AMPLIFICAÇÃO DE DNA CIRCULANTE PARA O DIAGNÓSTICO DA CISTICERCOSE BOVINA

Transcrição

1 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA UNESP FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA AMPLIFICAÇÃO DE DNA CIRCULANTE PARA O DIAGNÓSTICO DA CISTICERCOSE BOVINA VALERIA APARECIDA MENOSSO Botucatu SP Março 2006

2 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA UNESP FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA AMPLIFICAÇÃO DE DNA CIRCULANTE PARA O DIAGNÓSTICO DA CISTICERCOSE BOVINA VALERIA APARECIDA MENOSSO Dissertação apresentada junto ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, para obtenção do Título de Mestre. Orientador: Prof. Dr. Germano Francisco Biondi Botucatu SP Março 2006

3 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. E TRAT. DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE Menosso, Valeria Aparecida. Amplificação de DNA circulante para o diagnóstico da cisticercose bovina / Valeria Aparecida Menosso. Botucatu : [s.n.], Dissertação (mestrado) Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia de Botucatu, Universidade Estadual Paulista, Orientador: Prof. Dr. Germano Francisco Biondi. Assunto CAPES: Saúde animal. 2. Cisticercose. 3. Bovino. 4. Reação em Cadeia pela Polimerase. 5. Taenia. 6. Imunodiagnóstico. CDD Palavras chave: Bovinos; DNA; Cisticercose; PCR; Taenia.

4 Dedico, À minha mãe, Diva (in memoriam), por me ensinar que nenhum obstáculo é grande o suficiente para nos impedir de lutar pelo que desejamos; Ao meu pai, Gastão, por despertar em mim meu amor e respeito pela arte da pesquisa.

5 AGRADEÇO, À minha mãe, por tudo o que foi e representa na minha vida, por todo amor, carinho e cafuné, por todos os conselhos, os que eu segui e os que não segui, pelas confissões, pela torcida nas minhas conquistas e afago nas minhas derrotas...te levo para onde vou, dentro do meu coração! Ao meu pai, por todo amor e carinho, pelo exemplo de força, pela compreensão, por me entender, encorajar e apoiar incondicionalmente, por me ensinar a sempre tirar o melhor de tudo. Te amo muito pai! Ao meu irmão, pelas conversas e conselhos: - Mano, aqui não cabe só um abraço!cabem muitos abraços, daqueles aconchegantes, demorados, em que ficamos sem dizer nada, mas sabemos tudo que o outro está sentindo. Sentimentos compartilhados... A toda minha família. Devo a vocês minha vida, tudo o que sou, meus valores. Me ensinaram o significado de uma família unida, de bons sentimentos e de prosseguir batalhando. Amo vocês! Ao meu orientador, Prof. Dr. Germano Francisco Biondi, pela confiança depositada em mim, pelo incentivo, pela compreensão, por ser além de orientador, mas meu amigo! À prof. Dr. Cáris Maroni Nunes, do Dep. de Apoio, Produção e Saúde Animal, da Faculdade de Odontologia de Araçatuba (FOA), pelos desafios, por todo ensinamento compartilhado, pela paciência e por me deixar partilhar da sua família, pela amizade! Ao meu namorado Anoros, pelo amor, dedicação, por me compreender e sempre me apoiar! À amiga Daniela, minha irmã de coração, pelas risadas, pelos devaneios, pelos desabafos, por todos os momentos divididos e vividos juntas, bons e ruins, pela cumplicidade...por sempre poder contar com você!

