça e pescoço [27]. Assim, o HIF- 1α pode consistir em um biomarcador de certos tipos de malignidades humanas e pode desempenhar um papel importante na carcinogênese humana. Eckert et al. [7] estudaram o HIF-1α e o Transportador de Glicose-1 (GLUT-1) em carcinomas epidermóides, através da imunohistoquímica, na qual evidenciaram elevada

35 33 expressão dessas proteínas, além de sugerirem que uma superexpressão de HIF-1 possa estar associada a um pior prognóstico, implicando que HIF-1 possa ser utilizada como marcador de prognóstico tumoral. A análise imunohistoquímica do presente estudo demonstrou imunomarcação de HIF- 1α em todos os casos de CEO e de DEO, condizente com alguns trabalhos que obtiveram 100% de expressão positiva em todos os casos de CEO analisados, como no estudo de [17] e [28], e diferindo do trabalho de [7] no qual não foi observada imunomarcação em 13,4% dos espécimes, mesmo assim, ainda persistindo em uma porcentagem significante dos casos, indicando que o HIF-1α está envolvido no processo da carcinogênese. A imunoexpressão de HIF-1α em CEO foi de 77.8%, um valor próximo ao encontrado em estudos semelhantes, como o estudo de [7] (86,6%) e [8] (63,5%). Já a Imunoexpressão de HIF-1α em DEO foi de 58.4%, valor próximo ao de [17], onde 67% das células apresentaram imunomarcação. Ressaltamos que poucos estudos, apenas o estudo de [17], avaliam a expressão de HIF-1α em DEO e CEO, dificultando a comparação entre os dados. O presente estudo apresenta uma análise diferente da expressão de HIF-1α, na qual a imunoexpressão é observada quantitativamente e qualitativamente no citoplasma e no núcleo célular. Na literatura, encontramos trabalhos com metodologias diferentes, como o trabalho de Eckert et al. [7] que avaliou apenas a imunomarcação citoplasmática, enquanto Lin et al. [17] considerou apenas a contagem da imunomarcação nuclear. Dessa forma, este estudo procura fornecer mais informações sobre a participação do HIF-1α nos estágios iniciais da progressão tumoral. São escassos na literatura os trabalhos que comparam e avaliam a expressão imunohistoquímica de HIF-1α em carcinomas e displasias epiteliais orais, contudo, a grande maioria dos trabalhos mostram fortes evidências de que carcinomas apresentam uma imunomarcação mais intensa, principalmente marcação nuclear, quando comparado com

36 34 displasias [7,8,17]. Neste estudo, os resultados seguiram o que a literatura relata, sendo evidenciada uma maior imunoexpressão nuclear e citoplasmática (moderada a forte) de HIF- 1α em carcinomas, quando comparados a displasias. Quanto à expressão nuclear do HIF-1α, o presente estudo observou diferença significativa na imunoexpressao entre CEO e DEO (p=0.021), sendo observado um aumento gradual e significativo na expressão nuclear de HIF-1α de DEO para CEO, corroborando com o estudo de Lin et al. [17], que encontrou imunoexpressão nuclear significativamente diferente entre DEO severa e DEO moderada com CEO. Esse significativo aumento da expressão de nuclear displasias para carcinomas sugere que o HIF-1α tenha papel importante em eventos precoces da carcinogênese oral [17]. Contudo, a porcentagem de células com expressão nuclear de HIF-1α foi bem pequena, apenas 2.4±0.8% dos carcinomas e raros casos de displasias (0.2±0.1%), mas corroboram com o trabalho de Koukourakis et al. [29], que também observou uma marcação nuclear em 6% dos casos. Em DEO, a imunomarcação de HIF-1α não se restringiu ao terço médio do epitélio, mas também está presente na camada basal e superficial do epitélio (Figura 8). A expressão nuclear de HIF-1α em amostras de CEO mostrou-se focal ou difusa. Quando focal, a imunomarcação nuclear concentrou-se em áreas circundantes de regiões necróticas, em células tumorais com elevada produção de ceratina e na borda infiltrante tumoral (Figura 9). Essa imunoexpressão de HIF-1α foi mais forte em células adjacentes a áreas de necrose das células tumorais e sugerem a presença de tecido neoplásico induzido por HIF-1α em carcinomas [7]. É destacado que imunoexpressão, principalmente uma forte imunomarcação, de HIF-1α pode estar associado a progressão tumoral, através do estímulo à angiogênese e à estimulação direta de células cancerígenas [17]. Isso porque essa superexpressão é observada sob condições em que as células necessitam de capacitação de energia para seu crescimento e

