AMPLIFICAÇÃO DE DNA CIRCULANTE PARA O DIAGNÓSTICO DA CISTICERCOSE BOVINA

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA UNESP FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA AMPLIFICAÇÃO DE DNA CIRCULANTE PARA O DIAGNÓSTICO DA CISTICERCOSE BOVINA VALERIA APARECIDA MENOSSO Botucatu SP Março 2006

2 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA UNESP FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA AMPLIFICAÇÃO DE DNA CIRCULANTE PARA O DIAGNÓSTICO DA CISTICERCOSE BOVINA VALERIA APARECIDA MENOSSO Dissertação apresentada junto ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, paraobtençãodotítulodemestre. Orientador: Prof. Dr. Germano Francisco Biondi Botucatu SP Março 2006

3 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. E TRAT. DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE Menosso, Valeria Aparecida. Amplificação de DNA circulante para o diagnóstico da cisticercose bovina / Valeria Aparecida Menosso. Botucatu : [s.n.], Dissertação (mestrado) Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia de Botucatu, Universidade Estadual Paulista, Orientador: Prof. Dr. Germano Francisco Biondi. Assunto CAPES: Saúde animal. 2. Cisticercose. 3. Bovino. 4. Reação em Cadeia pela Polimerase. 5. Taenia. 6. Imunodiagnóstico. CDD Palavras chave: Bovinos; DNA; Cisticercose; PCR; Taenia.

4 Dedico, À minha mãe, Diva (in memoriam), por me ensinar que nenhum obstáculo é grande o suficiente para nos impedir de lutar pelo que desejamos; Ao meu pai, Gastão, por despertar em mim meu amor e respeito pela arte da pesquisa.

5 AGRADEÇO, À minha mãe, por tudo o que foi e representa na minha vida, por todo amor, carinho e cafuné, por todos os conselhos, os que eu segui e os que não segui, pelas confissões, pela torcida nas minhas conquistas e afago nas minhas derrotas...te levo para onde vou, dentro do meu coração! Ao meu pai, por todo amor e carinho, pelo exemplo de força, pela compreensão, por me entender, encorajar e apoiar incondicionalmente, por me ensinar a sempre tirar o melhor de tudo. Te amo muito pai! Ao meu irmão, pelas conversas e conselhos: - Mano, aqui não cabe só um abraço!cabem muitos abraços, daqueles aconchegantes, demorados, em que ficamos sem dizer nada, mas sabemos tudo que o outro está sentindo. Sentimentos compartilhados... A toda minha família. Devo a vocês minha vida, tudo o que sou, meus valores. Me ensinaram o significado de uma família unida, de bons sentimentos e de prosseguir batalhando. Amo vocês! Ao meu orientador, Prof. Dr. Germano Francisco Biondi, pela confiança depositada em mim, pelo incentivo, pela compreensão, por ser além de orientador, mas meu amigo! À prof. Dr. Cáris Maroni Nunes, do Dep. de Apoio, Produção e Saúde Animal, da Faculdade de Odontologia de Araçatuba (FOA), pelos desafios, por todo ensinamento compartilhado, pela paciência e por me deixar partilhar da sua família, pela amizade! Ao meu namorado Anoros, pelo amor, dedicação, por me compreender e sempre me apoiar! À amiga Daniela, minha irmã de coração, pelas risadas, pelos devaneios, pelos desabafos, por todos os momentos divididos e vividos juntas, bons e ruins, pela cumplicidade...por sempre poder contar com você!

6 Ao amigo Otávio, pela amizade dedicada, pela sensatez necessária nas horas certas e pelos momentos de descontração durante a residência e o mestrado. Aos amigos do Laboratório de Inspeção de Alimentos FMVZ, Botucatu, pela convivência, pela torcida e pelo auxílio nesta caminhada. Aos amigos do Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular Animal FOA, Laércio, Sérgio, Gustavo, Zanon, Alexéia, Sílvia, Fabiane, Pedro, Lúcia, Erica, Heleno, Valquíria, Henrique, por me receberem tão bem, por todo empenho em me ajudar durante a realização da pesquisa, pelas risadas, pela amizade sincera! Aos amigos pós-graduandos, Kate, Charli e Karina, por dividirmos alegrias, dúvidas e angústias, por caminharmos juntas. A todos vocês: amigos são anjos sem asas. Ao prof. Dr. José Fernando Garcia, pela ajuda e considerações pertinentes para a realização do trabalho. Ao prof. Dr. Francisco Leydson Feitosa e à residente Rita, do Dep. de Clínica, Cirurgia e Reprodução Animal, FOA, pela ajuda e empenho no decorrer da pesquisa. Ao prof. Dr. Emmanuel Dias-Neto, do Instituto de Psiquiatria, Faculdade de Medicina USP, pelas considerações técnicas. Aos funcionários e responsáveis do Frigorífico Vangélio Mondelli Ltda. e Frigorífico Bertin Ltda.; da Fazenda Milk-Mel e da Agropecuária Katayama, e ao médico veterinário Samuel Carvalho de Aragão, pelo auxílio disponibilizando material para a realização da pesquisa. A CAPES, que através do auxílio-bolsa, ajudou na viabilização deste estudo. A Deus, pela minha vida, mas neste caminho, principalmente, por atender meus constantes pedidos por força e me fazer entender que tudo o que acontece em nossa vida faz parte do nosso aprendizado! A todos os que me ajudaram, tornando possível a realização desta pesquisa!

7 Todo o nosso conhecimento se inicia com sentimentos. Leonardo da Vinci

8 LISTA DE QUADROS Página QUADRO 1: Oligonucleotídeos iniciadores segundo a seqüência e sentido. 29 QUADRO 2: Reagentes da PCR para oligonucleotídeos iniciadores HDP2. 31 QUADRO 3: Reagentes da PCR para oligonucleotídeos iniciadores TAE. 31 QUADRO 4: Reagentes da PCR para oligonucleotídeos iniciadores SCAR K e SCAR G. 32

9 LISTA DE TABELAS Página TABELA 1: Resultados da avaliação do limiar de detecção da técnica de PCR segundo o par de oligonucleotídeos iniciadores testado e o parasita avaliado em Tampão Tris EDTA (TE). 38 TABELA 2: Resultados da avaliação do limiar de detecção da técnica de PCR segundo o par de oligonucleotídeos iniciadores testado e a fração de amostra de sangue experimentalmente contaminada com DNA de Taenia saginata. 45

10 LISTA DE FIGURAS Página FIGURA 1: Ciclo de vida da Taenia saginata em bovinos e humanos. (Fonte: 12 FIGURA 2: Fluxograma da colheita e separação das amostras avaliadas. 24 FIGURA 3: Eletroforese em gel de agarose 2% corado com brometo de etídeo, sob luz ultravioleta. DNA genômico de forma metacestóide de Taenia saginata (A) e Taenia solium (B), PM = marcador Low DNA Mass Ladder (Invitrogen Life Tecnologies, CA, USA). 34 FIGURA 4: Produtos de amplificação, por PCR, de DNA de forma metacestóide de Taenia saginata (A) e Taenia solium (B), com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores F2R1 (HDP2) em gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata. PM = padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen ), 1 = diluição 1:10; 2 = diluição 1:10 2 ;3=1:10 3 ;4=1:10 4 ;5=1:10 5 ; 6 = 1:10 6 ;7=1:10 7 ;8=1:10 8 e NO = sem DNA. 35 FIGURA 5: Produtos de amplificação de DNA, por PCR, de forma metacestóide de Taenia saginata (A) e Taenia solium (B), com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores F1R1 (HDP2) em gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata. PM = padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen ), 1 = diluição 1:10; 2 = diluição 1:10 2 ;3=1:10 3 ;4=1:10 4 ;5=1:10 5 ; 6 = 1:10 6 ;7=1:10 7 ;8=1:10 8 e NO = sem DNA. 36

11 FIGURA 6: Produtos de amplificação de DNA, por PCR, de forma metacestóide de Taenia saginata (A) e Taenia solium (B), com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores TAE em gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata. PM = padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen ), 1 = diluição 1:10; 2 = diluição 1:10 2 ;3=1:10 3 ;4=1:10 4 ;5=1:10 5 ;6= 1:10 6 ;7=1:10 7 ;8=1:10 8 e NO = sem DNA. 36 FIGURA 7: Produtos de amplificação de DNA, por PCR, de forma metacestóide de Taenia saginata (A) e Taenia solium (B), com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores SCAR K em gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata. PM = padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen ), 1 = diluição 1:10; 2 = diluição 1:10 2 ;3=1:10 3 ;4=1:10 4 ;5=1:10 5 ; 6 = 1:10 6 ;7=1:10 7 ;8=1:10 8 e NO = sem DNA. 37 FIGURA 8: Produtos de amplificação de DNA, por PCR, de forma metacestóide de Taenia saginata (A) e Taenia solium (B), com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores SCAR G em gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata. PM = padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen ), 1 = diluição 1:10; 2 = diluição 1:10 2 ;3=1:10 3 ;4=1:10 4 ;5=1:10 5 ; 6 = 1:10 6 ;7=1:10 7 ;8=1:10 8 e NO = sem DNA. 37 FIGURA 9: Eletroforese em gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata, dos produtos de amplificação, por PCR, de DNA de forma metacestóide de Taenia saginata com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores F2R1 (HDP2), nas frações de sangue: série vermelha (A), sobrenadante (B), pellet (C) eplasma(d). PM = padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen ); 1 = 22,66 ng de DNA de forma metacestóide de T. saginata; 2 = diluição 1:10; 3 = diluição