6 Ao amigo Otávio, pela amizade dedicada, pela sensatez necessária nas horas certas e pelos momentos de descontração durante a residência e o mestrado. Aos amigos do Laboratório de Inspeção de Alimentos FMVZ, Botucatu, pela convivência, pela torcida e pelo auxílio nesta caminhada. Aos amigos do Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular Animal FOA, Laércio, Sérgio, Gustavo, Zanon, Alexéia, Sílvia, Fabiane, Pedro, Lúcia, Erica, Heleno, Valquíria, Henrique, por me receberem tão bem, por todo empenho em me ajudar durante a realização da pesquisa, pelas risadas, pela amizade sincera! Aos amigos pós-graduandos, Kate, Charli e Karina, por dividirmos alegrias, dúvidas e angústias, por caminharmos juntas. A todos vocês: amigos são anjos sem asas. Ao prof. Dr. José Fernando Garcia, pela ajuda e considerações pertinentes para a realização do trabalho. Ao prof. Dr. Francisco Leydson Feitosa e à residente Rita, do Dep. de Clínica, Cirurgia e Reprodução Animal, FOA, pela ajuda e empenho no decorrer da pesquisa. Ao prof. Dr. Emmanuel Dias-Neto, do Instituto de Psiquiatria, Faculdade de Medicina USP, pelas considerações técnicas. Aos funcionários e responsáveis do Frigorífico Vangélio Mondelli Ltda. e Frigorífico Bertin Ltda.; da Fazenda Milk-Mel e da Agropecuária Katayama, e ao médico veterinário Samuel Carvalho de Aragão, pelo auxílio disponibilizando material para a realização da pesquisa. A CAPES, que através do auxílio-bolsa, ajudou na viabilização deste estudo. A Deus, pela minha vida, mas neste caminho, principalmente, por atender meus constantes pedidos por força e me fazer entender que tudo o que acontece em nossa vida faz parte do nosso aprendizado! A todos os que me ajudaram, tornando possível a realização desta pesquisa!

7 Todo o nosso conhecimento se inicia com sentimentos. Leonardo da Vinci

8 LISTA DE QUADROS Página QUADRO 1: Oligonucleotídeos iniciadores segundo a seqüência e sentido. 29 QUADRO 2: Reagentes da PCR para oligonucleotídeos iniciadores HDP2. 31 QUADRO 3: Reagentes da PCR para oligonucleotídeos iniciadores TAE. 31 QUADRO 4: Reagentes da PCR para oligonucleotídeos iniciadores SCAR K e SCAR G. 32

9 LISTA DE TABELAS Página TABELA 1: Resultados da avaliação do limiar de detecção da técnica de PCR segundo o par de oligonucleotídeos iniciadores testado e o parasita avaliado em Tampão Tris EDTA (TE). 38 TABELA 2: Resultados da avaliação do limiar de detecção da técnica de PCR segundo o par de oligonucleotídeos iniciadores testado e a fração de amostra de sangue experimentalmente contaminada com DNA de Taenia saginata. 45

10 LISTA DE FIGURAS Página FIGURA 1: Ciclo de vida da Taenia saginata em bovinos e humanos. (Fonte: 12 FIGURA 2: Fluxograma da colheita e separação das amostras avaliadas. 24 FIGURA 3: Eletroforese em gel de agarose 2% corado com brometo de etídeo, sob luz ultravioleta. DNA genômico de forma metacestóide de Taenia saginata (A) e Taenia solium (B), PM = marcador Low DNA Mass Ladder (Invitrogen Life Tecnologies, CA, USA). 34 FIGURA 4: Produtos de amplificação, por PCR, de DNA de forma metacestóide de Taenia saginata (A) e Taenia solium (B), com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores F2R1 (HDP2) em gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata. PM = padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen ), 1 = diluição 1:10; 2 = diluição 1:10 2 ; 3 = 1:10 3 ; 4 = 1:10 4 ; 5 = 1:10 5 ; 6 = 1:10 6 ; 7 = 1:10 7 ; 8 = 1:10 8 e NO = sem DNA. 35 FIGURA 5: Produtos de amplificação de DNA, por PCR, de forma metacestóide de Taenia saginata (A) e Taenia solium (B), com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores F1R1 (HDP2) em gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata. PM = padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen ), 1 = diluição 1:10; 2 = diluição 1:10 2 ; 3 = 1:10 3 ; 4 = 1:10 4 ; 5 = 1:10 5 ; 6 = 1:10 6 ; 7 = 1:10 7 ; 8 = 1:10 8 e NO = sem DNA. 36