37 35 proliferação [7,8]. Ressalta-se neste estudo uma diferença significativa (p=0.003) de imunomarcação nuclear de HIF-1α em carcinomas quanto ao sexo, onde o sexo masculino apresentou uma imunomarcação significativamente maior quando comparado ao sexo feminino, possivelmente em virtude da maior incidência de CEO e de fatores de risco associados a esse grupo. Na atual pesquisa, imunomarcação citoplasmática foi diferente entre CEO e DEO, onde foi observado um maior expressão de HIF-1α em carcinomas, semelhantes ao trabalho de Eckert et al. [7]. No presente estudo foram observados que em 77.8±3.9% das células dos CEO apresentavam imuno-marcação citoplasmática positiva, corroborando com Fillies et al. [8], na qual níveis detectáveis de HIF-1α foram encontrados em 63,5%. No presente estudo, a imunoexpressão citoplasmática do HIF-1α foi significativamente diferente entre CEO e DEO (p=0.022). Em CEO a imunoexpressão citoplasmática foi de 77,8%, corroborando com o estudo de Eckert et al. (2011) onde apresentou 86,6% marcação citoplasmática, bem maior que observado no estudo de Koukourakis et al. [29], onde 36% das células tiveram expressão positiva, e de Fillies et al. [8], onde 15,5% das células apresentavam marcação citoplasmática em CEOs. Foi observado um aumento significativo de imunomarcação citoplasmática moderada (p=0.029) e forte (p=0.031) em carcinomas, quando comparados às displasias. Koukourakis et al. [29] relataram que uma forte imunomarcação citoplasmática é um achado tumoral específico e que reflete a regulação das vias de sinalização do HIF. Eckert et al. [7] observaram que a expressão de HIF-1α foi significativamente correlacionada com a taxa de sobrevida, pacientes cujos tumores demonstraram uma alta expressão citoplasmática de HIF- 1α apresentaram uma taxa de sobrevida bem menor quando comparados com imunomarcação fraca.

38 36 Tem sido relatado que certos fatores de crescimento (como fator de crescimento endotelial - VEGF), citocinas (como prostraglandinas E2), e sobre-expressão da proteína ras podem aumentar a expressão de HIF-1α em células tumorais, bem com perda do gene supressor tumoral p53. Além disso, HIF-1α pode controlar a expressão de genes da VEGF e EPO, que possuem capacidade de proliferação e migração de células endoteliais, resultando na promoção da angiogênese e EPO, promovendo o aumento da proliferação e crescimento tumoral. Assim, expressão de HIF-1α pode aumentar a progressão do câncer bucal através da promoção da angiogênese tumoral e estimulação direta do crescimento de célula tumoral [17]. A expressão de HIF-1α exerce efeito significativo na progressão tumoral, e pacientes com elevada expressão de HIF-1α apresentaram uma taxa de sobrevida 3,49 vezes menor quando comparada a neoplasias orais com pouca expressão dessa proteína [18]. Beasley et al. [30] e Fillies et al. [8] propuseram a forte expressão do HIF-1α como um marcador independente para taxa de sobrevida em pacientes com carcinomas de cabeça e pescoço de células escamosas. Santos et al. [4] sugerem a utilização da expressão da proteína HIF-1α como um marcador tumoral de carcinoma de células escamosas para avaliar melhor as opções terapêuticas à mão, especialmente na decisão do tratamento radioterápico pós-operatório e ao estabelecimento de um correto prognóstico afim de evitar recidivas e necessidades de novas intervenções terapêuticas. Adicionalmente, no presente estudo, DEO apresentaram uma rara, mas presente, marcação nuclear, além de elevada imunoexpressão citoplasmática de HIF-1α. Esses achados podem refletir o envolvimento da HIF-1 nos estágios iniciais da carcinogênese [7,8,17]. De acordo com o alto índice de marcação observado no CEO e em DEO, acredita-se que a expressão do HIF-1 possa ser um determinante para o fenótipo tumoral e, portanto, sugere-se que seja um indício de fenótipo maligno com maior potencial de agressividade [7]. Lin et al. [17] analisaram a expressão do HIF-1α em carcinomas epidermóides e

