AVALIAÇÃO DE TESTES DE IDENTIFICAÇÃO E SENSIBILIDADE QUE PODEM SER UTILIZADOS EM LABORATÓRIOS CLÍNICOS EM CEPAS DE CANDIDA spp

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1 ALESSANDRA NAVARINI AVALIAÇÃO DE TESTES DE IDENTIFICAÇÃO E SENSIBILIDADE QUE PODEM SER UTILIZADOS EM LABORATÓRIOS CLÍNICOS Tese apresentada ao curso de Pós Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. São Paulo 2007

2 ALESSANDRA NAVARINI AVALIAÇÃO DE TESTES DE IDENTIFICAÇÃO E SENSIBILIDADE QUE PODEM SER UTILIZADOS EM LABORATÓRIOS CLÍNICOS Tese apresentada ao curso de Pós Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. Orientador: Profª. Drª. Lycia Mara Jenne Mímica Co-orientador: Profª. Drª. Marinês Dalla Valle Martino São Paulo 2007

3 FICHA CATALOGRÁFICA Preparada pela Biblioteca Central da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo Navarini, Alessandra Avaliação de testes de identificação e sensibilidade que podem ser utilizados em laboratórios clínicos em Cepas de candida ssp./ Alessandra Navarini. São Paulo Dissertação de Mestrado. Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo Curso de pós-graduação em Ciências da Saúde. Área de Concentração: Ciências da Saúde Orientador: Lycia Mara Jenne Mimica Co-Orientador: Marinês Valle Martino 1. Candida 2. Teste de sensibilidade microbiana 3. Resistência fúngica a múltiplas drogas BC-FCMSCSP/

4 SÚMARIO 1 INTRODUÇÃO Revisão de literátura Resistência aos antifúngicos Características das diferentes espécies de Candida spp Características das colônias de Candida spp Identificação das espécies de Candida spp Meios cromogênicos CandiFast Auxanograma Teste de sensibilidade Macrodiluição (Diluição em caldo) Etest Disco-difusão (Método de Kirby-Bauer) Antifúngicos Anfotericina B Flucitosina (5-fluorocitosina) Cetoconazol Itraconazol Fluconazol OBJETIVOS MATERIAL E MÉTODO Idenficação das cepas CHROMagar Candida (CHROMagar, França) CANDIFAST (International Micróbio, França) Vitek (biomérieux, França) Teste de Susceptibilidade aos antifúngicos Etest (AB Biodisk, Suécia) CandFast (International Microbio, França) Disco-difusão (Sensifungidisc, Cecon, Brasil) RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÃO ANEXOS Protocolo de recebimento do projeto de pesquisa do Comitê de Ética da Santa Casa de São Paulo REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...46

5 1 - INTRODUÇÃO Os crescentes dados reportando o aumento da resistência dos fungos contra as drogas antifúngicas comumente utilizadas vem tornando-se fato preocupante. Conseqüentemente, um teste de sensibilidade in vitro para estes agentes deve ser preciso, útil clinicamente e fácil de realizar, a fim de orientar a terapia antifúngica e monitorar os padrões de resistência existentes. No mundo inteiro, as infecções fúngicas invasivas tem tido um considerável aumento em freqüência e importância clínica, sendo esta tendência atribuída principalmente ao crescente grupo de pacientes imunocomprometidos, para quem as infecções fúngicas tornaram-se importante causa de morbidade e mortalidade nos últimos anos (van Eldere et al, 1996). Assim, tanto o diagnóstico do agente etiológico como os testes de susceptibilidade aos antifúngicos assumiram um papel importante no laboratório clínico. As ferramentas para o diagnóstico deste grupo de agentes vão desde a semeadura em meios tradicionais e testes com açúcares, como no auxanograma (Koneman, 2001), até métodos automatizados. A utilização de meios cromogênicos tem sido ampla, devido à praticidade e custos. As Candidas spp são isoladas em 8 a 10% das bacteriemias hospitalares; é o fungo mais freqüente em Unidades de Terapia Intensiva, com mortalidade descrita de 10 a 49% e permanência hospitalar prolongada em 3 a 30 dias; nos EUA mais de 1 bilhão dólares por ano são gastos com estas infecções (Ashley e cols., 2006). Existem mais de 100 espécies descritas, Candida albicans sendo responsável por 90 a 100% das infecções com envolvimento de mucosas, e 50 a 70% das candidemias. Em 95 a 97% dos quadros clínicos des bacteriemias são isoladas Candida albicans, Candida glabrata, Candida parapsilosis, Candida tropicalis e Candida krusei. (Ashley e cols., 2006) Nos dias atuais observa-se uma maior freqüência de infecções fúngicas, especialmente nos pacientes de maior risco, junto à expansão da lista de patógenos potenciais anteriormente considerados componentes da microbiota do ser humano. É fundamental que se tenha um monitoramento em relação às infecções fúngicas, especialmente nos pacientes internados em 1

6 unidades de terapia intensiva, portadores de doenças degenerativas ou neoplásicas, submetidos a transplantes de órgãos, recém-natos prematuros, assim como pacientes com AIDS. Há atualmente aumento de opções terapêuticas antifúngicas, que na maioria das vezes são usadas empiricamente, o que leva a um risco de modificação no perfil de sensibilidade dos fungos. Com o aumento da incidência de infecções graves por fungos, especialmente entre pacientes graves e ou imunodeprimidos, a utilização de testes de sensibilidade aos antifúngicos tem se mostrado útil, pois permite a escolha da droga mais adequada para tratamentos dos processos infecciosos causados por leveduras e outros fungos. Os antifúngicos comumente testados são: econazol, fluconazol, miconazol, cetoconazol, anfotericina B e nistatina. Se um fungigrama mostrar sensibilidade para fluconazol, este poderá ser usado com segurança, na maioria dos casos, evitando assim o uso empírico de drogas como a caspofungina, anfotericina B ou voriconazol.evidências mostram que Candida parapsolosis, Candida tropicalis e Candida albicans são as mais prevalentes no País. Espécies como Candida glabrata e Candida krusei, resistentes ao fluconazol, são menos prevalentes.(pfaller MA et al., 2001) Como medida de controle e otimização terapêutica, recomendam-se fazer culturas, que permitirão a identificação das espécies de Candida, e uma melhor utilização dos antifúngicos. (Pfaller MA et al., 2001) Portanto, a escolha do antifúngico vai depender do perfil microbiológico da instituição e da gravidade do caso. Se a instituição apresenta incidência significativa de espécies fluconazol resistentes ou se o paciente fez uso recente de fluconazol e o estado clínico do paciente é grave, a escolha do fluconazol, até que a identificação da espécie esteja disponível, poderá ser fatal. Neste caso, anfotericina B, caspofungina ou voriconazol poderão ser opções adequadas.a função renal ou o risco de piora clínica é que vai determinar qual a melhor escolha. Mais da metade dos pacientes com candidemia (em torno de 70%), já apresentam hemocultura negativa após 48/72 horas de tratamento adequado, sendo então indicado colher hemoculturas de controle neste período. A maioria dos casos pode requerer também a retirada do 2