11 FIGURA 6: Produtos de amplificação de DNA, por PCR, de forma metacestóide de Taenia saginata (A) e Taenia solium (B), com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores TAE em gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata. PM = padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen ), 1 = diluição 1:10; 2 = diluição 1:10 2 ; 3 = 1:10 3 ; 4 = 1:10 4 ; 5 = 1:10 5 ; 6 = 1:10 6 ; 7 = 1:10 7 ; 8 = 1:10 8 e NO = sem DNA. 36 FIGURA 7: Produtos de amplificação de DNA, por PCR, de forma metacestóide de Taenia saginata (A) e Taenia solium (B), com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores SCAR K em gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata. PM = padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen ), 1 = diluição 1:10; 2 = diluição 1:10 2 ; 3 = 1:10 3 ; 4 = 1:10 4 ; 5 = 1:10 5 ; 6 = 1:10 6 ; 7 = 1:10 7 ; 8 = 1:10 8 e NO = sem DNA. 37 FIGURA 8: Produtos de amplificação de DNA, por PCR, de forma metacestóide de Taenia saginata (A) e Taenia solium (B), com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores SCAR G em gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata. PM = padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen ), 1 = diluição 1:10; 2 = diluição 1:10 2 ; 3 = 1:10 3 ; 4 = 1:10 4 ; 5 = 1:10 5 ; 6 = 1:10 6 ; 7 = 1:10 7 ; 8 = 1:10 8 e NO = sem DNA. 37 FIGURA 9: Eletroforese em gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata, dos produtos de amplificação, por PCR, de DNA de forma metacestóide de Taenia saginata com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores F2R1 (HDP2), nas frações de sangue: série vermelha (A), sobrenadante (B), pellet (C) e plasma (D). PM = padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen ); 1 = 22,66 ng de DNA de forma metacestóide de T. saginata; 2 = diluição 1:10; 3 = diluição 1:10 ; 4 = 1:10 ; 5 = 1:10 ; 6 = 1:10 ; 7 = 1:10 ; 8 = 1:10 ; 9 = 1:10.

12 1:10 2 ; 4 = 1:10 3 ; 5 = 1:10 4 ; 6 = 1:10 5 ; 7 = 1:10 6 ; 8 = 1:10 7 ; 9 = 1: = DNA de sangue bovino negativo para cisticercose e NO = sem DNA. 40 FIGURA 10: Eletroforese em gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata, dos produtos de amplificação, por PCR, de DNA de forma metacestóide de T. saginata com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores F1R1 (HDP2), nas frações de sangue: série vermelha (A), sobrenadante (B), pellet (C) e plasma (D). PM = padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen ); 1 = 22,66 ng de DNA de forma metacestóide de Taenia saginata; 2 = diluição 1:10, 3 = diluição 1:10 2, 4 = 1:10 3 ; 5 = 1:10 4 ; 6 = 1:10 5, 7 = 1:10 6 ; 8 = 1:10 7, 9 = 1: = DNA de sangue bovino negativo para cisticercose e NO = sem DNA. 41 FIGURA 11: Eletroforese em gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata, dos produtos de amplificação, por PCR, de DNA de forma metacestóide de Taenia saginata com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores TAE, das frações de sangue: série vermelha (A), sobrenadante (B), pellet (C) e plasma (D). PM = padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen ); 1 = 22,66 ng de DNA de forma metacestóide de Taenia saginata; 2 = diluição 1:10, 3 = diluição 1:10 2, 4 = 1:10 3 ; 5 = 1:10 4 ; 6 = 1:10 5, 7 = 1:10 6 ; 8 = 1:10 7, 9 = 1: = DNA de sangue bovino negativo para cisticercose e NO = sem DNA. 42 FIGURA 12: Eletroforese em gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata, dos produtos de amplificação, por PCR, de DNA de forma metacestóide de Taenia saginata com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores SCAR K, das frações de sangue: série vermelha (A), sobrenadante (B), pellet (C) e plasma (D). PM = padrão de peso molecular em escada de 100