39 37 displasias epiteliais orais e observaram que os casos mais agressivos de CEO tiveram maior expressão do HIF-1α, com correlação significativa entre a elevada expressão nuclear dessa proteína com o tamanho do tumor e metástase para linfonodos regionais. Além disso, a imunoexpressão aumentava entre os casos de displasias para os CEO. Assim, acredita-se que a expressão do HIF-1α pode ser considerada um evento inicial na carcinogênese oral. Em 2009, Uehara et al. [31] estudaram a expressão do HIF-1α e do antígeno de proliferação nuclear (PCNA) em casos de carcinomas orais, encontrando maior índice de marcação do HIF-1α (12,1%) nos pacientes com pior prognóstico e com metástase nos linfonodos regionais. Nesse mesmo estudo, não observaram correlação entre HIF-1 e PCNA. Com base nesses resultados, os autores sugerem que o HIF-1 parece exercer um importante papel nas metástases em linfonodos regionais e pior prognóstico para pacientes com CEO. Um dos papéis do HIF-1α é na carcinogênese e progressão tumoral. Koukourakis et al. [29] observaram que uma superexpressão do HIF-1α está associada a um comportamento mais agressivo de carcinomas orais e a uma elevada resistência ao tratamento radioterápico. Já Keith et al. [19], em análise univariada, observaram que o aumento da expressão de HIF-1α esteve correlacionado a um prognóstico ruim para casos de CEC orais. CEO orais apresentam rápido crescimento local, com potencial significativo de invasão local e metástases. Apesar do tratamento agressivo, a taxa de sobrevida em cinco anos ainda se mantém sombria. O planejamento do tratamento e o prognóstico para o câncer oral são estimados com base no aspecto clínico, por meio do sistema TNM e pelo aspecto histopatológico [32]. No entanto, a classificação TNM é limitada, pois não fornece informações sobre a agressividade biológica e resposta a tratamento, sendo impossível prever com exatidão o prognóstico [32,33]. Portanto, novos marcadores moleculares que possam predizer o prognóstico e a agressividade tumoral necessitam ser estudados, buscando um tratamento individualizado para o câncer de boca e, nesse contexto, o HIF-1α é elencado

40 38 como um marcador que pode contribuir para a identificação de novos prognósticos e fatores preditivos permitindo a adaptação de cirurgia e terapia adjuvante. CONCLUSÃO Como conclusão do estudo, verificou-se que há uma maior expressão, nuclear e citoplasmática, do HIF-1α em carcinomas do que em displasias, sugerindo que a expressão do HIF-1α desempenha um papel importante na carcinogênese oral. Essa proteína pode ser elencada como um possível marcador de progressão tumoral e estar correlacionada com o prognóstico do câncer de cavidade oral. Portanto, sugere-se que a superexpressão dessa proteína seja um indício de malignidade e da apresentação de um prognóstico mais agressivo. No entanto, ainda necessita-se de mais estudos que comprovem essa real associação. RELEVÂNCIA CLÍNICA O Fator Induzido por Hipóxia consiste em um regulador-chave da resposta celular à hipóxia celular e presumivelmente desempenha um papel central no controle do crescimento do tumor. Polimorfismos ou mutações foram recentemente identificados, podendo promover sua maior expressão. A taxa de sobrevida do carcinoma epidermóide oral não mudou significativamente ao longo das últimas décadas. Assim, compreender o desenvolvimento e progressão deste tipo tumoral é fundamental para uma bem-sucedida intervenção terapêutica. Um melhor conhecimento da sua biologia poderia contribuir para a identificação de novos prognósticos e fatores preditivos permitindo a adaptação de cirurgia e terapia adjuvante. Assim, estudos com HIF-1a ajudam a reflectir na adaptação de células tumorais ao meio hipoxico e na sua contribuição para invasão tumoral. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem aos Laboratórios de Patologia Bucal da Universidade Federal do Ceará e ao Laboratório de Histologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do

41 39 Ceará campus Sobral pela colaboração técnica e estrutural para o desenvolvimento dessa pesquisa, e à Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP), pelo auxílio na realização deste trabalho e concessão de bolsa de estudo ao estudante de pós-graduação. REFERÊNCIAS 1. Nagpal JK, Das BR. Oral cancer: reviewing the present understanding of its molecular mechanism and exploring the future directions for its effective management. Oral Oncol 2003;39(3): Moreno-Sánchez R, Rodríguez-Enríquez S, Marín-Hernández A, Saavedra E.. Energy metabolism in tumor cells. FEBS J 2007;274(6): Brahimi-Horn C, Pouysségur J. The role of hypoxia-inducible factor-1 in tumor metabolism growth and incasion. Bull Cancer 2006;93(8):E dos Santos M, Mercante AM, Louro ID, Gonçalves AJ, de Carvalho MB, da Silva EH, da Silva AM. HIF1-alpha expression predicts survival of patients with squamous cell carcinoma of the oral cavity. PLoS One 2012;7(9):e Brennan M, Migliorati CA, Lockhart PB, Wray D, Al-Hashimi I, Axéll T, et al. Management of oral epithelial dysplasia: a review. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2007;103 Suppl:S19.e Zheng Y, Ni Y, Huang X, Wang Z, Han W. Overexpression of HIF-1alpha indicates a poor prognosis in tongue carcinoma and may be associated with tumour metastasis. Oncol Lett 2013;5(4): Eckert AW, Lautner MH, Schütze A, Taubert H, Schubert J, Bilkenroth U. Coexpression of hypoxia-inducible factor-1alpha and glucose transporter-1 is associated with poor prognosis in oral squamous cell carcinoma patients. Histopathology 2011; 58(7): Fillies T, Werkmeister R, van Diest PJ, Brandt B, Joos U, Buerger H. HIF1-alpha overexpression indicates a good prognosis in early stage squamous cell carcinomas of the oral floor. BMC Cancer 2005;5: Dellas K, Bache M, Pigorsch SU, Taubert H, Kappler M, Holzapfel D. Prognostic impact of HIF-1alpha expression in patients with definitive radiotherapy for cervical cancer. Strahlenther Onkol 2008;184(3): Ayala FR, Rocha RM, Carvalho KC, Carvalho AL, da Cunha IW, Lourenço SV, et al. GLUT1 and GLUT3 as potential prognostic markers for Oral Squamous Cell Carcinoma. Molecules 2010;15(4):