12 1:10 2 ;4=1:10 3 ;5=1:10 4 ;6=1:10 5 ;7=1:10 6 ;8=1:10 7 ;9=1: = DNA de sangue bovino negativo para cisticercose e NO = sem DNA. 40 FIGURA 10: Eletroforese em gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata, dos produtos de amplificação, por PCR, de DNA de forma metacestóide de T. saginata com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores F1R1 (HDP2), nas frações de sangue: série vermelha (A), sobrenadante (B), pellet (C) e plasma (D). PM = padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen ); 1 = 22,66 ng de DNA de forma metacestóide de Taenia saginata; 2 = diluição 1:10, 3 = diluição 1:10 2,4= 1:10 3 ;5=1:10 4 ;6=1:10 5,7=1:10 6 ;8=1:10 7,9=1: =DNA de sangue bovino negativo para cisticercose e NO = sem DNA. 41 FIGURA 11: Eletroforese em gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata, dos produtos de amplificação, por PCR, de DNA de forma metacestóide de Taenia saginata com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores TAE, das frações de sangue: série vermelha (A), sobrenadante (B), pellet (C) e plasma (D). PM = padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen ); 1 = 22,66 ng de DNA de forma metacestóide de Taenia saginata; 2 = diluição 1:10, 3 = diluição 1:10 2,4= 1:10 3 ;5=1:10 4 ;6=1:10 5,7=1:10 6 ;8=1:10 7,9=1: = DNA de sangue bovino negativo para cisticercose e NO = sem DNA. 42 FIGURA 12: Eletroforese em gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata, dos produtos de amplificação, por PCR, de DNA de forma metacestóide de Taenia saginata com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores SCAR K, das frações de sangue: série vermelha (A), sobrenadante (B), pellet (C) e

13 plasma (D). PM = padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen ); 1 = 22,66 ng de DNA de forma metacestóide de Taenia saginata; 2 = diluição 1:10; 3 = diluição 1:10 2 ;4= 1:10 3 ;5=1:10 4 ;6=1:10 5 ;7=1:10 6 ;8=1:10 7 ;9=1: =DNA de sangue bovino negativo para cisticercose e NO = sem DNA. 43 FIGURA 13: Eletroforese em gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata, dos produtos de amplificação, por PCR, de DNA de forma metacestóide de Taenia saginata com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores SCAR G, das frações de sangue: série vermelha (A), sobrenadante (B), pellet (C) e plasma (D). PM = padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen ), 1 = 22,66 ng de DNA de forma metacestóide de Taenia saginata; 2 = diluição 1:10; 3 = diluição 1:10 2 ;4= 1:10 3 ;5=1:10 4 ;6=1:10 5 ;7=1:10 6 ;8=1:10 7 ;9=1: =DNA de sangue bovino negativo para cisticercose e NO = sem DNA. 44 FIGURA 14: Eletroforese em gel de poliacrilimida a 8% de produtos de amplificação, por PCR, de DNA de Taenia saginata em amostras de soro bovino, fração pellet (A) e sobrenadante (B). PM = padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen ); 1 = DNA genômico de forma metacestóide de T. saginata, 2 17 = amostras de bovinos positivos para cisticercose, à inspeção post-mortem. EmC,de2 9 = fração pellet e = fração sobrenadante, NO = sem DNA. 46 FIGURA 15: Eletroforese em gel de poliacrilimida a 8% de produtos de amplificação, por PCR, de DNA de Taenia saginata em amostras de soro bovino, fração pellet (A) e sobrenadante (B). PM = padrão de peso molecular em escada

14 de 100 pb (Invitrogen ); 1 = DNA genômico de forma metacestóide de T. saginata, 2 17 = amostras de bovinos negativos para cisticercose, à inspeção post-mortem. EmC,de 2 9=fraçãopellet e = fração sobrenadante, NO = sem DNA. 47

15 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS μl: microlitro ρmol: picomol C. bovis: Cysticercus bovis C. cellulosae: Cysticercus cellulosae C. longicollis: Taenia longicollis D.I.F.: Departamento de Inspeção Final DNA: Desoxiribonucleic Acid (Ácido Desoxirribonucléico) dntp: deoxinucleotídeos EDTA: Ethylene diaminetetracetic Acid (Ácido Etileno Diaminotetracético) ELISA: Enzyme-linked Immunosorbent Assay g: gramas M.A.P.A.: Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento M: molar mg: miligrama MgCl2: cloreto de magnésio ml: mililitro mm: milimolar N2: nitrogênio líquido NaCl: cloreto de sódio ng: nanograma pb: pares de base PCR: Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia pela Polimerase) PCR-RAPD: PCR - Randon Amplified Polymorphic DNA PCR-REA: PCR - Restriction Enzymes Analysis PCR-RFLP: PCR - Restriction Fragment Length Polymorphism pg: picogramas R.I.I.S.P.O.A.: Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal

16 S.I.F.: Serviço de Inspeção Federal T. asiatica: Taenia asiatica T. saginata : Taenia saginata T. solium: Taenia solium Taq Pol: enzima isolada do organismo Termophylus aquaticus (Taq Polimerase) U: unidade

17 SUMÁRIO Página RESUMO ABSTRACT 1. INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA OBJETIVOS Objetivo geral Objetivos específicos MATERIAL E MÉTODOS Amostras Extração de DNA De formas metacestóides de T. saginata e T. solium De amostras de sangue negativas para cisticercose experimentalmente contaminadas com DNA de formas metacestóides de T. saginata De amostras de soro de bovinos naturalmente infectados com T. saginata Amplificação de DNA através da Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR)... 28

18 4.3.1 Oligonucleotídeos iniciadores Condições do teste Limiar de detecção da Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) RESULTADOS Concentração de DNA genômico extraído de formas metacestóides de T. saginata e T. solium Limiar de detecção da Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) com DNA de formas metacestóides de T. saginata e T. solium diluídos em tampão TE Limiar de detecção da Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) em amostras de sangue negativas para cisticercose e experimentalmente contaminadas com DNA de forma metacestóide de T. saginata Amostras de soro de bovinos positivos e negativos para cisticercose ao exame post-mortem DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS... 56

19 RESUMO / ABSTRACT

20 RESUMO MENOSSO,V.A.Amplificação de DNA circulante para o diagnóstico da cisticercose bovina f. Dissertação (Mestrado) Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia de Botucatu, Universidade Estadual Paulista, Botucatu. A cisticercose bovina é resultante da ingestão de ovos de T. saginata proveniente de pastagens e águas contaminadas fornecidas aos animais. É causa de preocupações na área de saúde pública por ocasionar a teníase em humanos, mas causa sérios prejuízos na indústria agropecuária e aos pecuaristas, devido às condenações ou tratamentos de frio ou salga pelas quais as carcaças consideradas positivas são submetidas. O método de diagnóstico rotineiramente utilizado para a cisticercose bovina tem sido a inspeção post-mortem. Muitos pesquisadores têm desenvolvido métodos de diagnóstico antemortem, com especificidade e sensibilidade variadas. O presente estudo teve como objetivo avaliar a aplicação da amplificação de DNA circulante de T. saginata, através da Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR), como ferramenta diagnóstica para cisticercose bovina. Para a realização da pesquisa foram utilizadas amostras de sangue de bovinos abatidos em frigoríficos sob S.I.F., segundo apresentarem ou não cisticercose. Inicialmente avaliaram-se cinco pares de oligonucleotídeos iniciadores através da determinação do limiar de detecção da PCR de cada um deles. Objetivou-se ainda estabelecer qual a fração do sangue experimentalmente contaminado resultaria em amplificação de fragmentos de DNA através da PCR, para posteriormente avaliar a aplicabilidade da PCR em amostras de sangue de bovinos naturalmente infectados com T. saginata. O melhor limiar de detecção foi observado com o uso do par de oligonucleotídeos iniciadores SCAR K, nas frações de sangue denominadas pellet e sobrenadante. As amostras de sangue de animais positivos para cisticercose na inspeção de rotina e submetidos a PCR não resultaram em amplificação do fragmento de DNA desejado, sugerindo que a baixa carga parasitária possa ter influenciado os resultados. Palavras-chaves: Cisticercose bovina; Taenia saginata; PCR; DNA.