7 cateter venoso central, sendo esta indicação menos precisa nos pacientes neutropênicos. Neste grupo, a fonte de candidemia muitas vezes é endógena, particularmente nos pacientes com mucosite significativa. Se houver persistência da candidemia, considerar o insucesso, por não se ter retirado o cateter ou por resistência do agente. (Pfaller MA et al., 2002) Revisão de literatura As leveduras do gênero Candida spp. são agentes causadores de infecção hospitalar e representam um desafio para a sobrevida de pacientes com doenças graves e aqueles em período pós-operatório. Hospitais norte-americanos com o sistema de vigilância operante notificaram Candida spp. como 6 patógeno nosocomial e a 4 causa mais comum de infecções de corrente sanguínea adquiridas em hospitais, sendo a manifestação clínica mais comum nas candidíases hospitalares a febre.(colombo et al, 2003) O número de infecções fúngicas tem aumentado nos últimos anos, a Candida spp. é apontada como um importante agente. Infecções por Candida em corrente sanguínea representam problema relevante.(colombo et al, 2004). Os casos de candidemia em hospitais aumentaram substancialmente nas últimas décadas em diferentes partes do mundo. No Brasil, foi feito um estudo epidemiológico reunindo dados sobre infecções de corrente sanguínea, documentados em quatro hospitais da cidade de São Paulo. Durante um período de 12 meses - março/2002 a fevereiro/ um total de episódios de bacteremias e fungemias foram avaliados, sendo que a Candida spp. respondeu por 4,3 % do total das infecções de corrente sanguínea. Outro aspecto é o custo decorrente do atendimento ao paciente. Estudo realizado nos Estados Unidos definiu como sendo de US$44.536,00 o custo relacionado ao atendimento privado de cada paciente com candidemia, sobretudo devido ao prolongado tempo de internação. É possível concluir que a candidemia é um problema de saúde pública em todo mundo. Também é importante observar que além da sua alta incidência nos hospitais terciários, os índices de mortalidade geral chegam a 60% e de mortalidade atribuída, a cerca de 40%(Colombo, 2001). 3

8 Fatores de risco para infecções hematogênicas por Candida spp, são fatores que aumentam a colonização intestinal por Candida spp (uso de antibióticos, íleo paralítico, oclusão intestinal) ou determinem atrofia ou lesão de mucosa intestinal (jejum prolongado, nutrição parenteral total, hipotensão, quimioterapia) podem potencializar o fenômeno de translocação no tubo gastrointestinal. Infecções hematogênicas por Candida spp, também podem ser adquiridas através do contato das mãos de profissionais de saúde com pacientes portadores de cateteres vasculares centrais. No Brasil, os dados obtidos demonstram que candidemia também é uma complicação infecciosa encontrada em pacientes portadores de diferentes doenças degenerativas ou neoplásicas, internados por períodos prolongados e submetidos a procedimentos invasivos, antibióticos de amplo espectro e quimioterápicos..(colombo et al, 2004) A sensibilidade de hemocultura para Candida spp. é baixa; aproximadamente, 50% dos pacientes com infecção invasiva por Candida spp podem ter culturas negativas. Além disso, se houver infecção bacteriana concominante, pode diminuir o isolamento destas leveduras.(zardo, 2004). Na candidemia, a disseminação pode ocorrer aos múltiplos órgãos resultando na formação de microabcessos, lesões cutâneas embólicas, endocardites, meningite, artrite, e outros (Zardo, 2004). Estudo prospectivo, em pacientes cirúrgicos de UTI, mostrou que 38% de 29 pacientes desenvolveram infecção após colonização. A colonização pode ser demonstrada por análise de três ou mais amostras, coletadas do mesmo local ou de sítios diferentes, do mesmo paciente, em dias consecutivos. (Agência Nacional de Vigilância Sanitária, 2006). Candidíase expressa a variedade de relações que ocorrem entre hospedeiro e microbiota autóctone, isto é, do comensalismo à doença sistêmica fatal (Silva et al, 2002). Leveduras do gênero Candida spp são responsáveis pela colonização, por infecções fúngicas superficiais em imunocompetentes e por infecções sistêmicas em imunodeprimidos. A variedade de apresentações da doença leva á necessidade de utilização de diferentes métodos diagnósticos e esquemas terapêuticos. 4

9 A variabilidade de comportamento das diferentes espécies de Candida spp criou a necessidade de desenvolvimento de métodos rápidos e fáceis para sua identificação. O Chromagar Candida, por exemplo, mostrou se método sensível além de específico para identificação presuntiva das espécies mais comumente isoladas de leveduras do gênero Candida spp. (Swanson et al, 1996). A identificação correta e precisa do agente é a base para caracterização epidemiológica das infecções, assim como também para escolha de tratamento. Desta maneira, métodos rápidos e sensíveis de identificação de Candida spp são de extrema utilidade em laboratórios de rotina (Almeida et al, 2001). As Candidas glabrata têm sido um patógeno presente em pacientes nas unidades de terapia intensiva. (Bodey et al, 2002; Zardo, Mezzari, 2004). Embora a susceptibilidade das leveduras do gênero Candida spp. aos antifúngicos disponíveis seja variável, nem sempre uma determinada amostra isolada segue o padrão geral. Essa é uma das razões da crescente importância dos testes de susceptilidade. O esforço para padronização desses testes culminou na elaboração da metodologia M27-A do National Committee for Clinical Laboratory Santdards (NCCLS atual CLSI, 1995 e Rex et al, 2000). O método do Etest, utilizado para determinar in vitro a susceptibilidade aos antifúngicos, é método comparável ao M27-A do CLSI, porém mais simples e de fácil incorporação á rotina laboratorial (Matar et al, 2003 e Croco et al, 2004). Na rotina do laboratório de micologia é importante adequar métodos que possibilitem avaliar a susceptibilidade antifúngica devido ao aumento da resistência dessas leveduras e, uma conseqüente diminuição do arsenal terapêutica disponível. O conhecimento da sensibilidade às drogas torna possível otimizar o tratamento (Zardo, Mezzari, 2004). 5