42 Ravindran G, Devaraj H. Aberrant expression of CD133 and musashi-1 in preneoplastic and neoplastic human oral squamous epithelium and their correlation with clinicopathological factors. Head Neck 2012;34(8): Pereira KM, Chaves FN, Viana TS, Carvalho FS, Costa FW, Alves AP, et al. Oxygen metabolism in oral cancer: HIF and GLUTs (Review). Oncol Lett 2013;6(2): Kaluz S, Kaluzová M, Stanbridge EJ. Regulation of gene expression by hypoxia: integration of the HIF-transduced hypoxic signal at the hypoxia-responsive element. Clin Chim Acta 2008;395(1-2): Eckert AW, Kappler M, Schubert J, Taubert H. Correlation of expression of hypoxiarelated proteins with prognosis in oral squamous cell carcinoma patients. Oral Maxillofac Surg 2012; 16(2): Semenza GL. Hypoxia-inducible factor 1: regulator of mitochondrial metabolism and mediator of ischemic preconditioning. Biochim Biophys Acta 2011;1813(7): Fraga CA, de Oliveira MV, de Oliveira ÉS, Barros LO, Santos FB, Gomez RS, et al. A high HIF-1α expression genotype is associated with poor prognosis of upper aerodigestive tract carcinoma patients. Oral Oncol 2012;48(2): Lin PY, Yu CH, Wang JT, Chen HH, Cheng SJ, Kuo MY, Chiang CP. Expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha is significantly associated with the progression and prognosis of oral squamous cell carcinomas in Taiwan. J Oral Pathol Med 2008;37(1): Oliveira LR, Ribeiro-Silva A. Prognostic significance of immunohistochemical biomarkers in oral squamous cell carcinoma. Int J Oral Maxillofac Surg 2011;40(3): Keith B, Johnson RS, Simon MC. HIF1alpha and HIF2alpha: sibling rivalry in hypoxic tumour growth and progression. Nat Rev Cancer 2012;12(1): Na X, Wu G, Ryan CK, Schoen SR, Di Santagnese PA, Messing EM. Overproduction of vascular endotelial growth factor related to von Hippel-Lindau tumor suppressor gene mutations and hypoxia-inducible factor- 1a expression in renal cell carcinomas. J Urol 2003;170(1): Theodoropoulos VE, Lazaris ACh, Sofras F, Gerzelis I, Tsoukala V, Ghikonti I, et al. Hypoxia-inducible factor 1a expression correlates with angiogenesis and unfavorable prognosis in bladder cancer. Eur Urol 2004;46(2): Kuwai T, Kitadai Y, Tanaka S, Onogawa S, Matsutani N, Kaio E, et al. Expression of hypoxia-inducible factor-1alpha is associated with tumor vascularization in human colorectal carcinoma. Int J Cancer 2003;105(2): Vleugel MM, Greijer AE, Shvarts A, van der Groep P, van Berkel M, Aarbodem Y. Differential prognostic impact of hypoxia induced and diffuse HIF-1a expression in invasive breast cancer. J Clin Pathol 2005;58(2):172-7.