21 ABSTRACT MENOSSO, V. A. Amplification of circulating DNA to the diagnosis of bovine cysticercosis f. Dissertation (Master) - University of Veterinary Medicine and Zootechinie of Botucatu, Universidade Estadual Paulista, Botucatu. Bovine cysticercosis is caused by the ingestion of T. saginata eggs from contaminated pastures and water provided to animals. It is a public health problem by causing the taeniasis in human beings, but it also causes serious damages in the agro-cattle industry and to the cattle raisers by de condemnation or treatment by coldness or salting of carcass detected as positive. Routinely bovine cysticercosis diagnosis has been the post-mortem inspection. Several researchers have developed ante-mortem diagnosis methods, with variable specificity and sensitivity. The present study aimed at evaluating the amplification of circulating DNA of T. saginata, by the Polymerase Chain Reaction (PCR), as a diagnostic tool to bovine cysticercosis. Blood samples from bovines slaughtered under Federal Meat Inspection abattoirs were taken according to the presence or absence of cyst forms. Initially, we evaluated five primers and established which blood fraction experimentally contaminated resulted in DNA fragment amplification by PCR. The best detection limit was observed with the use of the SCAR K primers, in the blood fractions denominated pellet and supernatant. Blood samples of naturally infected animals considered positive in the routine inspection didn t result in the desired DNA fragment amplification by PCR. Key words: Bovine cysticercosis; Taenia saginata; PCR; DNA.

22 INTRODUÇÃO

23 5 1. INTRODUÇÃO O complexo teníase-cisticercose, causado pelos cestóides Taenia saginata (T. saginata) e Taenia solium (T. solium), tem distribuição cosmopolita e ocorre mais freqüentemente em países em desenvolvimento. O homem adquire a teníase quando ingere carne crua ou mal cozida contendo formas metacestóides viáveis de Taenia sp. e pode desenvolver a cisticercose quando ingere ovos de T. solium presentes, principalmente, em alimentos ou água contaminados. O bovino desenvolve cisticercose ao ingerir ovos de T. saginata eliminados pelo homem. A cisticercose bovina causa prejuízos econômicos devido ao tratamento ou condenação de carcaças contaminadas. A única fonte de dados sobre a ocorrência desta zoonose tem se baseado nas informações obtidas junto ao Serviço de Inspeção Federal (S.I.F.) através dos registros constantes dos mapas de abate, a partir do exame postmortem realizado rotineiramente em frigoríficos e matadouros. Deste modo, o S.I.F. desempenha papel fundamental no controle do complexo teníase-cisticercose, com a inspeção sanitária e destinação adequada das carcaças contaminadas. Muitos autores têm desenvolvido testes sorológicos para a detecção de antígenos e anticorpos circulantes que possam ser utilizados antes do abate dos animais. Alguns pesquisadores têm obtido bons resultados, embora os animais naturalmente infectados apresentem carga parasitária baixa, o que diminui a sensibilidade e especificidade do teste. Nos últimos anos, técnicas moleculares baseadas na PCR têm demonstrado serem boas ferramentas diagnósticas permitindo ainda a diferenciação interespécies. A aplicação das técnicas de PCR pode ser útil não só na inspeção da teníase e da cisticercose, mas também para o controle epidemiológico destas infecções. Alguns autores têm demonstrado a presença de fragmentos de DNA de Taenia sp. em fluidos biológicos,

24 6 sugerindo ser esta uma possibilidade para a cisticercose bovina. Assim sendo, embasados nestes fatores e vislumbrando a necessidade do desenvolvimento de um método diagnóstico ante-mortem para a cisticercose bovina, esta pesquisa foi realizada, com o intuito de testar a PCR como ferramenta para o diagnóstico da cisticercose bovina.

25 REVISÃO DA LITERATURA

26 8 2. REVISÃO DA LITERATURA O complexo teníase-cisticercose representa um importante problema para a saúde pública, pela possibilidade de infecção do homem, e para o setor agropecuário, pelas perdas econômicas. A teníase e a cisticercose são duas entidades distintas causadas pela mesma espécie de cestóide, em diferentes fases do seu ciclo de vida (PAWLOWSKI, 1982; ACHA & SZYFRES, 1986). O ciclo da tênia implica em dois hospedeiros e uma fase de vida livre. Com relação à população de parasitas há três fases: adulto no hospedeiro definitivo, ovos no ambiente e metacestóides (fase larvar) no hospedeiro intermediário (GEMMEL & LAWSON, 1982). O homem é o único hospedeiro definitivo da forma adulta tanto da T. saginata como da T. solium, enquanto os bovinos domésticos e os suínos, respectivamente, são os hospedeiros intermediários, apresentando a forma metacestóide em seus tecidos. O estágio larvar ou metacestóide da T. saginata é usualmente encontrado em músculos e vísceras dos animais, representando problemas econômicos para a indústria da carne e risco para a saúde pública (SOULSBY, 1968; PAWLOWSKI, 1982; FORTES, 1997; URQUHART et al., 1998). A problemática na pecuária envolve a condenação ou tratamento das carcaças levando à diminuição do valor da carne, além da perda de peso dos animais infectados. Países que têm alta prevalência de cisticercose são afetados indiretamente, pois há uma inibição no desenvolvimento desta lucrativa indústria (PAWLOWSKI & SCHULTZ, 1972). De suma importância para a saúde pública é quando o homem, além de hospedeiro definitivo, se torna o hospedeiro intermediário desenvolvendo, principalmente no sistema nervoso central, a forma metacestóide da T. solium. A cisticercose humana é adquirida pela

27 9 ingestão de ovos viáveis de T. solium através da auto-infecção interna, auto-infecção externa ou hetero-infecção, sendo a forma mais comum a neurocisticercose, cuja sintomatologia mais freqüente é a epilepsia (ACHA & SZYFRES, 1986; NASCIMENTO, 2000). A Taenia saginata (Goeze, 1782) pertence ao Filo Platyhelminthes,à classe Cestoidea (Southwell, 1930), à ordem Ciclophillidea (Wardleetal., 1974), à família Taeniidae (Ludwig, 1866) e ao gênero Taenia (Linnaeus, 1758) (SOULSBY, 1968; FORTES, 1997; URQUHART et al., 1998). Nos séculos XVIII e XIX, Goeze e Leuckart, fizeram a distinção entre T. solium e T. saginata. Em 1861, Leuckart, elucidou o ciclo de vida da T. saginata administrando a bezerros proglotes por via oral, obtendo experimentalmente a forma metacestóide de T. saginata. Mais tarde, em 1869, Oliver obteve a forma adulta do parasita ao infectar homens com metacestóides de bovinos (PAWLOWSKI & SCHULTZ, 1972; LLOYD, 1998). O parasita adulto da T. saginata habita o intestino delgado do homem e tem comprimento médio de 6 a 8 metros, podendo alcançar 15 metros (URQUHART et al., 1998) e persistir por 25 a 30 anos, mas geralmente vive em média de 10 a 15 anos (PESSOA, 1982). A longevidade da T. saginata e sua grande produção e resistência de ovos são características importantes na epidemiologia da doença. Um único hospedeiro pode eliminar até mais de 500 mil ovos diariamente, sejam nas proglotes ou livres nas fezes. A transmissão indireta é a mais característica da doença e as vias de transmissão abrangem a água, o solo, as pastagens, a silagem, o feno, os vetores mecânicos e os portadores. Os ovos podem ser encontrados contaminando mãos, região perianal e roupas pessoais e de cama de indivíduos parasitados (PAWLOWSKI, 1982). A resistência dos ovos ao meio externo é bastante grande, dependendo da umidade relativa do ar e da temperatura ambiente, suportando, inclusive, a maioria dos processos de tratamento de águas residuárias. Efluentes de esgoto, mesmo previamente tratados podem,