13 plasma (D). PM = padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen ); 1 = 22,66 ng de DNA de forma metacestóide de Taenia saginata; 2 = diluição 1:10; 3 = diluição 1:10 2 ; 4 = 1:10 3 ; 5 = 1:10 4 ; 6 = 1:10 5 ; 7 = 1:10 6 ; 8 = 1:10 7 ; 9 = 1: = DNA de sangue bovino negativo para cisticercose e NO = sem DNA. 43 FIGURA 13: Eletroforese em gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata, dos produtos de amplificação, por PCR, de DNA de forma metacestóide de Taenia saginata com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores SCAR G, das frações de sangue: série vermelha (A), sobrenadante (B), pellet (C) e plasma (D). PM = padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen ), 1 = 22,66 ng de DNA de forma metacestóide de Taenia saginata; 2 = diluição 1:10; 3 = diluição 1:10 2 ; 4 = 1:10 3 ; 5 = 1:10 4 ; 6 = 1:10 5 ; 7 = 1:10 6 ; 8 = 1:10 7 ; 9 = 1: = DNA de sangue bovino negativo para cisticercose e NO = sem DNA. 44 FIGURA 14: Eletroforese em gel de poliacrilimida a 8% de produtos de amplificação, por PCR, de DNA de Taenia saginata em amostras de soro bovino, fração pellet (A) e sobrenadante (B). PM = padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen ); 1 = DNA genômico de forma metacestóide de T. saginata, 2 17 = amostras de bovinos positivos para cisticercose, à inspeção post-mortem. Em C, de 2 9 = fração pellet e = fração sobrenadante, NO = sem DNA. 46 FIGURA 15: Eletroforese em gel de poliacrilimida a 8% de produtos de amplificação, por PCR, de DNA de Taenia saginata em amostras de soro bovino, fração pellet (A) e sobrenadante (B). PM = padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen ); 1 = DNA genômico de forma

14 de 100 pb (Invitrogen ); 1 = DNA genômico de forma metacestóide de T. saginata, 2 17 = amostras de bovinos negativos para cisticercose, à inspeção post-mortem. Em C, de 2 9 = fração pellet e = fração sobrenadante, NO = sem DNA. 47

15 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS µl: microlitro ρmol: picomol C. bovis: Cysticercus bovis C. cellulosae: Cysticercus cellulosae C. longicollis: Taenia longicollis D.I.F.: Departamento de Inspeção Final DNA: Desoxiribonucleic Acid (Ácido Desoxirribonucléico) dntp: deoxinucleotídeos EDTA: Ethylene diaminetetracetic Acid (Ácido Etileno Diaminotetracético) ELISA: Enzyme-linked Immunosorbent Assay g: gramas M.A.P.A.: Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento M: molar mg: miligrama MgCl2: cloreto de magnésio ml: mililitro mm: milimolar N2: nitrogênio líquido NaCl: cloreto de sódio ng: nanograma pb: pares de base PCR: Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia pela Polimerase) PCR-RAPD: PCR - Randon Amplified Polymorphic DNA PCR-REA: PCR - Restriction Enzymes Analysis PCR-RFLP: PCR - Restriction Fragment Length Polymorphism pg: picogramas R.I.I.S.P.O.A.: Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal

16 S.I.F.: Serviço de Inspeção Federal T. asiatica: Taenia asiatica T. saginata : Taenia saginata T. solium: Taenia solium Taq Pol: enzima isolada do organismo Termophylus aquaticus (Taq Polimerase) U: unidade

17 SUMÁRIO Página RESUMO ABSTRACT 1. INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA OBJETIVOS Objetivo geral Objetivos específicos MATERIAL E MÉTODOS Amostras Extração de DNA De formas metacestóides de T. saginata e T. solium De amostras de sangue negativas para cisticercose experimentalmente contaminadas com DNA de formas metacestóides de T. saginata De amostras de soro de bovinos naturalmente infectados com T. saginata Amplificação de DNA através da Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR)... 28

18 4.3.1 Oligonucleotídeos iniciadores Condições do teste Limiar de detecção da Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) RESULTADOS Concentração de DNA genômico extraído de formas metacestóides de T. saginata e T. solium Limiar de detecção da Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) com DNA de formas metacestóides de T. saginata e T. solium diluídos em tampão TE Limiar de detecção da Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) em amostras de sangue negativas para cisticercose e experimentalmente contaminadas com DNA de forma metacestóide de T. saginata Amostras de soro de bovinos positivos e negativos para cisticercose ao exame post-mortem DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS... 56