43 Nakayama K, Kanzaki A, Hata K, Katabuchi H, Okamura H, Miyazaki K, et al. Hypoxiainducible factor 1alpha (HIF-1 alpha) gene expression in human ovarian carcinoma. Cancer Lett 2002;176(2): Sivridis E, Giatromanolaki A, Gatter KC, Harris AL, Koukourakis MI. Association of hypoxia-inducible factors 1alpha and 2alpha with activated angiogenic pathways and prognosis in patients with endometrial carcinoma. Cancer 2002;95(5): Burri P, Djonov V, Aebersold DM, Lindel K, Studer U, Altermatt HJ, et al. Significant correlation of hypoxia-inducible factor-1a with treatment outcome in cervical cancer treated with radical radiotherapy. Int J Rad Oncol Biol Phys 2003;56(2): Katsuta M, Miyashita M, Makino H, Nomura T, Shinji S, Yamashita K, et al. Correlation of hypoxia inducible factor-1a with lymphatic metastasis via vascular endothelial growth factor-c in human esophageal cancer. Exp Mol Pathol 2005;78(2): Mohamed KM, Le A, Duong H, Wu Y, Zhang Q, Messadi DV. Correlation between VEGF and HIF-1alpha expression in human oral squamous cell carcinoma. Exp Mol Pathol 2004;76(2): Koukourakis MI, Giatromanolaki A, Sivridis E, Simopoulos C, Turley H, Talks K, et al. Hypoxia-inducible factor (HIF1A and HIF2A), angiogenesis, and chemoradiotherapy outcome of squamous cell head-and-neck cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2002;53(5): Beasley NJ, Leek R, Alam M, Turley H, Cox GJ, Gatter K, et al. Hypoxia-inducible factors HIF-1alpha and HIF-2alpha in head and neck cancer: relationship to tumor biology and treatment outcome in surgically resected patients. Cancer Res 2002;62(9): Uehara M, Sano K, Ikeda H, Nonaka M, Asahina I. Hypoxia-inducible factor 1 alpha in oral squamous cell carcinoma and its relation to prognosis. Oral Oncol 2009;45(3): Muñoz-Guerra MF, Fernández-Contreras ME, Moreno AL, Martín ID, Herráez B, Gamallo C. Polymorphisms in the hypoxia inducible factor 1-alpha and the impact on the prognosis of early stages of oral cancer. Ann Surg Oncol 2009;16(8): Heo K, Kim YH, Sung HJ, Li HY, Yoo CW, Kim JY, et al. Hypoxia-induced upregulation of apelin is associated with a poor prognosis in oral squamous cell carcinoma patients. Oral Oncol 2012;48(6):500-6.

44 42 TABELAS Tabela I: Perfil de Imunomarcação por HIF-1α mediante caracterização por localização topográfica da peça de biópsia. Citoplasma Percentual de Células imuno-positivas para HIF-1α Citoplasma Citoplasma Núcleo Marcado Marcado Levemente Moderadamente Citoplasma Marcado Fortemente CEO Gengiva (n=1) Palato (n=1) Mucosa Jugal (n=2) 78.6± ± ± ± ±0.6 Língua (n=3) 57.6± ± ± ± ±7.0 DEO Lábio (n=5) 58.2± ± ± ± ±3.8 Assoalho bucal (n=1) Língua (n=1) Palato (n=3) 53.6± ± ± ± ±0.7 Dados expressos em forma de média±epm.

45 43 FIGURAS Figura 2 - Percentual de Células Epiteliais Imuno-marcadas por HIF-1α em Citoplasma: imunomarcação citoplasmática positiva em 58.4±6.0% das DEOs e em 77.8±3.9% dos CEOs, independente da intensidade, com diferença significante entre os dois grupos (p=0.022).

46 Figura 3 - Percentual de Células Epiteliais Imuno-marcadas por HIF-1α em Núcleo: imunomarcação nuclear positiva em 0.2±0.1% das DEOs e em 2,4%±0.8 dos CEOs com diferença significante entre os dois grupos (p=0.021). 44

47 Figura 4 - Percentual de Células Epiteliais Imuno-marcadas Qualitativamente por HIF- 1α em Citoplasma: imunomarcação fraca em citoplasma de 34.5±2.1% das DEO e em 30.5±3.6% de CEOs sem diferença significante entre os dois grupos (p=0.337); imunomarcação moderada em citoplasma de 17.7±4.2% das DEOs e em 31.5±3.8% de CEOs com diferença significante (p=0.029); imunomarcação forte em citoplasma de 5.4±2.3% das DEOs e em 17.3±4.6% dos CEOs com diferença significante (p=0.031). 45

48 Figura 5 - Percentual de Células Epiteliais Imuno-marcadas por HIF-1α em Citoplasma por Gênero: Imunomarcação citoplasmática em sexo masculino (DEO: 64.0±9.2% e CEO: 69.7±11.9%) e em sexo feminino (DEO: 54.7±8.1 e CEO: 76.5%), não foi observada diferença significativa (p=0.350). 46

49 Figura 6 - Percentual de Células Epiteliais Imuno-marcadas Qualitativamente por HIF- 1α em Citoplasma por Gênero: Imunomarcação citoplasmática fraca em DEO (Homens ±3.8% / Mulheres ±2.2%) e em CEO (Homens ±4.0% / Mulheres ±4.5%) não apresentou diferenças significativas entre sexos (p=0.093). Imunomarcação citoplasmática moderada em DEO (Homens ±6.7% / Mulheres ±5.7%) e em CEO (Homens ±7.6% / Mulheres ±4.8%) não foi observado diferença em relação ao sexo (p=0.398). Imunomarcação citoplasmática forte em DEO (Homens - 8.4±3.8% / Mulheres - 6.2±4.0%) e CEO (Homens ±8.4% / Mulheres ±8.4%) não houve diferença entre sexos (p=0.415). 47