28 10 portanto, conter ovos viáveis que se disseminam pelos rios e campos, quando há inundações ou quando são usadas para a irrigação. Porém, o tratamento convencional da água de abastecimento como floculação, sedimentação e filtração são suficientes para eliminar os ovos. De uma forma geral, os ovos podem permanecer viáveis durante semanas e até meses (PAWLOWSKI & SCHULTZ, 1972; LAWSON & GEMMELL,1983; REY, 1992; REIFF, 1994). A transmissão também pode ocorrer pela ordenha manual, através das mãos contaminadas com matéria fecal do ordenhador. A contaminação direta do feno ou das manjedouras, que é incomum e a qual pode ocorrer quando um carreador humano manuseia ou alimenta bovinos com as mãos contaminadas, tem dado origem a pequenas epidemias de cisticercose bovina (PAWLOWSKI, 1982; REY, 1992). A infecção do homem pela teníase é condicionada pelo consumo de carne bovina e pelo hábito de comê-la crua ou mal cozida. O homem infecta-se pela ingestão de metacestóides viáveis, os quais vão desinvaginar seu escólex ao longo do aparelho digestivo, se fixar na mucosa intestinal e desenvolver o parasita adulto (PESSOA, 1982; REY, 1992; SCHANTZ et al., 1994). Fatores como o modo de preparo da comida, hábitos alimentares e preferências por consumir carne crua ou insuficientemente cozida ou assada, contendo metacestóides viáveis, contribuem para aumentar a prevalência de portadores de T. saginata (ACHA & SZYFRES, 1986; LLOYD, 1998). Entretanto, os fatores que levam à ingestão destas carnes englobam fatores ecológicos, econômicos e etnológicos. Os fatores ecológicos são mais importantes na transmissão da T. saginata do homem para os animais, já que as únicas limitações geográficas da infecção são as regiões não habitadas pelo homem. Do ponto de vista econômico, a produção mundial de carne tem aumentado muito e em muitas áreas há um contato grande entre animais e homem. A

29 11 transmissão entre animal e homem depende de fatores etnológicos isto é, hábitos humanos, religião e crença (PAWLOWSKI & SCHULTZ, 1972). Deste modo, fatores econômicos, culturais e religiosos tendem a expor menos ou mais certas classes, grupos sociais ou até mesmo determinadas populações (REY, 1992). Dentre os fatores determinantes do complexo teníase-cisticercose pode-se citar: baixa condição sócio-econômica; saneamento básico precário; deficiente educação em saúde, hábitos alimentares e de higiene pessoal; criação anti-higiênica de animais; precariedade dos serviços de vigilância sanitária de alimentos e o comércio clandestino de carnes em elevação (GERMANO, 1991). Quando os bovinos ingerem ovos infectantes presentes no meio, as oncosferas dos embriões são ativadas e liberadas através da ação de sucos digestivos, como a pepsina e sais biliares e caminham em direção à mucosa intestinal onde penetram e chegam às vênulas, para em seguida atingirem a corrente sanguínea (ACHA & SZYFRES, 1986; REY, 1992; NASCIMENTO, 2000). As oncosferas fixam-se então, e desenvolvem-se para a forma metacestóide em qualquer tecido mole do organismo, com predileção para o tecido conjuntivo de músculos esqueléticos e cardíacos, principalmente àqueles de maior movimentação e oxigenação como masseter, língua, coração, diafragma e cérebro (REY, 1992; LLOYD, 1998; NASCIMENTO, 2000). A Figura 1 representa o ciclo de vida da T. saginata em bovinos e em humanos.

30 12 FIGURA 1: Ciclo de vida da Taenia saginata em bovinos e humanos. (Fonte: A forma metacestóide de T. saginata apresenta-se como uma vesícula translúcida, de aspecto perláceo, ovóide ou alongada, medindo de sete a doze milímetros de comprimento por quatro a seis milímetros de largura (REY, 1992). Em oito a dez semanas os metacestóides se tornam infectantes para o homem e, em até nove meses, a maior parte deles começa a se degenerar, morrem e se calcificam (ACHA & SZYFRES, 1986; LLOYD, 1998). A presença de formas metacestóides na musculatura de bovinos não tem sido associada a nenhuma sintomatologia clínica (ACHA & SZYFRES, 1986; URQUHART et al., 1998). Entretanto, a infecção experimental de bovinos com altas doses de ovos de T. saginata pode resultar em quadros de miosite e miocardite degenerativa, podendo

31 13 levar até à morte ou à manifestação de alguns sintomas tais como hipertermia, sialorréia, anorexia, debilidade e rigidez muscular (PAWLOWSKI, 1982; ACHA & SZYFRES, 1986). Blazek & Schramlová (1980) e Sterba & Dykova (1978) em pesquisas sobre a patogenia das formas metacestóides de T. saginata em tecido muscular observaram uma reação inflamatória elevada no primeiro mês pós-infecção. O complexo teníase-cisticercose é cosmopolita tendo uma maior prevalência nas zonas rurais de países da América Latina, Ásia e África (SCHANTZ et al., 1994). Devido a sua importância para pecuária e para a saúde pública, esta zoonose deve ter determinadas sua freqüência nas diferentes regiões do país, bem como a procedência dos animais abatidos, para a adoção de medidas de controle e profilaxia (SCHANTZ et al., 1994; REIS et al., 1996). Os dados da literatura sobre cisticercose bovina baseiam-se principalmente em anotações da inspeção, a qual é realizada de modo diferente em alguns países, ou até não é realizada, tornando impraticável a adoção de uma padronização (PAWLOWSKI & SCHULTZ, 1972; THAKUR, 1979). No Brasil, o Serviço de Inspeção Federal (S.I.F.) tem atuado como a única fonte de dados sobre a ocorrência e a quantificação da enfermidade, assim como a procedência dos animais abatidos (SOUZA et al., 1997). Em termos práticos é freqüente encontrarmos poucos metacestóides em uma carcaça, diferente do que acontece nas infecções experimentais, nas quais os animais são infectados maciçamente. As pesquisas que discorrem sobre os locais de predileção refletem bovinos com grandes infecções, o que pode não corresponder à realidade (McCOOL, 1979). Minozzo et al. (2002) com o objetivo de avaliar a distribuição anatômica dos metacestóides nas carcaças de bovinos, realizou infecção experimental com ovos de T. saginata em quatro animais, abatendo-os 90 dias pós-infecção. A maioria dos metacestóides

32 14 (85,19%) foi recuperada da musculatura esquelética, enquanto somente 14,81% foram recuperados de órgãos como coração, língua e diafragma. A distribuição variou de animal para animal, mas a maior parte foi encontrada na musculatura anterior, o que sugere que a inspeção post-mortem realizada como rotina nos frigoríficos, embora único método de diagnóstico aplicado na prática, seja ineficiente. A adoção da inspeção somente não é suficiente para eliminação da T. saginata, uma vez que apresenta um limiar de detecção limitado quando os animais são levemente infectados (PAWLOWSKI & SCHULTZ, 1972; KYVSGAARD et al., 1990). Várias pesquisas realizadas em regiões ou estados no Brasil têm demonstrado uma prevalência da cisticercose bovina de 2,7% no Paraná (ZAMPINI, 1994), 1,87% em Uberlândia MG (REIS et al., 1996), 11,6% em Tupã SP (MANHOSO, 1996), 1,4% no estado do Mato Grosso do Sul (CARMO et al., 1997) e 3,2% na região do Triângulo Mineiro (REIS & RAGHIANTE, 2000). Freitas & Palermo (1996) observaram índices inferiores aos publicados por outros autores, atribuindo esta situação a subregistros no Pará de teníase humana e cisticercose bovina. No estado de São Paulo já foram relatadas prevalências de 5,5% de cisticercose bovina em frigoríficos sob S.I.F. (UNGAR & GERMANO, 1992) e de 4,28% (FUKUDA et al., 2003). O aumento na freqüência da cisticercose bovina, além de prejuízos econômicos para o produtor e para o frigorífico com a condenação ou seqüestro da carcaça para congelamento, reflete a presença de indivíduos com teníase nas populações das áreas analisadas. O conhecimento da procedência dos animais infectados possibilita a adoção de medidas de controle e profilaxia na área de saúde pública (REIS et al., 1996). Além da inspeção de carnes, devem fazer parte de um programa de profilaxia e controle do complexo teníase-cisticercose o tratamento em massa de indivíduos portadores de T. saginata e a melhoria nos serviços de água, esgoto ou fossa sanitária. É de vital importância a

33 15 educação sanitária das populações, principalmente no se refere a boas condições de higiene humana, além da orientação para não consumir carnes cruas ou insuficientemente cozidas. A educação sanitária é peça-chave no desenvolvimento de um programa de controle, mas na prática é realmente difícil obter mudanças em costumes de determinadas populações (SASAKI & BRIOSHI, 1996; LLOYD, 1998; NASCIMENTO, 2000). Como medidas de controle são também propostas de alguns autores o desenvolvimento de novas drogas medicamentosas, a imunização de animais e ainda métodos de diagnóstico ante-mortem (PAWLOWSKI & SCHULTZ, 1972). Um anti-helmíntico que seja eficaz e econômico contra a forma metacestóide de T. saginata pode ser uma ferramenta valiosa no controle da cisticercose bovina em rebanhos de áreas endêmicas (STEVENSON et al., 1981). Algumas drogas têm sido estudadas como o mebendazol (PAWLOWSKI & SCHULTZ, 1972) e o praziquantel (ACHA & SZYFRES, 1986; URQUHART et al., 1998). O praziquantel demonstrou ser um anti-helmíntico eficaz, com boa resposta, no tratamento contra formas metacestóides em infecções experimentais, enquanto o mebendazol tem sido sugerido para o tratamento em massa do rebanho, como um método eficiente na prevenção da transmissão de T. saginata. Mais recentemente, o sulfóxido de albendazol nas concentrações de 10 e 17% demonstrou provocar a degeneração e/ou calcificação de metacestóides de T. saginata, tanto em rebanhos artificial quanto naturalmente infectados (PRICHARD et al., 1985; BIONDI et al., 1999; BARBOSA et al., 2003). Biondi (2000) sugere o uso de sulfóxido de albendazol 17% como medida profilática no controle da cisticercose bovina. Alguns autores têm desenvolvido vacinas a partir de antígenos recombinantes contra a infecção de bovinos e suínos por T. saginata e T. solium, respectivamente. As vacinas são embasadas na identificação e expressão, em Escherichia coli, de antígenos derivados de oncosferas