19 RESUMO / ABSTRACT

20 RESUMO MENOSSO, V. A. Amplificação de DNA circulante para o diagnóstico da cisticercose bovina f. Dissertação (Mestrado) Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia de Botucatu, Universidade Estadual Paulista, Botucatu. A cisticercose bovina é resultante da ingestão de ovos de T. saginata proveniente de pastagens e águas contaminadas fornecidas aos animais. É causa de preocupações na área de saúde pública por ocasionar a teníase em humanos, mas causa sérios prejuízos na indústria agropecuária e aos pecuaristas, devido às condenações ou tratamentos de frio ou salga pelas quais as carcaças consideradas positivas são submetidas. O método de diagnóstico rotineiramente utilizado para a cisticercose bovina tem sido a inspeção post-mortem. Muitos pesquisadores têm desenvolvido métodos de diagnóstico antemortem, com especificidade e sensibilidade variadas. O presente estudo teve como objetivo avaliar a aplicação da amplificação de DNA circulante de T. saginata, através da Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR), como ferramenta diagnóstica para cisticercose bovina. Para a realização da pesquisa foram utilizadas amostras de sangue de bovinos abatidos em frigoríficos sob S.I.F., segundo apresentarem ou não cisticercose. Inicialmente avaliaram-se cinco pares de oligonucleotídeos iniciadores através da determinação do limiar de detecção da PCR de cada um deles. Objetivou-se ainda estabelecer qual a fração do sangue experimentalmente contaminado resultaria em amplificação de fragmentos de DNA através da PCR, para posteriormente avaliar a aplicabilidade da PCR em amostras de sangue de bovinos naturalmente infectados com T. saginata. O melhor limiar de detecção foi observado com o uso do par de oligonucleotídeos iniciadores SCAR K, nas frações de sangue denominadas pellet e sobrenadante. As amostras de sangue de animais positivos para cisticercose na inspeção de rotina e submetidos a PCR não resultaram em amplificação do fragmento de DNA desejado, sugerindo que a baixa carga parasitária possa ter influenciado os resultados. Palavras-chaves: Cisticercose bovina; Taenia saginata; PCR; DNA.

21 ABSTRACT MENOSSO, V. A. Amplification of circulating DNA to the diagnosis of bovine cysticercosis f. Dissertation (Master) - University of Veterinary Medicine and Zootechinie of Botucatu, Universidade Estadual Paulista, Botucatu. Bovine cysticercosis is caused by the ingestion of T. saginata eggs from contaminated pastures and water provided to animals. It is a public health problem by causing the taeniasis in human beings, but it also causes serious damages in the agro-cattle industry and to the cattle raisers by de condemnation or treatment by coldness or salting of carcass detected as positive. Routinely bovine cysticercosis diagnosis has been the post-mortem inspection. Several researchers have developed ante-mortem diagnosis methods, with variable specificity and sensitivity. The present study aimed at evaluating the amplification of circulating DNA of T. saginata, by the Polymerase Chain Reaction (PCR), as a diagnostic tool to bovine cysticercosis. Blood samples from bovines slaughtered under Federal Meat Inspection abattoirs were taken according to the presence or absence of cyst forms. Initially, we evaluated five primers and established which blood fraction experimentally contaminated resulted in DNA fragment amplification by PCR. The best detection limit was observed with the use of the SCAR K primers, in the blood fractions denominated pellet and supernatant. Blood samples of naturally infected animals considered positive in the routine inspection didn t result in the desired DNA fragment amplification by PCR. Key words: Bovine cysticercosis; Taenia saginata; PCR; DNA.