50 Figura 7 - Percentual de Células Epiteliais Imuno-marcadas por HIF-1α em Nucleo por Gênero: Aumento significante de imunomarcação nuclear em CEO (5.5±1.6%) com relação à DEO (0.1±0.1%) no sexo masculino quando comparado ao aumento da imunomarcação nuclear em CEO (1.2±0.5%) com relação à DEO (0.2±0.2%) do sexo feminino (p=0.003). 48

51 Figura 8 - Detecção da expressão do Fator Induzido por Hipóxia-1 (HIF-1α) em espécimes de displasia epitelial oral (DEO). (A) DEO exibindo imunomarcação nuclear. (B) DEO evidenciando imunomarcação extensa em células epitelias, exceto na camada basal e parabasal. As células inflamatórias crónicas, como controle interno da reação imunoistoquímica, também apresentaram imunomarcação de HIF-1α. (400x). 13

52 Figura 9 - Detecção da expressão do Fator Induzido por Hipóxia-1 (HIF-1α) em espécimes de carcinoma epidermóide oral (CEO). (A) CEO bem diferenciado exibindo imunomarcação nuclear em numerosas células. (B) CEO moderadamente diferenciado evidenciando imunomarcação nuclear e citoplasmática moderada a forte. As células inflamatórias crónicas, como controle interno da reação imunoistoquímica, também apresentaram imunomarcação de HIF-1α (400x). 14

53 13 4 CONCLUSÃO GERAL Da avaliação dos resultados obtidos, pode-se concluir que: A imunomarcação citoplasmática para HIF-1α em CEO e DEO apresentou diferença significante entre esses dois grupos de estudo, com aumento da imunomarcação em CEO; A imunomarcação nuclear para HIF-1α em CEO e DEO apresentou diferença significante entre esses dois grupos de estudo, com aumento da imuno-marcação em CEO; Não houve diferença significante entre o percentual de células com imunomarcação positiva fraca em citoplasma entre CEO e DEO; Houve aumento significante na imunomarcação citoplasmática moderada e forte de CEO em relação às DEO; O percentual de imunomarcação citoplasmática para HIF-1α não mostrou associação entre os sexos; O percentual de imunomarcação nuclear para HIF-1α em homens mostrou aumento significante nos CEO em relação às DEO quando comparado com a imunomarcação em mulheres.

54 14 REFERÊNCIAS BARNES, L. et al. Pathology & Genetics: Head and Neck Tumours. Lyon: IARC Press, BEASLEY, N.J. et al. Hypoxia-inducible factors HIF-1alpha and HIF-2alpha in head and neck cancer: relationship to tumor biology and treatment outcome in surgically resected patients. Cancer Res., v. 69, n. 9, p , May BRAHIMI-HORN, C.; POUYSSÉGUR, J. The role of hypoxia-inducible factor-1 in tumor metabolism growth and incasion. Bull. Cancer, v.93, n.8, p. E73-80, BRENNAN, M. et al. Management of oral epithelial dysplasia: a review. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod., v.103, p.s19.e1-s19.e12, BURRI, P. et al. Significant correlation of hypoxia-inducible factor-1a with treatment outcome in cervical cancer treated with radical radiotherapy. Int. J. Rad. Oncol. Biol. Phys., v. 56, n. 1, p , DELLAS, K. et al. Prognostic impact of HIF-1alpha expression in patients with definitive radiotherapy for cervical cancer. Strahlenther Onkol., v. 184, n. 3, p , Mar DEMASI, A. P. et al. Glucose transporter protein 1 expression in mucoepidermoid carcinoma of salivary gland: correlation with grade of malignancy. Int. J. Exp. Pathol., v. 91, n. 2, p , Apr DENKO, N. C. Hypoxia, HIF1 and glucose metabolism in the solid tumour. Nat. Rev. Cancer, v. 8, n. 9, p , Sept DOS SANTOS, M. et al. HIF1-alpha expression predicts survival of patients with squamous cell carcinoma of the oral cavity. PLoS One, v. 7, n. 9, p. e45228, ECKERT, A. W. et al. Co-expression of HIF-1alpha and CAIX is associated with poor prognosis in oral squamous cell carcinoma patients. J. Oral Pathol. Med., v. 39, n. 4, p , Apr ECKERT, A. W. et al. Coexpression of hypoxia-inducible factor-1alpha and glucose transporter-1 is associated with poor prognosis in oral squamous cell carcinoma patients. Histopathology, v. 58, n. 7, p , June ECKERT, A. W. et al. Correlation of expression of hypoxia-related proteins with prognosis in oral squamous cell carcinoma patients. Oral Maxillofac. Surg., v. 16, n. 2, p , June FILLIES, T. et al. HIF1-alpha overexpression indicates a good prognosis in early stage squamous cell carcinomas of the oral floor. BMC Cancer, v. 21, n. 5, p. 84, July FRAGA, C.A. et al. A high HIF-1α expression genotype is associated with poor prognosis of upper aerodigestive tract carcinoma patients. Oral Oncol., v. 48, n. 2, p , Feb