10 O método de determinação precisa ser reprodutível, econômico, fácil, rápido, com boa correlação clínica, utilizando tecnologia que possa ser executada na rotina laboratorial. Em 1982, o CLSI estabeleceu um sub-comitê para padronizar uma metodologia capaz de avaliar a suscetibilidade in vitro das leveduras. Posteriormente, outros métodos foram desenvolvidos, incluindo os de difusão de disco, Etest, métodos colorimétricos e o de macro e microdiluição em caldo. Para o CLSI, o método de diluição em caldo é o de referência, com uma reprodutibilidade intra e interlaboratorial acima de 90%. O método padrão do CLSI, apesar da boa reprodutibilidade, é um método extremamente trabalhoso e demorado. O teste de difusão em disco e o Etest têm se mostrado eficaz nos casos de isolados susceptíveis, mas não nos resistentes, intermediário ou dose-dependentes. Uma alternativa seria o uso desses testes para rastreamento e o preconizado pelo CLSI, para confirmação da resistência do isolado. Os estudos com genotipagem tem demonstrado que a maioria das infecções por Candida spp. é proveniente de fontes endógenas. Eventualmente, as mãos dos trabalhadores da área da saúde podem também ser veículo de transmissão do agente (Voss A et al, 2001). Métodos moleculares de genotipagem das espécies de Candida spp. têm sido usados, baseados na análise molecular do DNA desses patógenos. Os resultados de alguns estudos têm demonstrado baixa sensibilidade e são incapazes de reproduzir os resultados obtidos através de metodologias fenotípicas devido, principalmente, à falta de padronização dos procedimentos genotípicos (Espinel-Ingroff et al, 1999). O método de Southern blot tem sido utilizado pela alta reprodutibilidade e poder discriminatório. Nesse método, quando os pacientes estão colonizados por cepas diferentes de Candida spp. ao mesmo tempo, estas podem ser identificadas Resistência aos antifúngicos Os novos triazólicos como o fluconazol, são comumente utilizados no tratamento das micoses, e na profilaxia de pacientes com risco de desenvolverem infecções fúngicas, pois são menos tóxicos do que os poliênicos. A anfotericina B, uma droga poliênica, tem sido considerado 6

11 padrão ouro para o tratamento de infecções fúngicas de maior gravidade, sua toxicidade limita seu uso (Burgess et al, 2000). Com a introdução dos antifúngicos azólicos, especialmente o fluconazol e itraconazol, que possuem boa biodisponibilidade via oral e baixa incidência de efeitos adversos, uma nova era no tratamento das infecções fúngicas se iniciou. Seu espectro de ação inclui leveduras e fungos dimórficos. O fluconazol, azólico com maior penetração no sistema nervoso central, tem se mostrado também efetivo em outras situações clínicas, como na candidíase oral e esofagiana de pacientes com SIDA, transplantes na medula óssea e em pacientes transplantados renais (Ruhnke et al, 1994). A análise de isolados de Candida albicans provenientes de pacientes com infecções recorrentes, tem mostrado que a resistência ao fluconazol ocorre nas mesmas cepas que anteriormente eram susceptíveis. Isso confirma os dados de estudos de que as cepas são modificadas ao longo da exposição do paciente à droga (Ruhnke et al, 1994). Desenvolveram infecção pelo mesmo genótipo do fungo, porém com concentração inibitória mínima (CIM) mais elevada após o uso do fluconazol.os isolados resistentes ao fluconazol tem se tornado mais freqüentes em virtude do aumento do uso dos azólicos na terapêutica. (Ruhnke et al, 1994). A Candida krusei é intrínsicamente resistente ao fluconazol. Os valores de CIM para os isolados de Candida glabrata são variáveis, porém freqüentemente mais altos do que para Candida albicans. O prognóstico na candidemia por Candida albicans é melhor do que por Candida glabrata, em pacientes neutrôpenicos, há uma menor capacidade de resposta ao patógeno agressor (Bodey et al, 2002). O aumento da fungemia por Candida glabrata tem ocorrido em instituições com um maior número de pacientes leucêmicos e pós-transplantados de medula que receberam profilaxia com fluconazol. A profilaxia com fluconazol deve ser reservada para pacientes com risco de 7

12 desenvolver fungemia. É necessário conhecer o mecanismo de resistência das espécies de Candida spp. ao fluconazol para auxiliar no desenvolvimento de estratégias em novas ações terapêuticas (Bodey et al, 2002). Candida albicans, Candida parapsilosis e Candida tropicalis permanecem susceptíveis aos polienos, flucitosina, azólicos e equinocandinas. Candida glabrata é intrinsecamente menos susceptível ao fluconazol e anfo B, é bastante sensível às equinocandinas, e também ao voriconazol e posiconazol (pode haver resistência cruzada aos azólicos).candida krusei além da sensibilidade reduzida ao fluconazol, na qual também pode ser resistente a anfotericina B e flucitosina, porém bastante sensível aos azólicos de espectro estendido e equinocandinas.(ashley e cols.,2006) Características das diferentes espécies de Candida spp. Candida albicans: é o patógeno mais comum nas candidíases cutâneas e de orofaringe, porém as espécies não albicans têm aumentado em número e em importância nas candidíases vaginal e sistêmica (MacDonald et al, 1998).Estima-se que seja responsável por 44% das fungemias na América Latina e 62% Europa, ocorrendo menos freqüentemente conforme o avançar da idade, exposição aos antifúngicos e dias de internação em terapia intensiva.considerada usualmente de origem endógena, também é bem documentada sua transmissão intra-hospitalar através das mãos de profissionais e objetos. (Kauffman, Carol A. et. al., 2006) Candida tropicalis: Relacionada a infecções endógenas; colonização prévia do trato gastrintestinal e outros sítios antes de causar fungemia e formas sistêmicas de candidíase. Apresentando ainda resistência a vários azólicos de última geração.tem importância aumentada em pacientes com leucemia, trasnplantes de medula óssea, desenvolvendo infecção em cerca de 60-80% dos neutropênicos colonizados.sua incidência está relacionada ao uso de tratamento profilático com fluconazol sendo, em princípio, altamento susceptível a este antifúngico.é 8