34 16 contendo ovos das espécies de tênias e demonstraram produzir altos níveis de proteção, principalmente as vacinas contra T. solium. São propostas promissoras para o controle da cisticercose animal e até da cisticercose humana (LIGHTOWLERS, 2003; LIGHTOWLERS et al., 2003; HARRISON et al., 2005). A maioria das pesquisas com técnicas de imunodiagnóstico sugerem sua aplicação para estudos epidemiológicos, principalmente em áreas endêmicas, e para o monitoramento de tratamento, diminuindo, deste modo, as perdas econômicas. Na busca por um método que forneça o diagnóstico ante-mortem confiável, com alta sensibilidade e especificidade, as primeiras técnicas descritas foram para a detecção de anticorpos para cisticercose como o teste de fixação de complemento, a hemaglutinação, o radioimunoensaio, o ELISA (Enzyme-linked Immunosorbente Assay) e técnicas de imunoblot (DORNY et al., 2003). O ELISA indireto não difere infecções recentes com metacestóides viáveis de infecções antigas com metacestóides degenerados (HARRISON & SEWEL,1981). Kyvsgaard et al. (1991) sugere a aplicação do ELISA indireto para detecção de anticorpos na ocorrência de surtos, somente para determinar a extensão e padrão da infecção. Apesar das limitações, o ELISA e o Western Blot estão entre os métodos sorológicos mais pesquisados, obtendo resultados semelhantes (SCIUTTO et al., 2000). Minozzo et al. (2004) testaram, em bezerros experimentalmente infectados, três diferentes extratos antigênicos para pesquisa de anticorpos através de ELISA indireto. Em relação à intensidade da reação as melhores respostas foram do extrato antigênico de antígeno parcial de C. cellulosae, seguido do antígeno total de C. bovis e antígeno total de C. longicollis. Este método não detecta animais na fase crônica da enfermidade, quando os níveis de anticorpos estão baixos, mas pode fornecer dados em pesquisas sobre o comportamento imunológico dos bovinos frente a cisticercose.

35 17 Na tentativa de estabelecer um método mais sensível e específico para cisticercose bovina, foram desenvolvidas metodologias para a detecção de antígenos circulantes, os quais podem diferenciar melhor infecção crônica de recente (DORNY et al., 2000). A detecção de antígeno circulante baseado no uso de anticorpo monoclonal apresenta a limitação da intensidade da infecção. Harrison et al. (1989) testaram um ELISA sanduíche usando um anticorpo monoclonal que reconhece antígeno específico de T. saginata, e observaram nível mínimo de detecção quando da presença de 200 metacestóides vivos, após 4 a 5 semanas pós-infecção. Brandt et al. (1992) testando outros anticorpos monoclonais, observaram que o número mínimo de metacestóides vivos para detecção de antígeno pelo teste foi menor (88); nesta pesquisa demonstraram que os animais com metacestóides calcificados apresentaram a mesma reação dos controles negativos, mas relataram problemas de reação cruzada com outros tenídeos. Vários pesquisadores (HAYUNGA et al., 1991; DRAELANTS et al., 1995; B GH et al., 1996; VAN KERCKHOVEN et al., 1998; FERRER et al., 2003) têm proposto variações nas técnicas para detecção de antígeno circulante com o intuito de aumentar a sensibilidade e especificidade do diagnóstico ante-mortem. Alguns autores têm utilizado o diagnóstico baseado na detecção de DNA como alternativa particularmente para a diferenciação entre as espécies de tênias, principalmente T. solium e T. saginata. A amplificação de DNA fornece um método de diagnóstico altamente sensível, específico e de fácil realização para proglótides, ovos e formas metacestóides de T. saginata e tem sido sugerido como rotina de diagnóstico laboratorial e no auxílio de programas de controle (GOTTSTEIN et al., 1991), embora ainda seja uma técnica de custo relativamente alto.

36 18 Seqüências específicas para Taenia sp. e T. saginata já foram descritas originando oligonucleotídeos iniciadores capazes de diferenciação entre as espécies (HARRISON et al. 1990; GONZÁLEZ et al. 2000) e capazes até de identificar proglotes e ovos de Taenia sp. de espécimes provenientes de diferentes regiões geográficas, como Colômbia, Espanha e México (GONZÁLEZ et al. 2002). Mayta et al. (2000) realizaram uma pesquisa para comparar o método histológico corado com hematoxilina-eosina e a PCR - REA (Restriction Enzymes Analysis) na diferenciação de proglotes. Apesar de mais barato e facilmente acessível, o método histológico só conseguiu ser efetivo em 60% das amostras que se apresentavam em condições de serem recuperadas e identificadas, enquanto a PCR identificou 100% destas. Em amostras clínicas, Nunes et al. (2003) utilizando os oligonucleotídeos iniciadores propostos por González et al. (2000), obtiveram a diferenciação entre T. solium e T. saginata em amostras de fezes de pacientes humanos. Um Multiplex - PCR utilizando como gene alvo a citocromo c oxidase, sub-unidade 1, foi desenvolvido por Yamasaki et al. (2004), podendo ser aplicado para fins epidemiológicos uma vez que é capaz de diferenciar entre T. saginata, T. solium e T. asiatica. Dias (2004) pelo estudo da análise de fragmentos através da técnica PCR RAPD (Randon Amplified Polymorphic DNA), descreveu os oligonucleotídeos SCAR K e SCAR G que são específicos para T. saginata e Taenia sp., respectivamente. Também em amostras de fezes de pacientes humanos, Nunes et al. (2005) desenvolveram oligonucleotídeos que permitem a diferenciação entre T. solium e T. saginata através de PCR RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism). A possibilidade de que pode ocorrer a liberação de componentes genéticos e até fragmentos celulares do parasita na corrente sanguínea e em fluidos biológicos tem sido base para diagnósticos como o da

37 19 neurocisticercose em líquido cefalorraquidiano (BUENO et al., 2000; PARDINI et al., 2001). A pesquisa pela presença de material genético do parasita na circulação sanguínea é respaldada por alguns autores que confirmaram a detecção de DNA em fluidos biológicos e sistema linfático, apesar de serem pesquisas com outras espécies de parasitas e de material de amostra de origens diferentes (PONTES et al., 2002; OGUMREMI et al., 2004). Almeida (2005) observou a amplificação de DNA de T. solium em soro e liquor de pacientes portadores de neurocisticercose, e identificaram a presença de DNA em amostras de liquor. A amplificação de fragmento de DNA em amostras de soro deste pacientes não revelou resultados consistentes pela baixa concentração de DNA circulante.

38 OBJETIVOS

39 21 3. OBJETIVOS 3.1 Objetivo geral Avaliar a amplificação de DNA circulante de T. saginata, através da PCR, como ferramenta diagnóstica para cisticercose bovina. 3.2 Objetivos específicos Avaliar, através da PCR, os oligonucleotídeos iniciadores já descritos na literatura para amplificação de fragmento de DNA de T. saginata; Determinar o limiar de detecção da PCR para cada par de oligonucleotídeos iniciadores testado; Estabelecer qual fração do sangue experimentalmente contaminado com DNA de T. saginata resulta em amplificação de fragmento de DNA através da PCR; Avaliar a aplicabilidade da PCR em amostras de sangue de bovinos naturalmente infectados com T. saginata.