55 15 HADDAD, R. I.; SHIN, D. M. Recent advances in head and neck cancer. N. Engl. J. Med., v. 359, n. 11, p , Sept HEDDLESTON, J. M. et al. Hypoxia-induced mixed-lineage leukemia 1 regulates glioma stem cell tumorigenic potential. Cell Death Differ., v. 19, n. 3, p , Mar HEO, K. et al. Hypoxia-induced up-regulation of apelin is associated with a poor prognosis in oral squamous cell carcinoma patients. Oral Oncol., v. 48, n. 6, p , June INCA. Estimativa 2012: Incidência de Câncer no Brasil, 2012a. Disponível em: < Acesso em: 17 dez INCA. Atlas de Mortalidade por Câncer, 2012b. Disponível em: < Acesso em: 28 nov ISHIKAWA, T. et al. Hypoxia enhances CXCR4 expression by activating HIF-1 in oral squamous cell carcinoma. Oncol. Rep., v. 21, n. 3, p , Mar KADEMANI, D. et al. Prognostic factors in intraoral squamous cell carcinoma: The influence of histologic grade. J. Oral Maxillofac. Surg., v. 63, p , KALUZ, S.; KALUZOVA, M.; STANBRIDGE, E. J. Regulation of gene expression by hypoxia: integration of the HIF-transduced hypoxic signal at the hypoxia-responsive element. Clin. Chim. Acta, v. 395, n. 1/2, p. 6-13, Sept KATSUTA, M. et al. Correlation of hypoxia inducible factor-1a with lymphatic metastasis via vascular endothelial growth factor-c in human esophageal cancer. Exp. Mol. Pathol., v. 78, p , KEITH, B.; JOHNSON, R. S.; SIMON, M. C. HIF1alpha and HIF2alpha: sibling rivalry in hypoxic tumour growth and progression. Nat. Rev. Cancer, v. 12, n. 1, p. 9-22, Jan KOUKOURAKIS, M.I. et al. Hypoxia-inducible factor (HIF1A and HIF2A), angiogenesis, and chemoradiotherapy outcome of squamous cell head-and-neck cancer. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., v. 53, n. 5, p , Aug KUWAI, T. et al. Expression of hypoxia-inducible factor-1alpha is associated with tumor vascularization in human colorectal carcinoma. Int. J. Cancer, v. 105, n. 2, p , Jun LI, S. J. et al. Expression of Glut-1 in primary and recurrent head and neck squamous cell carcinomas, and compared with 2-[18F]fluoro-2-deoxy-D-glucose accumulation in positron emission tomography. Br. J. Oral Maxillofac. Surg., v. 46, n. 3, p , Apr LIANG, X. et al. Hypoxia-inducible factor-1 alpha, in association with TWIST2 and SNIP1, is a critical prognostic factor in patients with tongue squamous cell carcinoma. Oral Oncol., v. 47, n. 2, p , Feb