13 considerada a 4ª causa de fungemia nos EUA, sendo que na América Latina a Candida glabrata a espécie mais comum (20%). (Ashley e cols., 2006) Candida parapsilosis: Mais relacionada a infecções exógenas; sem prévia colonização em outros sítios produz fungemia, endocardite, artrite e peritonite. Em cateteres forma biofilmes que protege a levedura contra os fármacos. É a 2ª causa mais comum fungemia na Europa, sendo importante causa em pacientes hospitalizados fazendo uso de cateteres. Tem a característica de surtos de infecção intra-hospitalar e tem capacidade de colonizar mãos de profissionais de saúde, neonatos, cateter endovasculares e contaminando nutrição parenteral. (Ashley e cols.,2006) Candida krusei: Implicada na colonização prévia do trato gastrintestinal e outros sítios, causando fungemia e formas sistêmicas de candidíase, sendo resistente ao fluconazol. Estima-se seu isolamento em 2-4% dos quadros clínicos bacteriemia, principalmente nos locais onde o fluconazol é muito utilizado para profilaxia de infecções fúngicas e neutropênicos previamente colonizados. È comumente resistênte ao fluconazol conhecida, também podendo exibir baixa sensibilidade a anfotericina B e flucitosina tendo a taxa de mortalidade mais elevada dentre todas as espécies, estimada em 80%.(Ashley e cols.,2006) Candida glabrata: Apresenta uma virulência aumentada; coloniza vários sítios em um mesmo paciente. Cepas resistentes aos azólicos em fungemia com alta letalidade (Paula, 2003). Trata-se de fungo oportunista importante e potencialmente resistente, com incidência crescente nos EUA, sendo responsável por 22% das fungemias neste país e 4-6% destas infecções na América Latina.Raramente é responsável por colonização e infecção em neonatos e crianças, 9

14 aumentando consideravelmente com o avançar de idade, sendo relativamente resistente ao fluconazol.(ashley e cols., 2006) Características das colônias de Candida spp Crescem bem em meio Sabouraud e as colônias têm coloração branca a creme, de aspecto que varia desde cremosas e lisas a rugosas e sulcadas. Possuem peseudomicélio bem desenvolvido ou rudimenter e algumas espécies apresentam vários micélios verdadeiros e reproduzem-se por brotamento do blastoconídio. (Koneman, 2001) Identificação das espécies de Candida spp Meios cromogênicos Uma forma prática e rápida de identificar as espécies de Candida spp é a utilização de meios cromogênicos. Neles após a semeadura do agente a ser identificado conforme a coloração e outras características do crescimento obtem-se sua identidade. Assim CHROMagar Candida (CHROMagar Company, Paris, França) identifica as espécies mais freqüentes e importantes destas leveduras. Este meio pode diferenciar Candida albicans, Candida krusei e Candida tropicalis observando diferentes cores de crescimento das colônias isoladas sobre a superfície do agar. As colônias de C. albicans aparecem lisas e verdes; C. tropicalis produz colônias escuras e azuladas com um halo púrpura-marrom no agar que as rodeiam; e Candida krusei produz colônias disseminadas rugosas com centro róseo e bordos brancos. Este método tem sensibilidade/especificidade estimada em 99% para a identificação das espécies destas leveduras. 10

15 1.5.2 CandiFast (International Microbio, França) É um kit comercial que identifica as espécies de Candida spp e permite realização testes de sensibilidade. Indicando se o isolado é sensível, intermediário ou resistente. O crescimento é demonstrado pela mudança da coloração do meio de cada pocinho, através de uma reação de fermentação de glicose, tornando-o amarelo ou amarelo alaranjado. A bandeja deste sistema é constituída de uma fileira com oito pocinhos para identificação, contém: glicose, galactose, trealose, maltose, celobiose, rafinose e lactose. Cada placa deve ser coberta com uma camada plástica para evitar ressecamento e colocada em estufa por ºC, com leitura após horas de incubação. A determinação a susceptibilidade das cepas é baseada no crescimento ou ausência de crescimento destas leveduras, já que a hidrólise da uréia pelas leveduras liberam a amônia que alcaliniza o meio contendo vermelho de fenol, mudando a cor do mesmo para rosa fucsina. Os testes podem ser realizados para os seguintes antifúngicos: anfotericina B (4 ug/ml), nistatina (200 UI/mL), 5-flucitosina (35 ug/ml), econazol (16 ug/ml), cetoconazol (16 ug/ml), miconazol (16 ug/ml) e fluconazol (16 ug/ml) Auxanograma As provas de fermentação ou assimilação de hidratos de carbono são utilizadas para uma identificação definitiva de espécies. As provas de assimilação dos hidratos de carbono determinam a capacidade das diferentes espécies de levedura desenvolverem-se a partir de diferentes substratos. Este método, também conhecido como auxanograma é realizado com a colocação de discos impregnados com diferentes açúcares na concentração de 20% em uma placa isenta de carbono e inoculada previamente com uma suspensão de leveduras que estará sendo estudada. Os açucares mais importantes para este estudo são: glicose, galactose, lactose, manitol, maltose, rafinose e sacarose. Para a leitura a prova positiva se caracteriza pela presença de halo de assimilação (crescimento da levedura) ao redor do disco do papel com açúcar e a prova negativa como a ausência de tal halo (Koneman, 2001). A identificação é então realizada de acordo com a tabela expressa na página seguinte: 11

16 Tabela 1: Características bioquímicas das espécies de Candida spp. clinicamente importantes: Glicose (GLI) Galactose (GAL) Lactose (LAC) Manitol (MAN) Maltose (MAL) Rafinose (RAF) Sacarose (SAC) Candida albicans C. catenulata C. guilliermondii C. kefyr / C. krusei C. lambica C. lipolyttica C. lusitaniae C. parapsilosis C. rugosa C. tropicalis C. zeylanoides (Koneman, 2001) Teste de sensibilidade Há vários testes disponíveis no mercado atualmente, a maioria reportando concentrações inibitórias com o resultado Macrodiluição (Diluição em caldo) Os testes de diluição em caldo envolvem o contato do fungo estudado os agentes antimicrobianos em um caldo de cultura. Cada antimicrobiano é testado usando uma série de concentrações comumente expressas em µg (microgramas) da droga por mililitro de caldo (i.e.,µg/ml). A série de concentrações testadas para uma droga em particular depende de vários critérios, incluindo a concentração segura alcançada pela mesma no soro do paciente. Assim, esta série de concentrações testadas variarão para cada droga que estiver sendo testada, dependendo 12