22 INTRODUÇÃO

23 5 1. INTRODUÇÃO O complexo teníase-cisticercose, causado pelos cestóides Taenia saginata (T. saginata) e Taenia solium (T. solium), tem distribuição cosmopolita e ocorre mais freqüentemente em países em desenvolvimento. O homem adquire a teníase quando ingere carne crua ou mal cozida contendo formas metacestóides viáveis de Taenia sp. e pode desenvolver a cisticercose quando ingere ovos de T. solium presentes, principalmente, em alimentos ou água contaminados. O bovino desenvolve cisticercose ao ingerir ovos de T. saginata eliminados pelo homem. A cisticercose bovina causa prejuízos econômicos devido ao tratamento ou condenação de carcaças contaminadas. A única fonte de dados sobre a ocorrência desta zoonose tem se baseado nas informações obtidas junto ao Serviço de Inspeção Federal (S.I.F.) através dos registros constantes dos mapas de abate, a partir do exame postmortem realizado rotineiramente em frigoríficos e matadouros. Deste modo, o S.I.F. desempenha papel fundamental no controle do complexo teníase-cisticercose, com a inspeção sanitária e destinação adequada das carcaças contaminadas. Muitos autores têm desenvolvido testes sorológicos para a detecção de antígenos e anticorpos circulantes que possam ser utilizados antes do abate dos animais. Alguns pesquisadores têm obtido bons resultados, embora os animais naturalmente infectados apresentem carga parasitária baixa, o que diminui a sensibilidade e especificidade do teste. Nos últimos anos, técnicas moleculares baseadas na PCR têm demonstrado serem boas ferramentas diagnósticas permitindo ainda a diferenciação interespécies. A aplicação das técnicas de PCR pode ser útil não só na inspeção da teníase e da cisticercose, mas também para o controle epidemiológico destas infecções. Alguns autores têm demonstrado a presença de fragmentos de DNA de Taenia sp. em fluidos biológicos,

24 6 sugerindo ser esta uma possibilidade para a cisticercose bovina. Assim sendo, embasados nestes fatores e vislumbrando a necessidade do desenvolvimento de um método diagnóstico ante-mortem para a cisticercose bovina, esta pesquisa foi realizada, com o intuito de testar a PCR como ferramenta para o diagnóstico da cisticercose bovina.

25 REVISÃO DA LITERATURA

26 8 2. REVISÃO DA LITERATURA O complexo teníase-cisticercose representa um importante problema para a saúde pública, pela possibilidade de infecção do homem, e para o setor agropecuário, pelas perdas econômicas. A teníase e a cisticercose são duas entidades distintas causadas pela mesma espécie de cestóide, em diferentes fases do seu ciclo de vida (PAWLOWSKI, 1982; ACHA & SZYFRES, 1986). O ciclo da tênia implica em dois hospedeiros e uma fase de vida livre. Com relação à população de parasitas há três fases: adulto no hospedeiro definitivo, ovos no ambiente e metacestóides (fase larvar) no hospedeiro intermediário (GEMMEL & LAWSON, 1982). O homem é o único hospedeiro definitivo da forma adulta tanto da T. saginata como da T. solium, enquanto os bovinos domésticos e os suínos, respectivamente, são os hospedeiros intermediários, apresentando a forma metacestóide em seus tecidos. O estágio larvar ou metacestóide da T. saginata é usualmente encontrado em músculos e vísceras dos animais, representando problemas econômicos para a indústria da carne e risco para a saúde pública (SOULSBY, 1968; PAWLOWSKI, 1982; FORTES, 1997; URQUHART et al., 1998). A problemática na pecuária envolve a condenação ou tratamento das carcaças levando à diminuição do valor da carne, além da perda de peso dos animais infectados. Países que têm alta prevalência de cisticercose são afetados indiretamente, pois há uma inibição no desenvolvimento desta lucrativa indústria (PAWLOWSKI & SCHULTZ, 1972). De suma importância para a saúde pública é quando o homem, além de hospedeiro definitivo, se torna o hospedeiro intermediário desenvolvendo, principalmente no sistema nervoso central, a forma metacestóide da T. solium. A cisticercose humana é adquirida pela

