Cristalografia por Difração de Raios X. Aula 1 - Introdução. Algumas empresas que usam Cristalografia. Exemplo: receptores de hormônios.

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1 Cristalografia por Difração de Raios X Aula 1 Introdução Cristalografia de Proteínas & SAXS Prof. Ricardo Aparicio IQ/UNICAMP a Cristalografia por Difração de Raios X permite obter informação sobre a estrutura atômica de um composto técnica baseada nas propriedades ondulatórias dos Raios X e sua interação com a matéria um feixe monocromático de Raios X incidente num monocristal resulta num padrão de difração que depende da estrutura atômica do cristal usa-se o termo estrutura cristalina para designar uma estrutura obtida por Cristalografia QP123 Métodos Modernos de Caracterização Estrutural e Dinâmica de Proteínas Preparado em Linux com LATEX 2ε. Important: these lecture notes may contain copyrighted material from other sources, used here strictly for didactic purposes. No copyright is required by the author. 1 / 53 Algumas empresas que usam Cristalografia 2 / 53 Exemplo: receptores de hormônios The crystal structure of the estrogen receptor DNA-binding domain bound to DNA: how receptors discriminate between their response elements. Schwabe, J. W., Chapman, L., Finch, J. T., Rhodes, D. (1993). Cell 567 p. 75 Biotecnologia Farmacêuticas Abbott Amgen Astra Zeneca Array BioPharma BristolMyers Squibb Astex GlaxoSmithKline Chiron Merck Genencor Novartis Genentech Pfizer Monsanto Sanofi/Aventis SGX Syrrx Químicas Vertex ExxonMobil Shell 3 / 53 4 / 53

2 Exemplo: fosfodiesterases Exemplo: fosfodiesterases envolvidas em doenças cardíacas, depressão, disfunção erétil, asma, processos inflamatórios diferentes drogas inibem com maior ou menor eficácia diferentes fosfodiesterases interesse em comparar modos de ligação Structure of the catalytic domain of human phosphodiesterase 5 with bound drug molecules. Sung BJ et. al. (2003). Nature 425, p inibidores de PDE4 Zardaverine: broncodilatador para asma Rolipram: antidepressivo Roflumilast e Cilomilast: doença obstrutiva pulmonária crônica (COPD) inibidores de PDE5 Sildenafil Tadalafil Vardenafil PDE5 ligada ao Sildenafil (em vermelho) e Tadalafil (em verde) 5 / 53 6 / 53 Exemplo: fosfodiesterases Exemplo: fosfodiesterases Complexo detalhe do sítio ativo da PDE5 ligado ao Sildenafil pode-se estudar em detalhes quais são os átomos envolvidos nas ligações químicas Superposição Zardaverine (verde) ligado à PDE4 (loop em azul) Sildenafil (amarelo) ligado à PDE5 (loop em vermelho) 7 / 53 8 / 53

3 Exemplo: fosfodiesterases Exemplo: estereoquímica absoluta herbicida 9 / / 53 Exemplo: estereoquímica absoluta Difração de policristais (Difração de Pó) Exemplo: mudanças de fase e outros estudos enantiômetro S: 600 vezes mais ativo contra células de câncer renal de Fátima et al. (2006). Bioorg. Med. Chem. 14: / / 53

4 Difração de monocristais Difração de monocristais Exemplo: estudo de densidade eletrônica do ácido oxálico Exemplo: proteína métodos computacionais para determinar a estrutura atômica métodos computacionais para determinar a estrutura atômica 13 / / 53 Moléculas pequenas proteínas Ordem de grandeza λ Raios X 1 Å Mesmo princípio, diferenças importantes: cristalização coleta de dados métodos de resolução cristais de pequenas moléculas são muito mais perfeitos = muito mais informação no caso de pequenas moléculas 15 / / 53