17 das propriedades farmacológicas de cada uma delas. Além disso, as concentrações testadas devem ser suficientes para detectar algum mecanismo especial de resistência que possa vir a existir naquele inóculo em particular. Normalmente, a série de concentrações testadas para cada antifúngico é composta de concentrações de forma a seguinte ser sempre a metade da testada anteriormente (i.e., 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25 µg/ml); e, a menor concentração que inibe completamente o crescimento fúngico visível, que é observado pela turvação do meio utilizado, é registrada como a concentração inibitória mínima (CIM) para este antimicrobiano, nesta cepa testada. Este tipo de diluição é ainda dividido em duas categorias: macrodiluição ou microdiluição. O princípio para os testes é o mesmo como explicado anteriormente, a única diferença é o volume de caldo utilizado para as provas onde o teste é realizado. Para a microdiluição o volume total de caldo utilizado é de cerca de 0,05 ou 0,1 ml, enquanto que para a macrodiluição este volume é de no mínimo 1,0 ml. Já que muitas destas leveduras para teste de susceptibilidade requerem ser testadas com vários antifúngicos e cada qual em concentrações diferentes, o menor volume usado na microdiluição propicia maior conveniência para o método. Porém algumas destes fungos, não são utilizadas todas as concentrações que normalmente deveriam ser analisadas para o antimicrobiano; apenas as concentrações que diferenciam as categorias em sensível, intermediário e resistente. Estas concentrações específicas que separam ou definem as diferentes categorias, são conhecidas como os breakpoints (ou pontos de corte) para este determinado antifúngicos o fungo analisado - neste caso não temos CIMs precisas, já que nem todas as concentrações são testadas. Trata-se a diluição em caldo então de um método importante por prover tanto os resultados quantitativos (CIM) quanto os qualitativos (classificando a cepa em resistente, intermediário ou sensível) (CLSI, 2002). 13

18 Etest O Etest (AB BIODISK, Sweden) é uma técnica quantitativa aprovada para determinação de sensibilidade antimicrobiana e antifúngicos. O sistema compreende um gradiente de antibiótico pré-definido que é usado para determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM) em mcg/ml de antimicrobrianos contra as leveduras ou bactérias. Os métodos habituais de Testes de Sensibilidade Antimicrobiana (TSA) são baseados tanto em técnicas de diluição como difusão. Testes de diluição baseados em diluições seriadas de antibióticos em caldo ou ágar fornecem uma estimativa de CIM. O valor da CIM é a concentração mínima de um dado antimicrobiano que, sob condições experimentais definidas, inibe o crescimento da levedura. O valor da CIM é o critério de referência para definir a sensibilidade de determinado microrganismo. Etest é baseado numa combinação de conceitos de testes de diluição e difusão. Como os métodos de CIM, o Etest quantifica diretamente a sensibilidade antimicrobiana. Mesmo sendo processado como teste de difusão em disco, o Etest difere do método disco convencional pelo uso de um gradiente pré-formado e estável de antimicrobiano. O Etest consiste numa fita plástica fina, inerte e não porosa de 5 mm de largura e 50 mm de comprimento. Um lado da fita é marcado com uma escala de leitura de CIM em mcg/ml. Um código de 2 letras identificando o antifúngico. Um gradiente exponencial pré-definido do antibiótico seco e estabilizado é mobilizado no outro lado da fita, com uma concentração máxima e mínima. O gradiente reflete uma faixa contínua de concentração, que varia de 0,016 a 256 mcg/ml (Alta concentração) ou 0,002 a 32 mcg/ml (Baixa concentração), dependendo do antimicrobiano. Esta faixa corresponde a 15 diluições num método convencional de determinação da CIM. 14

19 Quando uma fita de Etest é aplicada numa placa de ágar inoculado, há uma liberação imediata do antibiótico da fita para o ágar. Após incubação, quando o crescimento bacteriano torna-se visível, uma elipse de inibição simétrica ao redor da fita é visualizada. Sendo os valores de CIM do Etest diretamente proporcionais aos valores de referência CLSI de diluição, os pontos de definição da CIM pelo CLSI são adequados para categorizar a sensibilidade e serão utilizadas neste estudo. Vale também lembrar que o Etest tem boa correlação com testes de diluição em ágar, mas pode apresentar diferenças com testes de diluição em caldo e testes automatizados, pelas diferenças inerentes aos procedimentos - inclusive precisão. (PAZ, C. Opustil et al, 2004) Disco-difusão (Método de Kirby-Bauer) Como muitos agentes antimicrobianos tornaram-se disponíveis para o tratamento das infecções bacterianas e/ou fúngicas, as limitações do método de macrodiluição tornaram-se método muito trabalhoso. Antes da tecnologia da microdiluição estar disponível, um método mais prático e conveniente para testar múltiplos agentes antimicrobianos contra cepas bacterianas era necessário. Com esta necessidade, o teste de disco-difusão foi desenvolvido pelos estudos de Bauer et al no ano Estes discos contendo uma concentração conhecida do agente antimicrobiano são colocados na superfície de uma placa de agar recém inoculada, onde o agente começa imediatamente a difundir-se e estabelecer um gradiente de concentração ao redor do disco de papel-filtro. A maior concentração é obtida proximamente ao disco. Após incubação a bactéria cresce na superfície da placa exceto onde o gradiente de concentração atingido pelo antibiótico ao redor do disco foi suficientemente grande para inibir seu crescimento. Após incubação o diâmetro 15

20 da zona de inibição é medida ao redor de cada disco, sendo este procedimento medido em milímetros. O tamanho dos halos de inibição obtidos são correlatos com as CIMs obtidas por diluição em caldo ou ágar e, por regressão linear analítica podemos relacionar o tamanho destas zonas com a CIM propriamente dita, apesar deste não ser um recurso bastante aplicado e até certo ponto questionado por alguns microbiologistas - a determinação por métodos quantitativos e não qualitativos, como a difusão em disco, constituem o método padrão ouro para real determinação da CIM dos antimicrobianos (Isenberg, 1992). Como a classificação das cepas em resistentes, intermediárias ou sensíveis é bastante viável e pelo método ter relativa facilidade técnica - permitindo que vários antimicrobianos sejam testados contra o agente sem a necessidade de um enorme número de procedimentos. Trata-se de um método muito utilizado pelos laboratórios, que usam para este fim a padronização estabelecida anualmente pelo CLSI com os breakpoints e halos de inibição para cada droga e grupo bacteriano em especial. 1.7 Antifúngicos Anfotericina B Isolada do Streptomyces nodosus em 1956, no laboratório Squibb, dos Estados Unidos, a anfotericina B é um poliênico cuja estrutura química é constituída por um anel macrocíclico (Salles, Salles, 2000). Sua elevada atividade antifúngica foi comprovada por Larsh * et al citados por Salles, Salles (2000), que constataram a toxicidade para a célula humana, fato que limita a sua utilização. 16