27 9 ingestão de ovos viáveis de T. solium através da auto-infecção interna, auto-infecção externa ou hetero-infecção, sendo a forma mais comum a neurocisticercose, cuja sintomatologia mais freqüente é a epilepsia (ACHA & SZYFRES, 1986; NASCIMENTO, 2000). A Taenia saginata (Goeze, 1782) pertence ao Filo Platyhelminthes, à classe Cestoidea (Southwell, 1930), à ordem Ciclophillidea (Wardle et al., 1974), à família Taeniidae (Ludwig, 1866) e ao gênero Taenia (Linnaeus, 1758) (SOULSBY, 1968; FORTES, 1997; URQUHART et al., 1998). Nos séculos XVIII e XIX, Goeze e Leuckart, fizeram a distinção entre T. solium e T. saginata. Em 1861, Leuckart, elucidou o ciclo de vida da T. saginata administrando a bezerros proglotes por via oral, obtendo experimentalmente a forma metacestóide de T. saginata. Mais tarde, em 1869, Oliver obteve a forma adulta do parasita ao infectar homens com metacestóides de bovinos (PAWLOWSKI & SCHULTZ, 1972; LLOYD, 1998). O parasita adulto da T. saginata habita o intestino delgado do homem e tem comprimento médio de 6 a 8 metros, podendo alcançar 15 metros (URQUHART et al., 1998) e persistir por 25 a 30 anos, mas geralmente vive em média de 10 a 15 anos (PESSOA, 1982). A longevidade da T. saginata e sua grande produção e resistência de ovos são características importantes na epidemiologia da doença. Um único hospedeiro pode eliminar até mais de 500 mil ovos diariamente, sejam nas proglotes ou livres nas fezes. A transmissão indireta é a mais característica da doença e as vias de transmissão abrangem a água, o solo, as pastagens, a silagem, o feno, os vetores mecânicos e os portadores. Os ovos podem ser encontrados contaminando mãos, região perianal e roupas pessoais e de cama de indivíduos parasitados (PAWLOWSKI, 1982). A resistência dos ovos ao meio externo é bastante grande, dependendo da umidade relativa do ar e da temperatura ambiente, suportando, inclusive, a maioria dos processos de tratamento de águas residuárias. Efluentes de esgoto, mesmo previamente tratados podem,

28 10 portanto, conter ovos viáveis que se disseminam pelos rios e campos, quando há inundações ou quando são usadas para a irrigação. Porém, o tratamento convencional da água de abastecimento como floculação, sedimentação e filtração são suficientes para eliminar os ovos. De uma forma geral, os ovos podem permanecer viáveis durante semanas e até meses (PAWLOWSKI & SCHULTZ, 1972; LAWSON & GEMMELL,1983; REY, 1992; REIFF, 1994). A transmissão também pode ocorrer pela ordenha manual, através das mãos contaminadas com matéria fecal do ordenhador. A contaminação direta do feno ou das manjedouras, que é incomum e a qual pode ocorrer quando um carreador humano manuseia ou alimenta bovinos com as mãos contaminadas, tem dado origem a pequenas epidemias de cisticercose bovina (PAWLOWSKI, 1982; REY, 1992). A infecção do homem pela teníase é condicionada pelo consumo de carne bovina e pelo hábito de comê-la crua ou mal cozida. O homem infecta-se pela ingestão de metacestóides viáveis, os quais vão desinvaginar seu escólex ao longo do aparelho digestivo, se fixar na mucosa intestinal e desenvolver o parasita adulto (PESSOA, 1982; REY, 1992; SCHANTZ et al., 1994). Fatores como o modo de preparo da comida, hábitos alimentares e preferências por consumir carne crua ou insuficientemente cozida ou assada, contendo metacestóides viáveis, contribuem para aumentar a prevalência de portadores de T. saginata (ACHA & SZYFRES, 1986; LLOYD, 1998). Entretanto, os fatores que levam à ingestão destas carnes englobam fatores ecológicos, econômicos e etnológicos. Os fatores ecológicos são mais importantes na transmissão da T. saginata do homem para os animais, já que as únicas limitações geográficas da infecção são as regiões não habitadas pelo homem. Do ponto de vista econômico, a produção mundial de carne tem aumentado muito e em muitas áreas há um contato grande entre animais e homem. A