40 MATERIAL E MÉTODOS

41 23 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Amostras Foram colhidas amostras provenientes de bovinos abatidos em frigoríficos que seguem as normas vigentes do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (M.A.P.A.). Os bovinos foram selecionados segundo apresentarem ou não formas metacestóides de T. saginata em qualquertecidoouórgãodurantearealizaçãodoexamepost-mortem, exame este realizado segundo as normas do Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal R.I.I.S.P.O.A. (BRASIL, 1980). Dos animais detectados pela inspeção como positivos e negativos para cisticercose foram colhidas amostras de sangue total e de soro, bem como as respectivas formas metacestóides identificadas nas carcaças. A colheita de sangue das carcaças nos frigoríficos foi realizada através do levantamento do membro anterior, na altura no corte da artéria braquial, o qual ocorre no momento da separação das hemi-carcaças. As amostras negativas foram colhidas no final do toillet, e as positivas foram colhidas de carcaças desviadas para o Departamento de Inspeção Final (D.I.F.). Foram colhidas 40 amostras, sendo 20 amostras de animais detectados como positivos pela inspeção de rotina e outras 20 de animais negativos. As amostras de sangue total foram colhidas em tubos contendo citrato de sódio e mantidas a -20ºC até o processamento. As amostras de soro foram obtidas após centrifugação do sangue (3000 g X 10 minutos), sendo posteriormente conservadas a -20ºC, até o processamento. As amostras de formas metacestóides foram colhidas no D.I.F. e preservadas em etanol a 95%. A Figura 2 representa o fluxograma da colheita e fracionamento das amostras de sangue total e soro avaliadas.

42 24 Sangue total com anticoagulante Sangue total sem anticoagulante Centrifuga 3000 g x 10 minutos Centrifuga 3000 g x 10 minutos SÉRIE VERMELHA PLASMA SORO Extração de DNA da fração SÉRIE VERMELHA Fração PLASMA SEM extração de DNA Centrifuga g X 60 minutos PELLET SOBRENADANTE Extração de DNA da fração PELLET Extração de DNA da fração SOBRENA DANTE FIGURA 2: Fluxograma da colheita e separação das amostras avaliadas.

43 25 Como controle negativo para cisticercose foram colhidas amostras de sangue total com anticoagulante e de sangue para obtenção do soro de bezerros recém-nascidos de 1-2 dias de idade, oriundos de fazendas de gado de corte localizadas no município de Guararapes e Araçatuba. Formas metacestóides de T. solium foram colhidas de um suíno procedente de Dourados - MS, o qual apresentava cisticercose generalizada, gentilmente cedidas pelo médico veterinário Samuel Carvalho de Aragão. Todas as análises foram realizadas no Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular Animal do curso de Medicina Veterinária da Universidade Estadual Paulista/UNESP, campus de Araçatuba. 4.2 Extração de DNA De formas metacestóides de T. saginata e T. solium Em uma placa contendo solução salina 0,9% os metacestóides foram lavados e foi retirado, com o auxílio de um bisturi, qualquer tecido que não pertencesse ao metacestóide, principalmente tecido do animal hospedeiro. A membrana vesicular foi perfurada com auxílio de uma agulha para a retirada do líquido vesicular e, em seguida, o metacestóide foi isolado, separado da membrana, sendo novamente lavado em solução salina. Para a extração do DNA foi utilizado um pool de 05 (cinco) metacestóides que foram colocados em tubo de polipropileno (0,5 ml) sendo macerado, com pistilo, em nitrigênio líquido (N2), até a completa destruição da estrutura. Após a maceração, a extração do DNA foi realizada segundo o protocolo Salting Out (REGITANO, 2001) com modificações descritas a seguir: após a maceração foram adicionados 400 μl desoluçãodelise (Sucrose, EDTA 0,5M, Tris-Cl 1M e SDS 10% - 0,10mg/ml) contendo 15 μl de proteinase k (20 mg/ml) e a solução foi incubada por 18 horas em

44 26 banho-maria à 58 O C; após este período 200 μl denacl4,5m foram adicionados, com subseqüente homogeneização vigorosa. Para a extração de DNA 400 μl de clorofórmio foram adicionadas, as soluções foi agitada vigorosamente e centrifugada (14000 g x 11 minutos). A fase superior foi cuidadosamente transferida para um microtubo de 1,5 ml e 400 μl de isopropanol foram adicionados para a precipitação do DNA extraído. Após a centrifugação (14000 g x 15 minutos) o sobrenadante foi descartado, o sedimento foi lavado com álcool 70%, incubado a temperatura ambiente por 15 minutos e centrifugado (14000 g x 11 minutos). O sobrenadante foi descartado e ao sedimento obtido foram adicionados 50 μl de tampão Tris - EDTA (EDTA 0,5M, Tris-Cl 1M). O DNA obtido foi incubado a 37 O C, por 18 horas, antes de ser conservado a 20 O C. O DNA genômico extraído foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 2%, a 100 volts, durante 30 minutos (Eletrophoresis Power Supply Model 250 EX/Gibco BRL, MD, EUA). O gel foi então fotografado (Kodak Digital Science, SP 700 Color Printer, Scientific Imaging Systems, NY, EUA) e o DNA de metacestóide teve sua concentração determinada através de comparação com a utilização do marcador Low DNA Mass Ladder (Invitrogen Life Tecnologies, CA, USA) De amostras de sangue negativas para cisticercose experimentalmente contaminadas com DNA de formas metacestóides de T. saginata Com o objetivo de se avaliar em qual fração do sangue o DNA de T. saginata estaria presente, bem como o de avaliar o limiar de detecção da reação de PCR, amostras de sangue de bezerros recémnascidos (de 1-2 dias de vida) foram colhidas para a contaminação experimental com DNA de formas metacestóides de T. saginata. As diluições seriadas foram feitas em volume de 700 μl, na base 10 ( ), em duplicata. Após a contaminação, as amostras de sangue com o

45 27 DNA foram incubadas por 2 horas a 38 C em banho-maria (Modelo 146, FANEM, São Paulo, Brasil) com a finalidade de simular o organismo do bezerro. Todas as amostras, incluindo os controles negativos, foram delicadamente homogeneizadas e posteriormente foram centrifugadas a 3000 g durante 10 minutos para a separação em duas frações: série vermelha e plasma. Em seguida foram congeladas a 20 O C até o processamento. Após o descongelamento, foi separada uma alíquota de 30 μl da fração plasma, que foi utilizada diretamente na PCR, sem que fosse feita a extração do DNA da amostra. O restante da amostra de plasma foi submetido a uma nova centrifugação, a g por 60 minutos a 4 O C. Desta fração obtiveram-se outras duas frações: pellet e sobrenadante, com aproximadamente 450μl (Figura 2). Com exceção da fração plasma, que foi utilizado direto na reação (2 μl como amostra de DNA), todas tiveram o DNA extraído pelo método Salting Out (REGITANO, 2001) com adaptações conforme abaixo descritas. A extração de DNA das frações série vermelha e pellet, foi realizada seguindo o mesmo protocolo, com exceção da fase inicial na qual à série vermelha foram adicionados 800 μl de solução SSC (NaCl 0,9M, citrato de sódio 89mM) centrifugados a g por 2 minutos e o sobrenadante foi retirado. Todo o restante do protocolo seguiu a mesma seqüência utilizada na extração de DNA de formas metacestóides, porém os volumes de alguns reagentes diferiram. O volume da solução de lise foi de 200 μl, da proteinase K foi de 3 μl, do NaCl 4,5M foi de 100 μl, do clorofórmio foi de 225 μl e do isopropanol foi de 200μl. Para a extração do DNA da fração sobrenadante, o que difere da extração de DNA de formas metacestóides, além do volume da proteinase K (3 μl) foi que após a adição do NaCl 4,5M, cada amostra foi dividida em duas partes, que seguiram independentes toda

46 28 a reação, até serem unidas na fase final, quando da adição do tampão TE. O DNA genômico das diferentes frações foi ressuspendido em volume final de 30 μl em tampão TE. Antes da PCR, todas as amostras foram testadas para verificação da extração de DNA. Para isso, foram submetidas à eletroforese em gel de agarose a 2% (110 volts durante 45 minutos) e fotografadas De amostras de soro de bovinos naturalmente infectados com T. saginata Esta etapa teve como objetivo testar a aplicabilidade da PCR em amostras de bovinos naturalmente infectados. Foram utilizados 500 μl de soro, os quais foram submetidos à centrifugação (14000 g, 1 hora, 4 º C), para a separação do soro nas frações pellet e sobrenadante, anteriormente mencionadas. A extração de DNA destas frações foi realizada seguindo a metodologia descrita no item para a fração plasma. 4.3 Amplificação de DNA através da Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) Oligonucleotídeos Iniciadores Com o intuito de avaliar a amplificação de DNA de T. saginata e T. solium foram selecionados cinco pares de oligonucleotídeos iniciadores, descritos no Quadro 1.

