Microarrays Reais e Virtuais: Passo a Passo

Transcrição

1 Microarrays Reais e Virtuais: Passo a Passo Anastasios Koutsos Alexandra Manaia Julia Willingale-Theune Versão 2.3 Versão Portuguesa ELLS European Learning Laboratory for the Life Sciences

2 Anastasios Koutsos, Alexandra Manaia e Julia Willingale-Theune Microarrays Reais e Virtuais: Passo a Passo Versão 2.3

3 Microarrays Reais e Virtuais Microarrays reais: passo a passo Produção dos fragmentos de ADN Para produzir os microarrays os cientistas: - usam a PCR (polymerase chain reaction), técnica de amplificação de ADN que produz milhares de pequenos fragmentos de ADN em cadeia dupla. - ou, caso conheçam a sequência nucleotídica do gene, podem encomendar a produção de fragmentos em cadeia simples com idêntica composição nucleotídica. Microarray virtual: passo a passo O tapete Pode fabricar o seu próprio tapete ou pode escrever-nos (ells@embl.de) e encomendar a versão do tapete em plástico (1x2.5 m), especialmente concebida para ser utilizada na sala de aula por 40 Euros (não incluindo custos de envio). Impressão ou spotting Os microarrays de ADN podem ser facilmente produzidos no laboratório usando lâminas de vidro, como as que são correntemente utilizadas em microscopia. Imprimir pequeníssimos spots de ADN (cada spot contendo biliões de cópias de ADN de um mesmo gene) numa pequena superfície é uma tarefa muito difícil. Os spots têm de ser exactamente da mesma forma e equidistantes uns dos outros. Estas dificuldades conseguem ser ultrapassadas graças à utilização de robots no fabrico dos microarrays. Impressão ou spotting No Microarray Virtual, um tapete de tecido representa a lâmina de vidro contendo 10 spots. Cada spot contém fragmentos de ADN em cadeia simples, específicos de um destes 10 genes: Alexandre Fleming, Jacques Monod, Thomas Morgan, Barbara Mcclintock, Leo Szilárd, John Kendrew, Francis Crick, Rosalind franklin, Maurice Wilkins e James Watson. As moléculas de ADN são representadas por Velcro colorido. Por exemplo, para o gene John Kendrew, os fragmentos de Velcro são vermelhos. Terá que colocar os fragmentos de Velcro correspondentes a cada gene, no respectivo spot (círculo), no seu tapete de microarray. 3

4 Microarrays Reais e Virtuais _ O braço do robot transporta um conjunto especial de 48 tubos capilares em ouro até aos reservatórios, onde se encontram as várias soluções de fragmentos de ADN que vão ser impressos nas lâminas. Como estes capilares são muito sofisticados, delicados e caros, o robot está equipado com apenas 48, que são utilizados inúmeras vezes. O braço do robot mergulha os capilares nas amostras, retira-as e posiciona-se sobre uma fila de lâminas de vidro pré-tratadas. Então, pressiona ligeiramente os capilares, de modo a que cada capilar deposite 200nl de amostra na lâmina de vidro. Quando uma linha de spots fica impressa na primeira lâmina, o braço move-se para a segunda lâmina e assim sucessivamente, de modo a que todas as lâminas possuam uma fila equivalente de spots. Quando uma fila está completa em todas as lâminas, o braço lava os capilares, mergulhando-os depois num novo conjunto de amostras. Regressa então à primeira lâmina onde imprime uma nova fila de spots. O processo é repetido muitas vezes até à produção de uma série de lâminas- cada lâmina é um microarray com 20,000 spots. Após impressão as lâminas são aquecidas para fixar o ADN ao vidro. Extracção de marn Para realizar uma experiência com microarrays, os cientistas extraem marn das células que querem estudar. A extracção é um processo relativamente simples. Para cada experiência, é necessário utilizar marn proveniente de dois tipos de células: Extracção de marn O marn é representado por lanternas de bolso. Cada lanterna corresponde a marn de cadeia simples específico de um determinado gene (Velcro vermelho para o marn correspondente ao gene John Kendrew). Cada lanterna tem também uma etiqueta de identificação. 4