56 16 LIN, P. Y. et al. Expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha is significantly associated with the progression and prognosis of oral squamous cell carcinomas in Taiwan. J. Oral Pathol. Med., v. 37, n. 1, p , Jan LIU, C. J. et al. mir-31 ablates expression of the HIF regulatory factor FIH to activate the HIF pathway in head and neck carcinoma. Cancer Res., v. 70, n. 4, p , Feb LIU, S. Y. et al. Clinicopathologic significance of tumor cell-lined vessel and microenvironment in oral squamous cell carcinoma. Oral Oncol., v. 44, n. 3, p , Mar MASSANO, J. et al. Oral squamous cell carcinoma: Review of prognostic and predictive factors. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod., v. 102, p , MOHAMED, K. M. et al. Correlation between VEGF and HIF-1alpha expression in human oral squamous cell carcinoma. Exp. Mol. Pathol., v. 76, n. 2, p , Apr MORENO-SÁNCHEZ, R. et al. Energy metabolism in tumor cells. FEBS J., v. 274, n. 6, p , MUNOZ-GUERRA, M. F. et al. Polymorphisms in the hypoxia inducible factor 1-alpha and the impact on the prognosis of early stages of oral cancer. Ann. Surg. Oncol., v. 16, n. 8, p , Aug NA, X. et al. Overproduction of vascular endotelial growth factor related to von Hippel- Lindau tumor suppressor gene mutations and hypoxia-inducible factor- 1a expression in renal cell carcinomas. J. Urol., v. 170, n. 1, p , NAGPAL, J.K.; DAS, B.R. Oral cancer: reviewing the present understanding of its molecular mechanism and exploring the future directions for its effective management. Oral Oncol., v.39, p , NAKANO, Y. et al. Oral administration of K inhibits GATA binding activity, enhances hypoxia-inducible factor 1 binding activity, and restores indicators in an in vivo mouse model of anemia of chronic disease. Blood, v. 104, n. 13, p , Dec NAKAYAMA, K. et al. Hypoxiainducible factor 1alpha (HIF-1 alpha) gene expression in human ovarian carcinoma. Cancer Lett., v. 176, n. 1, p , NEVILLE, B.W. et al. Patologia Oral & Maxilofacial. 3. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, OLIVEIRA, L. R.; RIBEIRO-SILVA, A. Prognostic significance of immunohistochemical biomarkers in oral squamous cell carcinoma. Int. J. Oral Maxillofac. Surg., v. 40, n. 3, p , Mar OLIVER, R. J. et al. Prognostic value of facilitative glucose transporter Glut-1 in oral squamous cell carcinomas treated by surgical resection; results of EORTC Translational Research Fund studies. Eur. J. Cancer, v. 40, n. 4, p , Mar

57 17 PEREIRA, K.M., et al. Oxygen metabolism in oral cancer: HIF and GLUTs (Review). Oncol. Lett., v. 6, n. 2, p , RAVINDRAN, G.; DEVARAJ, H. Aberrant expression of CD133 and musashi-1 in preneoplastic and neoplastic human oral squamous epithelium and their correlation with clinicopathological factors. Head Neck, Nov RYU, M. H. et al. Hypoxia-inducible factor-1alpha mediates oral squamous cell carcinoma invasion via upregulation of alpha5 integrin and fibronectin. Biochem. Biophys. Res. Commun., v. 393, n. 1, p , Feb SCULLY, C. Oral cancer; evidence for sexual transmission. Br. Dent. J., v.199, n. 4, p , Aug SILVEIRA, E. J. D. Lesões orais com potencial de malignização: análise clínica e morfológica de 205 casos. J. Bras. Patol. Med. Lab., v.45, n.3, p , SIVRIDIS, E. et al. Tumor and Angiogenesis Research Group. Association of hypoxiainducible factors 1alpha and 2alpha with activated angiogenic pathways and prognosis in patients with endometrial carcinoma. Cancer, v. 95, n. 1, p , SOUSA, F.A.C.G. et al. Alterações gênicas e câncer bucal uma breve revisão. RBPO, v.3, n.1, p.20-25, jan./mar STRYER, L.; TYMOCZO, J. L.; JEREMY, M. Bioquímica. 5. ed. São Paulo: Guanabara Kooogan, SUN, W. et al. Mitochondrial mutations contribute to HIF1alpha accumulation via increased reactive oxygen species and up-regulated pyruvate dehydrogenease kinase 2 in head and neck squamous cell carcinoma. Clin. Cancer Res., v. 15, n. 2, p , Jan THEODOROPOULOS, V.E. et al. Hypoxia- inducible factor 1a expression correlates with angiogenesis and unfavorable prognosis in bladder cancer. Eur. Urol., v. 46, p , UEHARA, M. et al. Hypoxia-inducible factor 1 alpha in oral squamous cell carcinoma and its relation to prognosis. Oral Oncol., v. 45, n. 3, p , Mar VLEUGEL, M.M. et al. Differential prognostic impact of hypoxia induced and diffuse HIF-1a expression in invasive breast cancer. J. Clin. Pathol., v. 58, n. 1, p , ZHENG, Y. et al. Overexpression of HIF-1alpha indicates a poor prognosis in tongue carcinoma and may be associated with tumour metastasis. Oncol. Lett., v. 5, n. 4, p , Apr ZHOU, H. et al. The hypoxia-inducible factor-responsive proteins semaphorin 4D and vascular endothelial growth factor promote tumor growth and angiogenesis in oral squamous cell carcinoma. Exp. Cell Res., May 2012.

58 18 ZHU, G. Q. et al. Hypoxia inducible factor 1alpha and hypoxia inducible factor 2alpha play distinct and functionally overlapping roles in oral squamous cell carcinoma. Clin. Cancer Res., v. 16, n. 19, p , Oct ANEXO A SEGUIMENTO DO REGIMENTO INTERNO

59 19 ANEXO B PARECER CONSUBSTANCIADO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA