MICROSCOPIA DE SUPER-RESOLUÇÃO

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1 MICROSCOPIA DE SUPER-RESOLUÇÃO S I M S T R U C T U R E D I L U M I N AT I O N M I C R O S C O P Y Camila Ramalho Bonturi Kely Catarine Matteucci

2 Microscopia de Super-resolução As limitações da microscopia óptica foram inicialmente descobertas por Ernst Abbe e Lord Rayleigh, em A resolução da microscopia é limitada pela difração da luz no plano focal da objetiva: barreira de difração, que restringe a resolução máxima de acordo com dimensão lateral e axial. Essas variáveis são dependentes da NA e da média do comprimento de iluminação. Cria um obstáculo para alta resolução

3 Microscopia de Super-resolução Plano axial (z) x plano lateral: axial era pouco aperfeiçoado. Lateral (x,y) era melhor definido pelos discos de Airy (padrão de difração criado por um objeto. Quanto menor discos de Airy: maior a resolução de uma imagem). Objetivo de maior NA produzem discos de Airy menores. Dimensão lateral foi aperfeiçoada com a microscopia confocal

4 Microscopia de Super-resolução Estruturas separadas por mais de 200 nm (dimensão lateral) podem ser distinguidas. Na resolução axial é ainda menor valores teóricos, sem prever condições ópticas. Graças a difração, a imagem ficaria borrada. A distância entre os dois pontos é menor que o limite de resolução DIFICULDADE: distorções da amostra (dispersão da luz, fora de foco, aberração esférica)

5 Microscopia de Super-resolução Como atingir alta resolução? Melhoria na resolução lateral x axial: microscopia de super-resolução. Essa técnica resolve características abaixo do limite de difração. Permite discernir estruturas espaçadas a bem menos de 100nm. Iluminação Estruturada de Microscopia Descarta a iluminação tradicional de Köhler (iluminação de toda a amostra) Iluminação de Köhler: ilumina a amostra uniformemente, mas é incapaz de eliminar a iluminação originada do plano focal. O brilho fica uniforme e o foco da imagem é incapaz de se obter.

6 Iluminação Estruturada de Microscopia (SIM) A amostra é iluminada seguindo um padrão grade. M(x, y, z) = [ρ(x, y, z) I(x, y, z)] h(x, y, z), onde M é a imagem; ρ é a densidade do fluoróforo; I é a intensidade de iluminação; h é PSF (Point Spread Function, mancha desfocada). X e Y são as resoluções laterais e Z a axial. Diminuição do PSF

7 Iluminação Estruturada de Microscopia (SIM) A SIM segue o Efeito Moiré (moarrê): superposição de duas estruturas com frequência espacial alta podem gerar uma frequência espacial baixa em overlap. Utiliza o Moiré para aumentar a resolução lateral e axial da imagem. Como? Mistura as frequências da grade com o objeto causando uma modulação baixa de componentes com alta frequência. (b) circle having a radius of 2NA/λ (c) generates a Fourier transform having only three non-zero points

8 Iluminação Estruturada de Microscopia (SIM) É uma combinação das frequências entra as amostras com a frequência da iluminação heterogênea. Ocorre a formação de algumas imagens sob diferentes padrões de iluminação. Utiliza-se um algoritmo de reconstrução que recupera a imagem da amostra com uma resolução 2x melhor que o microscópio padrão.

9 Iluminação Estruturada de Microscopia (SIM) Princípio básico da SIM: A grade é iluminada por um laser que produz três feixes de difração, que são focados por L3, e convergem em L4. O feixe central pode ser bloqueado, enquanto os outros divergem para um espelho dicromático em uma objetiva com NA alta. A interferência dos primeiros feixes criam um padrão de excitação que ilumina a amostra.

10 Iluminação Estruturada de Microscopia (SIM) Na SIM a iluminação é chamada de Modulação de Luz Espacial (SLM). fluorescent beads (A and B) Modulação de Luz Espacial A grade é movida em passos e lateralmente para que toda amostra receba a mesma quantidade de luz, gerando uma imagem seccionada. A movimentação da grade gera um padrão vertical de iluminação para obtenção de uma imagem nas três dimensões (x, y e z). fibronectin network formed by rat chondrocytes grown in culture Rotação da grade de 60º : captura de 5 imagens que são reconstruídas

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16 Final High Resolution Image

17 Aplicações da técnica

18 Autofagia Adapted Fleming, A.; et al. -Nature Chemical Biology Review- 2010

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21 Aplicações da técnica

22 B. Matija Peterlin and Didier Trono (February 2003) doi: /nri998

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24 Identificar a quantidade e a localização do capsídeo viral do HIV