47 29 QUADRO 1: Oligonucleotídeos iniciadores segundo a seqüência e sentido. Oligonucleotídeos Sequência (5 3 ) Sentido inciadores F1 - HDP2 CAGTGGCATAGCAGAGGAGGAA sense R1 - HDP2 GGACGAAGAATGGAGTTGAAGGT anti-sense F2 - HDP2 CTTCTCAATTCTAGTCGCTGTGGT sense TAE TGGGTTAGATGTTAAGACGGC sense TAE AAAACACCCACTAAAAGCAGA anti-sense SCAR K GTCTCCGCAACTGTAATGTATC sense SCAR K GTCTCCGCAATAATAATCTTTC anti-sense SCAR G GGATGAGACCGTACTAGCATG sense SCAR G GGATGAGACCCTTGTAACAAATG anti-sense Os oligonucleotídeos F1 e R1 resultam em uma amplificação de 600 pares de base (pb), específica para T. saginata, e os oligonucleotídeos F2 e R1 resultam em uma amplificação de 170 pb, específico para Taenia sp. Estes oligonucleotídeos foram originados da seqüência nãorepetitiva HDP2 (3954 pb), descrita por GONZÁLEZ et al. (2000), depositada no GenBank com número de acesso AJ Os oligonucleotídeos TAE foram descritos por NUNES et al. (2005), e o fragmento de DNA resultante é de 521 pb, específico para Taenia sp. Foram originados a partir de seqüências de DNA mitocondrial depositada no GenBank com número de acesso AB e AB DIAS (2004) descreveu os oligonucleotídeos SCAR K e SCAR G, através da análise de fragmentos de DNA originadas por PCR-RAPD (Randon Amplified Polymorphic DNA), técnica esta que se baseia na

48 30 amplificação de sequências repetitivas. Os oligonucleotídeos SCAR K amplificam fragmentos de 532 pb, específico para T. saginata; enquanto os SCAR G resultam em produtos de PCR com 357 pb específico para Taenia sp. Em todas as reações foram incluídos um controle positivo (o DNA de metacestóide original de concentração conhecida) e um controle negativo (sem DNA). Após as PCRs, seus produtos foram submetidos a eletroforese em gel de agarose a 2%, a 110 volts por 45 minutos, e em gel de poliacrilamida a 8%, a 110 volts por 210 minutos (Eletrophoresis Power Supply Model 250 EX/Gibco BRL, MD, EUA) para se observar possíveis diferenças entre os dois métodos de visualização dos fragmentos amplificados de DNA. O gel foi fotografado utilizando-se uma câmara digital (Kodak Digital Science, SP 700 Color Printer, Scientific Imaging Systems, NY, EUA) Condições do teste As PCRs foram realizadas em termociclador (PTC-100 TM Programmable Thermal Controller, MJ Research, Inc., MA, EUA) em tubos de 200 μl, com volume final de 25 μl. Foram desenvolvidas segundo os protocolos testados propostos para cada par de oligonucleotídeos iniciadores, conforme os Quadros 2, 3 e 4. As condições de reação para os testes com oligonucleotídeos F1, F2 e R1 foram as seguintes: desnaturação inicial a 94 C por5minutos, seguido de 34 ciclos de desnaturação a 94 C pó 1 minuto, anelamento a56 C durante 30 segundos, extensão a 72 C por 30 segundos e uma extensão final a 72 C por 10 minutos.

49 31 QUADRO 2: Reagentes da PCR para oligonucleotídeos iniciadores HDP2. Reagente Volume 1X em µl Água 14,88 Tampão 10 X (Invitrogen ) 2,5 MgCl2 50 mm (Invitrogen ) 0,62 dntps 12,5 mm (Invitrogen ) 2,5 Primer sense 10 ρmol 1,0 Primer anti-sense 10 ρmol 1,0 Taq Pol 5 U/μl (Invitrogen ) 0,5 DNA 2,0 Volume Total 25,0 Para os oligonucleotídeos TAE a reação seguiu o seguinte protocolo: desnaturação inicial a 95 C por5minutos,seguidosde34 ciclos de desnaturação a 95 C por 1 minuto, anelamento a 65 C por 1minuto e trinta segundos, extensão a 72 C por 1 minuto, mais uma extensão final a 72 C por5 minutos. QUADRO 3: Reagentes da PCR para oligonucleotídeos iniciadores TAE. Reagente Volume 1X em µl Água 14,25 Tampão 10 X (Invitrogen ) 2,5 MgCl2 50 mm (Invitrogen ) 1,25 dntps 12,5 mm (Invitrogen ) 1,5 Primer sense 10 ρmol 1,5 Primer anti-sense 10 ρmol 1,5 Taq Pol 5 U/μl (Invitrogen ) 0,5 DNA 2,0 Volume Total 25,0

50 32 Com uma desnaturação inicial a 94 C por 5 minutos, 34 ciclos de desnaturação a 94 C por 1 minuto, anelamento a 60 Cpor1minutoe extensão a 72 C por 1 minuto e trinta segundos, com extensão final a 72 C durante 8 minutos, foram realizados as reações com os oligononucleotídeos SCAR K e SCAR G. QUADRO 4: Reagentes da PCR para oligonucleotídeos iniciadores SCAR K e SCAR G. Reagente Volume 1X em µl Água 14,05 Tampão 10 X (Invitrogen ) 2,5 MgCl2 50 mm (Invitrogen ) 0,75 dntps 12,5 mm (Invitrogen ) 1,5 Primer sense 10 ρmol 2,0 Primer anti-sense 10 ρmol 2,0 Taq Pol 5 U/μl (Invitrogen ) 0,2 DNA 2,0 Volume Total 25,0 (PCR) Limiar de detecção da Reação em Cadeia pela Polimerase Com o intuito de avaliar o limiar de detecção da PCR utilizou-se o DNA genômico (11,33 ng/μl) de T. saginata e T. solium diluídos em tampão TE, bem como de DNA de T. saginata em 630 μl desanguedebezerros recém-nascidos e negativos para cisticercose, em escalas na base 10 ( ).

51 RESULTADOS

52 34 5. RESULTADOS 5.1 Concentração de DNA genômico extraído de formas metacestóides de T. saginata e T. solium Após análise realizada pelo programa Kodak (Kodak Digital Science, SP 700 Color Printer, Scientific Imaging Systems, NY, EUA), a concentração de DNA de T. saginata foi avaliada em 11,33 ng/μl de solução e a de T. solium em 32,66 ng/μl. A Figura 3 apresenta a visualização do DNA genômico extraído, após eletroforese em gel de agarose a 2%. PM A PM B 100 ng 60 ng 40 ng 20 ng 10 ng 5ng 100 ng 60 ng 40 ng 20 ng 10 ng 5ng FIGURA 3: Eletroforese em gel de agarose 2% corado com brometo de etídeo, sob luz ultravioleta. DNA genômico de forma metacestóide de Taenia saginata (A) e Taenia solium (B), PM = marcador Low DNA Mass Ladder (Invitrogen Life Tecnologies, CA, USA).

53 Limiar de detecção da Reação de Cadeia de Polimerase (PCR) com DNA de formas metacestóides de T. saginata e T. solium diluídos em Tampão Tris - EDTA (TE) As Figuras 4, 5, 6, 7 e 8 apresentam os produtos de amplificação, por PCR, de DNA de formas metacestóides de T. saginata e T. solium diluídos em tampão TE e utilizando-se diferentes pares de oligonucleotídeos iniciadores. Foi possível a amplificação de fragmento de DNA de T. saginata, por PCR, utilizando-se todos os oligonucleotídeos iniciadores testados. A amplificação de fragmento de DNA de T. solium não foi observada quando do uso do par de oligonucleotídeos F1R1 (HDP2) e SCAR K. PM NO 170 pb A B FIGURA 4: Produtos de amplificação, por PCR, de DNA de forma metacestóide de Taenia saginata (A) e Taenia solium (B), com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores F2R1 (HDP2) em gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata. PM = padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen ), 1 = diluição 1:10; 2 = diluição 1:10 2 ;3=1:10 3 ;4=1:10 4 ;5=1:10 5 ;6=1:10 6 ;7=1:10 7 ;8=1:10 8 e NO = sem DNA.

54 36 PM NO 600 pb A B FIGURA 5: Produtos de amplificação de DNA, por PCR, de forma metacestóide de Taenia saginata (A) e Taenia solium (B), com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores F1R1 (HDP2) em gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata. PM = padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen ), 1 = diluição 1:10; 2 = diluição 1:10 2 ;3=1:10 3 ;4=1:10 4 ;5=1:10 5 ;6=1:10 6 ;7=1:10 7 ;8=1:10 8 e NO = sem DNA. PM NO 521 pb A B FIGURA 6: Produtos de amplificação de DNA, por PCR, de forma metacestóide de Taenia saginata (A) e Taenia solium (B), com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores TAE em gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata. PM = padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen ), 1 = diluição 1:10; 2 = diluição 1:10 2 ;3= 1:10 3 ;4=1:10 4 ;5=1:10 5 ;6=1:10 6 ;7=1:10 7 ;8=1:10 8 e NO = sem DNA.

55 37 PM NO 532 pb A B FIGURA 7: Produtos de amplificação de DNA, por PCR, de forma metacestóide de Taenia saginata (A) e Taenia solium (B), com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores SCAR K em gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata. PM = padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen ), 1 = diluição 1:10; 2 = diluição 1:10 2 ;3= 1:10 3 ;4=1:10 4 ;5=1:10 5 ;6=1:10 6 ;7=1:10 7 ;8=1:10 8 e NO = sem DNA. PM NO 357 pb A B FIGURA 8: Produtos de amplificação de DNA, por PCR, de forma metacestóide de Taenia saginata (A) e Taenia solium (B), com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores SCAR G em gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata. PM = padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen ), 1 = diluição 1:10; 2 = diluição 1:10 2 ;3=1:10 3 ;4=1:10 4 ;5=1:10 5 ;6=1:10 6 ;7=1:10 7 ;8=1:10 8 e NO = sem DNA.

56 38 Na Tabela 1 estão disponíveis os limiares de detecção da técnica de PCR, observados segundo os oligonucleotídeos iniciadores testados. Para as diluições realizadas com DNA diluído em tampão TE, o par de oligonucleotídeos que apresentou melhores limiares de detecção de DNA de T. saginata foi o F2R1 (HDP2), e para a detecção de T. solium foi o par de oligonucleotídeos TAE. TABELA 1: Resultados da avaliação do limiar de detecção da técnica de PCR segundo o par de oligonucleotídeos iniciadores testados e o parasita avaliado em tampão Tris - EDTA (TE). Oligonucleotídeos Inciciadores tamanho do fragmento F2R1 (HDP2) 170 pb Formas Limiar de detecção metacestóides no gel de Poliacrilamida T. saginata 1:10 7 T. solium 1:10 5 F1R1 (HDP2) 600 pb T. saginata 1:10 5 TAE 521 pb T. saginata 1:10 5 T. solium 1:10 7 SCAR K 532 pb T. saginata 1:10 4 SCAR G 357 pb T. saginata 1:10 4 T. solium 1:10 2

57 Limiar de detecção da Reação de Cadeia pela Polimerase (PCR) em amostras de sangue negativo para cisticercose e experimentalmente contaminadas com DNA de forma metacestóide de T. saginata As Figuras 9, 10, 11, 12 e 13 apresentam os produtos de amplificação, por PCR, das frações de sangue série vermelha, sobrenadante, pellet e plasma com os diferentes oligonucleotídeos iniciadores testados. Em todas os géis estão presentes como controle positivo o DNA genômico extraído de metacestóides de T. saginata e, como controle negativo, uma amostra do mesmo sangue utilizado na realização da escala, sem contaminação com DNA de T. saginata.

58 40 PM NO 170 pb A PM pb B PM pb C PM pb D FIGURA 9: Eletroforese em gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata, dos produtos de amplificação, por PCR, de DNA de forma metacestóide de Taenia saginata com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores F2R1 (HDP2), nas frações de sangue: série vermelha (A), sobrenadante (B), pellet (C) e plasma (D). PM = padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen ); 1 = 22,66 ng de DNA de forma metacestóide de T. saginata; 2 = diluição 1:10; 3 = diluição 1:10 2 ;4=1:10 3 ;5=1:10 4 ;6=1:10 5 ;7=1:10 6 ;8=1:10 7 ;9=1: = DNA de sangue bovino negativo para cisticercose e NO = sem DNA.

59 41 PM NO 600 pb A PM pb B PM pb C PM pb D FIGURA 10: Eletroforese em gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata, dos produtos de amplificação, por PCR, de DNA de forma metacestóide de Taenia saginata com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores F1R1 (HDP2), nas frações de sangue: série vermelha (A), sobrenadante (B), pellet (C) e plasma (D). PM = padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen ); 1 = 22,66 ng de DNA de forma metacestóide de T. saginata; 2 = diluição 1:10, 3 = diluição 1:10 2,4=1:10 3 ;5=1:10 4 ;6=1:10 5,7=1:10 6 ;8=1:10 7,9=1: = DNA de sangue bovino negativo para cisticercose e NO = sem DNA

60 42 PM pb A PM pb B PM NO 521 pb C PM pb D FIGURA 11: Eletroforese em gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata, dos produtos de amplificação, por PCR, de DNA de forma metacestóide de Taenia saginata com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores TAE, das frações de sangue: série vermelha (A), sobrenadante (B), pellet (C) e plasma (D). PM = padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen ); 1 = 22,66 ng de DNA de forma metacestóide de T. saginata; 2 = diluição 1:10, 3 = diluição 1:10 2,4=1:10 3 ;5=1:10 4 ;6=1:10 5,7=1:10 6 ;8=1:10 7,9=1: = DNA de sangue bovino negativo para cisticercose e NO = sem DNA.

61 43 PM pb A PM pb B PM pb C PM NO 532 pb D FIGURA 12: Eletroforese em gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata, dos produtos de amplificação, por PCR, de DNA de forma metacestóide de Taenia saginata com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores SCAR K, das frações de sangue: série vermelha (A), sobrenadante (B), pellet (C) e plasma (D). PM = padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen ); 1 = 22,66 ng de DNA de forma metacestóide de T. saginata; 2 = diluição 1:10; 3 = diluição 1:10 2 ;4=1:10 3 ;5=1:10 4 ;6=1:10 5 ;7=1:10 6 ;8=1:10 7 ;9=1: = DNA de sangue bovino negativo para cisticercose e NO = sem DNA.

62 44 PM NO 357 pb A PM pb B PM pb C PM pb D FIGURA 13: Eletroforese em gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata, dos produtos de amplificação, por PCR, de DNA de forma metacestóide de Taenia saginata com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores SCAR G, das frações de sangue: série vermelha (A), sobrenadante (B), pellet (C) e plasma (D). PM = padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen ), 1 = 22,66 ng de DNA de forma metacestóide de T. saginata; 2 = diluição 1:10; 3 = diluição 1:10 2 ;4=1:10 3 ;5=1:10 4 ;6=1:10 5 ;7=1:10 6 ;8=1:10 7 ;9=1: = DNA de sangue bovino negativo para cisticercose e NO = sem DNA.

63 45 Na Tabela 2 são apresentados os limiares de detecção da técnica de PCR, segundo a fração do sangue testada e os oligonucleotídeos iniciadores avaliados. O par de oligonucleotídeos que resultou em melhor limiar de detecção foi o SCAR K, com ausência de produtos de amplificação nas amostras negativas. TABELA 2: Resultados da avaliação do limiar de detecção da técnica de PCR segundo o par de oligonucleotídeos iniciadores testado e a fração de amostra de sangue experimentalmente contaminada com DNA de Taenia saginata. Olig. inic. Fração Série vermelha Sobrenadante Pellet Plasma F2R1 (HDP2) 1:10 8 1:10 8 1:10 8 1:10 2 F1R1 (HDP2) 1:10 3 1:10 8 1:10 5 X TAE 1:10 8 1:10 8 1:10 5 X SCAR K 1:10 2 1:10 5 1:10 7 X SCAR G 1:10 3 1:10 8 1:10 8 X X= ausência de amplificação. 5.4 Amostras de soro de bovinos positivos e negativos para cisticercose ao exame post-mortem AsFiguras14e15apresentamosresultadosobtidosapósamplificação de DNA, por PCR, com o uso dos oligonucleotídeos SCAR K em amostras de soro de bovinos provenientes de frigoríficos. Em nenhuma das amostras classificadas como positivas à inspeção post-mortem foi possível a amplificação de fragmento de DNA desejado. Dentre as amostras negativas, uma amostra apresentou amplificação de fragmento de DNA de 532 pb.

64 46 PM pb A PM pb B PM NO 532 pb C FIGURA 14: Eletroforese em gel de poliacrilimida a 8% de produtos de amplificação, por PCR, de DNA de Taenia saginata em amostras de soro bovino, fração pellet (A) e sobrenadante (B). PM = padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen ); 1 = DNA genômico de forma metacestóide de T. saginata, 2 17 = amostras de bovinos positivos para cisticercose, à inspeção post-mortem. EmC,de2 9= fração pellet e = fração sobrenadante, NO = sem DNA.

65 47 PM pb A PM pb B PM NO 532 pb C FIGURA 15: Eletroforese em gel de poliacrilimida a 8% de produtos de amplificação, por PCR, de DNA de Taenia saginata em amostras de soro bovino, fração pellet (A) e sobrenadante (B). PM = padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen ); 1 = DNA genômico de forma metacestóide de T. saginata, 2 17 = amostras de bovinos negativos para cisticercose, à inspeção post-mortem. EmC,de2 9= fração pellet e = fração sobrenadante, NO = sem DNA.