21 Por ter uma composição lipofílica, a anfotericina B se liga de forma irreversível ao ergosterol da membrana citoplasmática dos fungos provocando uma alteração estrutural, comprometendo a permeabilidade seletiva, o que permite a perda de água e outros constituintes intracelulares essenciais, resultando em morte celular. (Salles, Salles, 2000) A anfotericina B é ativa in vitro e in vivo para a grande maioria dos fungos mais freqüentemente ligados às infecções sistêmicas, atuando em baixas concentrações, com exceção do gênero Candida spp. (Salles, Salles, 2000) Flucitosina (5-fluorocitosina) Trata-se de um uma pirimidinas fluorada, sendo um antimetabólico, promove uma desorganização do DNA e RNA, interrompendo a atividade com uma ação fungistática. (Salles, Salles, 2000) Muito embora tenha um restrito espectro de atividade, incluindo Candida, Aspergilus e Criptococcus, este medicamento dificilmente é usado isoladamente. Combinado com a anfotericina, aumenta sinergismo contra vários fungos. Sua difusibilidade é considerável, atingindo os pulmões, fígado, líquido pleural. No LCR as concentrações são elevadas. (Salles, Salles, 2000) Cetoconazol Introduzido no arsenal de antifúngicos em 1978 por Levine et. al., o cetoconazol exerce sua ação interferindo na síntese do ergosterol da membrana citoplasmática dos fungos, a partir de um precursor, o lanosterol. Em conseqüência da perda do ergosterol e o acúmulo de esteróis metilados, altera-se a permeabilidade da célula fúngica que perde constituintes essenciais sendo assim, destruída. 17

22 Além de inibir a enzima citocromo P 450, ocasiona ainda bloqueios de enzima oxidativas e peroxidativas, o que é nocivo para os fungos. Ainda que resistências sejam raras, alguns casos de candidíase de esôfago em pacientes com SIDA, tem sido relatados. Algumas cepas de Candida albicans resistentes ao fluconazol exibem resistência cruzada com esta droga. É um antimicótico de amplo espectro, com atividade para Histoplasma capsulatum, Cryptococcus neoformans, Paracoccidioides brasiliensis e Candida albicans. Salvo o gênero Candida que exige concentrações mais elevadas, os demais são inibidos com valores inferiores a 1,0 ug/ml (Salles, Salles, 2000) Itraconazol Modificações na estrutura química dos imidazólicos, mediante a adição de dois núcleos tiazólicos, deu margem à obtenção do itraconazol, derivado dioxolânico de síntese da Jansen, (Bélgica), lançado há poucos anos. Atua seletivamente inibindo o citocromo P450, elemento fundamental na síntese do ergosterol da membrana dos fungos, tornando-a frágil e de fácil rompimento. É uma droga de largo espectro, agindo sobre fungos causadores de infecções sistêmicas, em concentrações menores do que as do cetoconazol e fluconazol, notadamente em relação aos gêneros Candida e Aspergillus. Não tem atividade para Zigomicetos e Fusarium. Para as espécies sensíveis tem sido raros o encontro de resistência adquirida com o itraconazol, muito embora em alguns casos de 18

23 infecções graves por Candida tropicalis, tenha se desenvolvido esta resistência. (Salles, Salles, 2000) Fluconazol Nas fases de ensaios clínicos, esta droga demonstrou um excelente perfil farmacodinâmico e farmacocinético, sendo aprovada para uso terapêutico em 1990, na expectativa de se tornar um substituto da anfotericina B. Seu modo de ação é análogo ao do itraconazol, isto é, em baixa concentrações exerce um efeito fungistático, ao inibir seletivamente, de forma reversível, o citocromo P 450, que participa de maneira essencial na formação do ergosterol da membrana dos fungos. Já em altas concentrações, a inibição é irreversível, ocorrendo ainda um aumento de geração de peróxido intracelular, com necrose e morte do fungo. A par destas ações, o fluconazol impede a transformação das formas de hifas de candida e pseudo-hifas. Neste período de utilização, um número crescente de cepas de Candida albicans resistentes ao fluconazol, principalmente de pacientes neutropênicos ou com SIDA, tem sido registradas. Por outro lado, cepas de Criptococcus resistentes a esta droga são de raro encontro (Salles, Salles, 2000). Como observamos com o exposto acima, o teste de sensibilidade para leveduras, em especial para as diferentes espécies de Candida spp, torna-se necessário em virtude do crescente aumento da importância destas espécies no contexto de um numero cada vez maior de pacientes imunocomprometidos assistidos. Assim, temos que o CLSI padroniza o método da macrodiluição como o de escolha para a realização destes, mas sabemos também que se trata de um método complicado, de difícil realização e alto custo.temos neste trabalho visado avaliar um método simples e reprodutível para identificação das leveduras para realização do antifungigrama. 19

24 O teste de sensibilidade para leveduras não é tarefa fácil pelos diferentes fatores relacionados às drogas, organismos e métodos. Um método simples, custo-efetivo e reprodutível para a realização do antifungigrama de rotina são necessário para revelar e documentar a resistência e guiar individualmente a terapêutica dos pacientes.o método de determinação precisa ser reprodutível, econômico, fácil, rápido, com boa correlação clínica, utilizando tecnologia que possa ser executada na rotina laboratorial. 20

25 2 OBJETIVOS Considerando a importância clínica, epidemiológica e laboratorial das leveduras, com atenção especial as diferentes espécies de Candida spp., os objetivos deste trabalho foram: - A avaliação de duas metodologias laboratoriais diferentes para a identificação das espécies de Candida spp. - A avaliação de três métodos quantitativos e qualitativos para a realização do teste de susceptibilidade aos antifúngicos. 21