5 Microarrays Reais e Virtuais _ células controlo e do tipo celular que se está a estudar. Por exemplo, cientistas interessados em estudar células cancerosas, utilizariam marn de células normais (não-cancerosas) como controlo e marn proveniente de células cancerosas do mesmo tipo de tecido. Uma vez extraídas, as moléculas de marns precisam de ser marcadas com moléculas fluorescentes 1, de modo a poderem ser detectadas mais tarde, na superfície do microarray. O marn das células controlo é geralmente marcado com uma molécula fluorescente verde e o marn das células em estudo é marcado com um marcador fluorescente vermelho. O número exacto e os nomes das lanternas será discutido adiante. Por agora basta saber que existem umas lanternas correspondentes ao marn das células controlo e outras correspondentes ao marn das células em estudo. As lanternas precisam de ser marcadas com papel transparente autocolante verde ou vermelho representando o marn dos tipos celulares: vermelho para o marn das células cancerosas e verde para o marn das células controlo. Hibridação Neste passo, o marn controlo (marcado a verde) é misturado com o marn teste (marcado a vermelho). A mistura é vertida sobre a superfície da lâmina de vidro que é então incubada a 42 C, de modo a que as cadeias simples marn da mistura se liguem (hibridem) ao ADN complementar no microarray. Após 12 horas, o microarray é lavado de modo a remover as moléculas de marn que não tenham encontrado alvos complementares nas lâminas. O microarray está então pronto a ser digitalizado scanneado. Hibridação Trata-se agora de hibridar os marns marcados com as moléculas fluorescentes (lanternas) com as moléculas de ADN (Velcro), presentes no microarray (tapete). Coloca-se a mistura de lanternas em contacto com o microarray (tapete). Apenas as lanternas com Velcro de cores apropriadas irão hibridar com as moléculas de ADN em cadeia simples, presentes no microarray. Por exemplo: as lanternas com Velcro vermelho vão hibridar com o Velcro vermelho no microarray e as lanternas com Velcro amarelo hibridarão com o Velcro amarelo no microarray. 1 As cores não são vísiveis à luz normal. As lanternas com uma cor de Velcro que não exista no microarray (tapete) não se ligarão. As moléculas de Velcro que apresentam mais do que uma cor (ver na figura abaixo, a lanterna que está na mão), representam a situação em que apenas 5

6 Microarrays Reais e Virtuais _ uma porção do marn é complementar ao ADN presente no microarray. Nestes casos, a hibridação é muito fraca e as moléculas de marn fracamente ligadas, são eliminadas durante a lavagem. Colocar as lanternas no tapete, ligando-as ao Velcro da mesma cor, no tapete. Neste ponto deve ligar-se a luz das lanternas. Scanning do microarray aquisição de imagem Chegou o momento de identificar quais os marn que hibridaram com as moléculas alvo de ADN. Para tal, utiliza-se um scanner laser, segundo um princípio semelhante ao scanner que digitaliza as imagens para uso, num computador. O laser faz o scanning da lâmina e combina as imagens, produzindo uma imagem final que se assemelha à figura abaixo: Scanning do microarray aquisição de imagem Para fazer o scanning do microarray virtual, ligar todas as lanternas que se encontram sobre o tapete do microarray, não as retirando dos seus lugares. Desligar então as luzes da sala e observar o microarray. Ir analisando o microarray spot a spot (círculo a círculo). O que se pode dizer acerca da intensidade de cores? É de notar que no microarray virtual não é possível reproduzir os spots amarelos. No entanto, os spots vermelhos e verdes são fácilmente distinguíveis. Convém anotar o número de lanternas vermelhas e verdes para cada gene. Estes dados serão necessários para a análise dos resultados. Reparando atentamente na figura acima, notamos que não há só spots vermelhos e verdes mas também spots amarelos e laranja. Tal como para os microarrays reais, os círculos mostram uma gradação de cores. Num círculo onde só há lanternas vermelhas, só o marn de células cancerosas hibridou com as moléculas de ADN. Do mesmo modo, os círculos verdes correspondem a uma hibridação exclusivamente 6

7 Microarrays Reais e Virtuais _ Os spots vermelhos contêm apenas marn de células cancerosas, e os spots verdes apenas marn das células controlo, não cancerosas. Mas o que acontece se quantidades idênticas de marn das células controlo e das células cancerosas hibridarem com o mesmo ADN alvo? Da sobreposição dos sinais verde e vermelho resulta um sinal amarelo! É preciso não esquecer que o marn hibrida com o ADN no microarrray que lhe é complementar, e que um spot no microarray representa biliões de cópias de ADN de UM único gene. Por outras palavras, quando um spot é amarelo, quer dizer que existem quantidades aproximadamente iguais de marn desse gene nas células cancerosas e nas células controlo. de mrna das células controlo. Os círculos amarelos correspondem a igual quantidade de marn nas células cancerosas e nas células controlo. Isto é uma simplificação, pois como vemos, no microarray real pode observar-se grande variação na cor dos spots (ver o ícone para esta actividade na página Web!), que só consegue ser decifrada com auxílio de um scanner laser e de um programa de análise. Quando um spot é laranja, quer dizer que existe uma quantidade relativa maior de marn desse gene nas células cancerosas do que nas células controlo (normais). Os spots pretos correspondem a uma ausência de marn específico desses genes, quer nas células controlo quer nas células cancerosas. Normalização Normalização No Microarray de ADN nem sempre a intensidade do spot corresponde à quantidade real de marn que hibridou. Isto porque o processo de marcação do marn é influenciado pelo tamanho da cadeia do marn e pelo tipo de marcador utilizado. Um processo matemático designado por normalização corrige as intensidades dos spots, de modo a que estas reflictam a quantidade de marn presente nas moléculas hibridadas. Depois da normalização a análise dos dados pode prosseguir. Segundo o que puderam ler quanto ao fabrico dos microarrays reais, os cientistas conseguem estimar a quantidade de marn, a partir da cor do spot após scanning e análise do microarray. Em paralelo, também podemos estimar o número de lanternas por círculo, através da intensidade da luz. Mas consideremos o seguinte exemplo: se existe uma lanterna num spot, e se noutro spot existem duas lanternas, e se todas as lanternas tiverem o mesmo número de baterias, então será de esperar que a luz emitida por duas lanternas seja duas vezes tão intensa quanto a de uma só lanterna. Mas o que acontecerá se as baterias das duas lanternas possuírem apenas metade da 7