5 Interação radiação-matéria Fator de espalhamento atômico f a (r ) depende do comprimento de onda da radiação e da direção de observação Espalhamento Thompson e cos 2θ I eth = I i m 2 r 2 c 4 2 massa do próton 2000 vezes massa do elétron = contribuição dos núcleos atômicos é desprezível espalhamento de Raios X = informações sobre a densidade eletrônica da amostra 17 / / 53 Retículo cristalino Lei de Bragg analogia com difração de luz visível Raios X refletidos por planos paralelos e regularmente espaçados intensidade significante apenas para ângulos de incidência nos quais os raios refletidos por sucessivos planos do cristal diferem por um número inteiro de comprimentos de onda 2d hkl sin θ = nλ d hkl : distância interplanar n: ordem da reflexão 19 / / 53

6 Arranjo experimental Típico padrão de difração de um monocristal 21 / / 53 Integração e escalonamento das imagens Integração e escalonamento das imagens I hkl = I total I background 23 / / 53

7 Arquivo final Recuperação da densidade eletrônica Analogia o erro σ(i hkl ) associado a cada reflexão I hkl é estimado a partir de considerações estatísticas ao final da integração e escalonamento de todas as reflexões de todas as imagens, obtém-se um arquivo de texto organizado em colunas h k l I hkl σ(i hkl ) tanque de água espalhadores vibrando geram padrão de interferência localização dos espalhadores pode ser deduzida a partir do padrão (intensidade + fases) 25 / / 53 Densidade eletrônica Interpretação da densidade eletrônica 27 / / 53

8 Interpretação da densidade eletrônica Proteínas: aminoácidos e ligação peptídica 29 / / 53 Proteínas: estrutura secundária (folha β) Proteínas: estrutura secundária (hélice α) 31 / / 53

9 Estrutura Cristalográfica: passos a seguir 33 / 53 Cristalizando a proteína: difusão de vapor 35 / 53 Proteínas: clonagem, expressão, purificação 34 / 53 Cristais de proteína: dimensões típicas 200 µm 36 / 53

10 Estrutura cristalográfia dinâmica Resolução = quantidade de informação a estrutura cristalográfica fornece a média temporal e espacial das posições atômicas a desordem dinâmica (tempo) e estática (pequenas diferenças na estrutura e/ou posição moléculas que compõem o cristal) são levadas em conta através do fator de temperatura 37 / / 53 Gerador de laboratório: comprimento de onda fixo Fontes de Raios X Fontes de Raios X Luz síncrotron (LNLS): comprimento de onda variável a figura mostra os principais componentes de um equipamento completo para a coleta de dados de cristais de proteínas Data/data.html 39 / / 53

11 Fontes de Raios X Detetores LNLS: linha MX-2 Placa de Imagem (Imaging plate) CCD (Charge-Coupled Device) 41 / / 53 Arranjo experimental Arranjo experimental o goniômetro (do Grego gonia - ângulo) é um instrumento que mede ângulos, permitindo que o cristal seja rotacionado - com precisão - até a posição angular desejada o cristal é montado numa cabeça goniométrica (figura) rosqueada no goniômetro saída do feixe de Raios X soprador de nitrogênio: mantém o cristal a baixa temperatura ( 100 K ) durante a coleta para evitar danos por radiação e diminuir desordem dinâmica beam stop: pequena peça metálica que impede a passagem do feixe direto e determina a origem cabeça goniométrica: onde o cristal é montado a cabeça goniométrica é um instrumento de alta sensibilidade que permite orientar precisamente o cristal através de eixos mutuamente perpendiculares 43 / / 53

12 Difratômetro IQ/UNICAMP (2s/2010) Software determinação da cela unitária e indexação 45 / / 53 Software Software indexação das faces para posterior correção de absorção análise de imagens 47 / / 53

13 Software Software integração de dados ferramenta para visualização do espaço recíproco 49 / / 53 Software Software planejamento da coleta escalonamento e correção de absorção 51 / / 53

14 Software resolução automática da estrutura (pequenas moléculas) 53 / 53