26 3 MATERIAIS E MÉTODOS O trabalho foi dividido em três fases: 1. Realização da identificação das cepas de Candida spp através de duas metodologias diferentes: CHROMagar Candida (CHROMagar, França) e CANDIFAST (International Microbio, França). 2. Realização da identificação das cepas que foram discordantes nas metologias acima através de um método automatizado VITEK (biomeriéux, França). 3. Realização da sensibilidade aos antifúngicos das cepas testadas através de três metodologias diferentes: Etest (AB Biodisk, Suécia) considerado como padrão de comparação neste estudo, CANDIFAST (International Microbio, França) e pela discodifusão. Todas as amostras de Candida spp. estudadas (isoladas entre março de 2004 à agosto de 2005) no laboratório de microbiologia da Faculdade de Ciências Médicas e do Serviço de Controle de Infecção Hospitalar da Santa Casa de São Paulo foram provenientes de amostras clínicas diversas do hospital. 3.1 Idenficação das cepas CHROMagar Candida (CHROMagar, França) Algumas colônias previamente isoladas foram semeadas na superfície da placa, que foi deixada para incubação em estufa ºC por 48 horas. Pela coloração adquirida pelas colônias as mesmas eram classificadas como: 22

27 Candida albicans Candida tropicalis Candida krusei Outras espécies cor verde cor azul-acinzentado cor rosa com aspecto rugoso cor branca a rosa FIGURA 1 - CHROMagar Candida C C C C FIGURA 2 - CHROMagar Candida 23

28 FIGURA 3 - CHROMagar Cândida - CandiFast (International Micróbio, França) Foi realizada uma suspensão de 0,5 pela escala nefelométrica de McFarland para cada cepa estudada, e desta diluição foram passados 100µl, seguidos de 200µl de oléo mineral para cada pocinho da placa no intuito de verificar a assimilação dos carboidratos. O crescimento foi demonstrado pela mudança da coloração do meio de cada pocinho, através de uma reação de fermentação de glicose, tornando-o amarelo ou amarelo alaranjado. A bandeja deste sistema é constituída de uma fileira com oito pocinhos para identificação, contendo: glicose, galactose, trealose, maltose, celobiose, rafinose e lactose. Cada placa foi coberta com uma camada plástica para evitar ressecamento e colocada em estufa por ºC, com leitura após horas de incubação. 24

29 FIGURA 4 : Placa do CANDIFAST (International Microbio, França), evidenciando os pocinhos onde são realizadas a identificação (metade inferior) e a susceptibilidade aos antifúngicos (metade superior). FIGURA 5 : CandiFast- Candida albicans 25

30 FIGURA 6 : CandiFast- Candida tropicalis FIGURA 7 : CandiFast- Candida parapsilosis FIGURA 8: CandiFast- Candida glabrata 26

31 Vitek (biomérieux, França) O sistema Vitek (biomérieux, França), consiste num módulo selado a vácuo, um leitorincubador e computador.são utilizados cartões de testes Vitek, que são inoculados pelo equipamento e incubados.esse sistema emprega a metodologia de turbidez para análise dos resultados. A identificação bacteriológica é feita pelo computador, que processa e interpreta os resultados. O equipamento também pode efetuar o teste de suscetibilidade de microrganismos. Figura 9 : Métodos automatizados para identificação e teste de sensibilidade aos antimicrobianos (Sistema Vitek) Teste de Susceptibilidade aos antifúngicos Etest (AB Biodisk, Suécia) Para cada cepa foi feita uma suspensão de 0,5 da escala nefelométrica de McFarland que era semeada em superfície em três sentidos em Agar MOPS+RPMI, seguido da colocação das fitas de Etest (AB Biodisk, Suécia) para os seguintes antifúngicos: Anfotericina B, fluconazol, cetoconazol, itraconazol e 5-flucitosina. 27

32 As leituras foram feitas após 48 horas de incubação em estufa ºC e considerado o valor da Concentração Inibitória Mínima o local da intersecção do halo de inibição (elipse) para cada droga estudada. FIGURA 10: Esquema demonstrando os diferentes gradientes de concentração pela fita de Etest Teste Epsilométrico. FIGURA 11: Etest para Fluconazol i itaconazol 28

33 O critério de interpretação adotado foi o empregado pelo CLSI como segue: Tabela 2: Critérios para classificação da susceptibilidade aos antifúngicos, de acordo com o CLSI: S S-DD I R -Anfotericina B < 0, Flucitosina < 4, > 32 -Fluconazol < > 64 -Itraconazol < 0,125 0,25 0,5 - > 1 Onde: S=Sensível, S-DD=Sensível dose-dependente, I=Intermediário e R=Resistente CandiFast (International Microbio, França) Da mesma maneira como foi realizada a identificação bacteriana neste sistema, a partir de diluição 0,5 da escala nefelométrica de McFarland (R1), foram passados 100µl para um tubo (R2) que ajusta o inoculo para microdiluição e, deste último, passados 100µl para cada pocinho com o antifúngico em teste, seguido de mais 200µl de óleo mineral. Um plástico impermeável foi colocado sobre as placas para evitar ressecamento e as mesma incubadas em estufa ºC por horas para realização de leitura. Para a susceptibilidade das cepas foi baseada no crescimento ou ausência de crescimento destas leveduras, já que a hidrólise da uréia pelas leveduras libera amônia que alcaliniza o meio contendo vermelho de fenol, mudando a cor do mesmo para rosa fucsina. Os testes foram realizados para os seguintes antifúngicos: anfotericina B (4 ug/ml), nistatina (200 UI/mL), 5- flucitosina (35 ug/ml), econazol (16 ug/ml), cetoconazol (16 ug/ml), miconazol (16 ug/ml) e fluconazol (16 ug/ml). 29

34 Placa do CANDIFAST (International Microbio, França), evidenciando os pocinhos onde são realizadas a identificação (metade inferior) e a susceptibilidade aos antifúngicos (metade superior). No caso de crescimento no pocinho com antifúngico a cepa era considerada como resistente para tal e, no caso de inibição, sensível a droga estudada Disco-difusão (Sensifungidisc, Cecon, Brasil) Para a realização do teste de sensibilidade através da disco-difusão (Método de Kirby- Bauer) qualitativo - foi feita uma semeadura em três direção em agar Casitone a partir de uma suspensão 0,5 McFarland para cada cepa. Foram colocados os discos dos seguintes antifúngicos: anfotericina B (100ug), fluconazol (25ug), cetoconazol (50ug), itraconazol (10ug) e 5-flucitosina (1ug). Após 24 horas de incubação em estufa ºC foi realizada a leitura através da medição halos de inibição formados ao redor dos discos, que foram interpretados da seguinte maneira. FIGURA 12: Susceptibilidade através do Disco-Difusão Candida spp 30