8 Microarrays Reais e Virtuais _ intensidade? Nesse caso, as duas lanternas num spot serão tão intensas quanto a única lanterna no outro spot. Por outras palavras, a quantidade de luz das lanternas no microarray virtual não depende apenas do número de lanternas, mas também do tipo de baterias que existem em cada lanterna. Análise e Clustering Se os cientistas analisassem os resultados spot a spot, levariam anos a analisar um microarray. Assim, os cientistas desenvolveram uma maneira de associarem os genes que têm um comportamento semelhante em grupos- os clusters. Existem programas de computador que permitem executar estes passos automaticamente. Análise e Clustering Este passo será explicado na secção: Exercícios de clustering para a sala de aula [PDF]. 8

9 Agradecimentos Gostaríamos de agradecer a todos os que contribuíram para a elaboração desta actividade: - Ao Udo Ringeisen e a toda a equipa do Departamento de Fotografia do EMBL (EMBL Photolab), pela impressão dos tapetes do microarray em tecido, (para demonstração em cursos ou festivais de ciência) e pela produção da versão em plástico, (para utilização na sala de aula); - Ao Thomas Sandmann, na altura estudante de doutoramento no EMBL-Heidelberg, por várias discussões e sugestões muito úteis e também por nos ter chamado a atenção para o excelente material sobre microarrays intitulado Snapshots of Science and Medicine, produzido pelo NIH Office of Science Education, em conjunto com o Office of Research on Women s Health ; - Ao Russ Hodge, na altura, no Departamento de Comunicação e Relações Públicas do EMBL-Heidelberg ( Office of Information and Public Affairs [OIPA]), bem como a toda equipa do European Learning Laboratory for the Life Sciences [ELLS], por muitas discussões, sugestões e apoio; - A Giovanni Frazzetto, Mehrnoosh Rayner e Vassiliki Koumandou por terem lido a primeira versão desta actividade e por terem contribuído para melhorá-la com as suas ideias e comentários. - A vários amigos e colegas do EMBL-Heidelberg com quem partilhámos ideias, entusiasmo e dúvidas; - Os Exercícios para a sala de aula foram adaptados do material sobre microarrays intitulado Snapshots of Science and Medicine, produzido pelo NIH Office of Science Education. Pode ser encontrado no seguinte website: science-education.nih.gov/snapshots; Imagem de capa por André-Pierre Olivier; Traduzido por Alexandra Manaia; Editado por Corinne Kox e Sonia Furtado.

10 O ELLS usa licenças de direitos de autor Creative Commons para salvaguardar material produzido para os ELLS LLABs que será posteriormente utilizado por professores e outras instituições. Os símbolos de direitos de autor aparecem também no website ELLS TeachingBASE e nos ficheiros pdf, doc e ppt disponíveis para download. Atribuição Uso Não-Comercial Compartilhamento pela mesma licença Esta licença permite a terceiros remisturar, alterar e usar o seu trabalho como base, para fins não-comerciais, desde que lhe atribuam o devido crédito a si e utilizem uma licença idêntica para a obra resultante. O seu trabalho pode ser obtido por download e redistribuído tal como na licença Atribuição-Uson Não-Comercial - Não a obras Derivadas, mas também pode ser traduzido e/ou remisturado, e podem ser produzidas novas obras com base nele. Todas as novas obras baseadas na sua terão a mesma licença, portanto quaisquer obras derivadas serão também de natureza não-comercial. Além disso, os autores das obras derivadas não podem insinuar que a obra derivada foi apoiada ou aprovada pelo(a) autor(a) da obra original. Significado dos símbolos de direitos de autor: Partilhar Remisturar Atribuição Uso Não-Comercial Compartilhamento pela mesma licença Para mais informações, consultar

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