29 11 transmissão entre animal e homem depende de fatores etnológicos isto é, hábitos humanos, religião e crença (PAWLOWSKI & SCHULTZ, 1972). Deste modo, fatores econômicos, culturais e religiosos tendem a expor menos ou mais certas classes, grupos sociais ou até mesmo determinadas populações (REY, 1992). Dentre os fatores determinantes do complexo teníase-cisticercose pode-se citar: baixa condição sócio-econômica; saneamento básico precário; deficiente educação em saúde, hábitos alimentares e de higiene pessoal; criação anti-higiênica de animais; precariedade dos serviços de vigilância sanitária de alimentos e o comércio clandestino de carnes em elevação (GERMANO, 1991). Quando os bovinos ingerem ovos infectantes presentes no meio, as oncosferas dos embriões são ativadas e liberadas através da ação de sucos digestivos, como a pepsina e sais biliares e caminham em direção à mucosa intestinal onde penetram e chegam às vênulas, para em seguida atingirem a corrente sanguínea (ACHA & SZYFRES, 1986; REY, 1992; NASCIMENTO, 2000). As oncosferas fixam-se então, e desenvolvem-se para a forma metacestóide em qualquer tecido mole do organismo, com predileção para o tecido conjuntivo de músculos esqueléticos e cardíacos, principalmente àqueles de maior movimentação e oxigenação como masseter, língua, coração, diafragma e cérebro (REY, 1992; LLOYD, 1998; NASCIMENTO, 2000). A Figura 1 representa o ciclo de vida da T. saginata em bovinos e em humanos.

30 12 FIGURA 1: Ciclo de vida da Taenia saginata em bovinos e humanos. (Fonte: A forma metacestóide de T. saginata apresenta-se como uma vesícula translúcida, de aspecto perláceo, ovóide ou alongada, medindo de sete a doze milímetros de comprimento por quatro a seis milímetros de largura (REY, 1992). Em oito a dez semanas os metacestóides se tornam infectantes para o homem e, em até nove meses, a maior parte deles começa a se degenerar, morrem e se calcificam (ACHA & SZYFRES, 1986; LLOYD, 1998). A presença de formas metacestóides na musculatura de bovinos não tem sido associada a nenhuma sintomatologia clínica (ACHA & SZYFRES, 1986; URQUHART et al., 1998). Entretanto, a infecção experimental de bovinos com altas doses de ovos de T. saginata pode resultar em quadros de miosite e miocardite degenerativa, podendo

31 13 levar até à morte ou à manifestação de alguns sintomas tais como hipertermia, sialorréia, anorexia, debilidade e rigidez muscular (PAWLOWSKI, 1982; ACHA & SZYFRES, 1986). Blazek & Schramlová (1980) e Sterba & Dykova (1978) em pesquisas sobre a patogenia das formas metacestóides de T. saginata em tecido muscular observaram uma reação inflamatória elevada no primeiro mês pós-infecção. O complexo teníase-cisticercose é cosmopolita tendo uma maior prevalência nas zonas rurais de países da América Latina, Ásia e África (SCHANTZ et al., 1994). Devido a sua importância para pecuária e para a saúde pública, esta zoonose deve ter determinadas sua freqüência nas diferentes regiões do país, bem como a procedência dos animais abatidos, para a adoção de medidas de controle e profilaxia (SCHANTZ et al., 1994; REIS et al., 1996). Os dados da literatura sobre cisticercose bovina baseiam-se principalmente em anotações da inspeção, a qual é realizada de modo diferente em alguns países, ou até não é realizada, tornando impraticável a adoção de uma padronização (PAWLOWSKI & SCHULTZ, 1972; THAKUR, 1979). No Brasil, o Serviço de Inspeção Federal (S.I.F.) tem atuado como a única fonte de dados sobre a ocorrência e a quantificação da enfermidade, assim como a procedência dos animais abatidos (SOUZA et al., 1997). Em termos práticos é freqüente encontrarmos poucos metacestóides em uma carcaça, diferente do que acontece nas infecções experimentais, nas quais os animais são infectados maciçamente. As pesquisas que discorrem sobre os locais de predileção refletem bovinos com grandes infecções, o que pode não corresponder à realidade (McCOOL, 1979). Minozzo et al. (2002) com o objetivo de avaliar a distribuição anatômica dos metacestóides nas carcaças de bovinos, realizou infecção experimental com ovos de T. saginata em quatro animais, abatendo-os 90 dias pós-infecção. A maioria dos metacestóides