35 Tabela 3: Critérios para classificação da susceptibilidade aos antifúngicos, de acordo com o manual de intruções do fabricante: S I R -Anfotericina B > 10 mm - - -Flucitosina > 20 mm mm < 10 mm -Fluconazol > 19 mm mm < 14 mm -Cetoconazol > 20 mm mm < 10 mm -Itraconazol > 20 mm mm < 11 mm Onde : S=Sensível, I=Intermediário e R=Resistente. Os resultados obtidos através destas metodologias foram comparados adotando os resultados obtidos pelo Etest como padrão para os antifúngicos estudados: anfotericina B, flucitosina, cetoconazol, fluconazol e itraconazol. As possíveis discordâncias entre as metodologias foram classificadas de acordo com o erro obtido da seguinte maneira: - Erro muito importante (EMI): Isolamento resistente caracterizado como sensível. - Erro importante (EI): Isolamento sensível caracterizado como resistente. ou vice-versa. - Erro menor (Em): Isolamento resistente ou sensível caracterizado como intermediário, 31

36 4 RESULTADOS Foram avaliadas 82 cepas de Candida spp, isoladas entre março de 2004 a agosto de 2005 no laboratório de microbiologia da Faculdade de Ciências Médicas e do Serviço de Controle de Infecção Hospitalar da Santa Casa de São Paulo. Estes isolados eram provenientes de amostras clínicas diversas sendo 48% do sangue (hemocultura), 34% urina (urocultura), 7% secreções diversas, 5% swab anal, 4% swab oral, 1% escarro e 1% fezes (Fig.13). 4% 5%1% 7% 1% 48% 34% sangue urina swab oral swab anal escarro secreção fezes FIGURA 13: Distribuição dos isolados de leveduras do gênero Candida spp de acordo com os materiais clínicos na Santa Casa de Misericórdia de São Paulo no período de Março de 2004 a Agosto de Considerando o padrão de crescimento no Chromagar, as cepas de Candida albicans foram isoladas em 50% das amostras, Candida tropicalis em 21%, Candida krusei em 2%, sendo que 27% foram classificadas como de outras espécies (fig.14). 32

37 22 (27%) 2 (2%) 17 (21%) 41(50%) Candida albicans Candida tropicalis Candida krusei Outas spécies Figura 14: Freqüência de Candida spp identificadas CHROMagar Candida na Santa Casa de São Paulo Das 82 cepas estudadas, 11 foram discordantes entre os métodos de CHROMagar e CandiFast, sendo que este último classificou como Candida parapsilosis 32% das amostras incluindo todas as não classificadas pelo método cromogênico (fig.15). 100% 50% 46% 21% 21% 32% 27% 0% 2% 0% 0% 1% albicans t ropicalis krusei parapsilosis out ras chromagar candifast FIGURA 15: Resultados de identificação obtida nas amostras de Candida spp, isoladas de diferentes materiais clínicos na SCMSP no período de março de 2004 a agosto de 2005, que primariamente discordantes entre CHROMagar Candida e Candifast 33

38 Das cepas discordantes, 8 cepas foram analisadas através da metodologia automatizada (VITEK system), sendo que cinco tiveram resultados iguais ao obtido no CHROMagar Candida; as outras três tiveram resultados diferentes em cada uma das metodologias, conforme podemos observar na tabela 04. TABELA 04: Resultados Concondância da identificação obtida nas amostras de Candida que foram primariamente discordantes entre CHROMagar e CandiFast. N. exame CHROmagar CANDIFAST VITEK C. albicans Rhodotorula NT C. albicans C. parapsilosis NT C. albicans C. tropicalis NT C. albicans C. tropicalis C. albicans C. albicans C. tropicalis C. albicans C. tropicalis C. albicans C. tropicalis C. tropicalis C. albicans C. tropicalis C. tropicalis C. albicans C. tropicalis C. albicans C. parapsilosis C.guilhiermondii C. krusei C. parapsilosis C.guilhiermondii C. krusei C. parapsilosis ND Onde : NT = não testado e ND = não diagnosticado Quando analisamos os isolados de hemoculturas, que foram 48% (n=39) dos materiais analisados, obtivemos 54% Candida parapsilosis, 38% Candida albicans e 8% Candida tropicalis. Quanto ao teste de sensibilidade 7,5% (n=3) das cepas foram resistentes ao fluconazol, sendo C. parapsilosis (n=2) e C. albicans (n=1). Enquanto que 2,5% (n=1) foi resistente a anfotericina B, sendo esta uma C. parapsilosis. Já quando relacionamos o material urina com espécie e sensibilidade temos que 34% (n=24) dos isolados foram destas amostras, sendo que destes 58% eram C. albicans, 29% C. tropicalis, 8% C. krusei e 4% C. parapsilosis. Nestas cepas observamos que uma era resistente à anfotericina B (4%) sendo esta uma C. albicans e uma outra resistente ao fluconazol sendo esta última uma C. krusei. 34

39 24% 2% 5% 4% 6% 12% 4% 7% 4% 2% 14% 11% 1% 4% AMB 4% RENAL 7% BERÇARIO 12% C.I. 1% PED 4% RETA 11% SEMI.INF 2% SEMI.UTIP 4% UTIPED 12% DCS 6% DMS 4% HSI 5% TMO 2% UTIADULT 24% Figura 16 : Freqüência comparativa de Candida spp, nas diferentes unidades de internação no Hospital central da ISCMSP(Março 2004 a agosto de 2005). 24% BERÇARIO 30% 30% C.I 2% PED 10% RETA 22% 7% SEMINF 5% 5% 2% 10% SEMUTINF 7% UTIPED 24% 22% Figura 17: Freqüência comparativa de Candida spp, nas diferentes unidades de internação do Departamento de Pediatria ISCMSP(Março 2004 a agosto de 2005). Após a identificação as cepas foram submetidas ao teste de sensibilidade aos antifúngicos por três metodologias diferentes: Etest, disco-difusão e CandiFast, sendo considerado o resultado do Etest como sendo o padrão para todas as comparações. 35