PapilloCheck. Instruções de Uso IVD

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1 HPV DNA-Chip Kit diagnóstico para a genotipagem de papillomavirus humano tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 3, 40, 42,43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59,66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais. REF Para uso em diagnóstico in vitro Apenas por pessoal profissional de laboratório Revisão: BQ Agosto 2011

2 GLOSSÁRIO DE SÍMBOLOS! en Store in the dark Use by Consult Instructions For Use Catalog Number In Vitro Dianostic Medical Device Manufacturer Temperature limitation Contents suffi cient for <n> tests Irritant HPV Batch DNA-Chip code Important Note de Im Dunkeln lagern Mindestens haltbar bis Vor Gebrauch Anweisung lesen Hersteller Katalognummer In- Vitro- Diagnostika Medizinprodukt Temperaturbegrenzung Inhalt ausreichend für <n> Tests Reizend Chargenbezeichnung Wichtiger Hinweis fr À stocker à l abri de la lumière Date limite de conservation jusqu au Lire les instructions avant utilisation Numéro de référence Fabricant Produit médical de diagnostic in-vitro Limite de température Contenu suffi sant pour <n> tests irritant N o de lot Note importante es Conservar en un lugar oscuro A utilizar preferiblemente antes de Antes de usar, lea las instrucciones Número de catálogo Fabricante Producto medicinal de diagnóstico in vitro Limitación de temperatura Contenido sufi ciente para <n> ensayos Irritante Código de lote Nota importante it Conservare al buio Da utilizzare entro e non oltre Leggere le istruzioni prima dell uso Numero catalogo Produttore Dispositivo medicodiagnostico in-vitro Limitazione temperatura Contenuto suffi ciente per test <n> Irritante Codice del lotto Nota importante pt nl da Conservar num local escuro A utilizar de preferência antes de Antes de usar, leia as instruções Número de catálogo Aviso importante Donker Tenminste Gebruik- PapilloCheck bewaren houdbaar saanwij- zing tot lezen Catalogusnummer Fabricante Fabrikant Opbevares Anvendes Læs brugs- Katalognummer Producent mørkt senest anvisnin- gen Dispositivo médico de diagnóstico in vitro In vitro diagnostisch medisch product Limitação de temperatura Conteúdo sufi ciente para <n> ensaios Voldoende inhoud voor <n> tests Indeholder nok til <n> test Irritante Irriterend Código do lote Lot nummer In vitro meskdicin doagnoseapparat Temperaturbegraensær Lokalirriterende Lotnummer Temperatuurbeperking Belangrijke opmerking Vigtig henvisning sv pl no el Förvaras mörkt. Viktigt meddelande Przechowywa ć w ciemności Sista förbrukningsdag Termin zydatności Ograniczenie tempera- Kit diagnóstico para instrukcję a genotipagem de papillomavirus Produkt tury humano testów tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 3, 40, 42,43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, yw59,66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais. Oppbeva- REF res mørkt Przed użyciem przeczytać Läs bruksanvisningen före användning Katalognummer Tillverkare Producent In vitromedicinsk doagnostisk apparatur Para uso em diagnóstico in vitro Apenas Αποθηκεύεται por το λιγότερο pessoal πριν την profissional Αριθμός de Παραγωγός laboratório In vitro στα σκοτεινά holdbar til διατηρείται Les bruksanvisning før bruk χρήση διαβάστε τις οδηγίες katalognummer Καταλόγου produsent in vitro-diagnostisk medisinsk utstyr διαγνωστικά ιατρικά προϊόντα Temperatur-begränsning Numer katalogowy Diagnostyka in vitro temperaturbegrensning περιoριoμός θερμοκραο ίας Innehållet räcker till <n> tester Zawartość wystarcza na <n> Innhold tilstrekkelig for <n> tester Περιεχόμενο αροκετό για <n> τεοτ irriterande Lot nummer drażniący Kod partii Ważne irriterende batch nr. Viktig merknad ερεθιστικό κωδικός παρτίδας Σημαντική υπόδειξη tr Karanlık yerde saklayınız Son kullanma tarihi: Kullanmadan önce talimatı Katalog numarası Üretici fi rma In vitro diagnostik tıbbi tanı ürünü Sıcaklık sınırlaması Greiner okuyun Bio-One GmbH İçeriği <n> test için yeterlidir Tahriş edici Parti kodu Önemli Not 2

3 TABLE OF CONTENTS 1. CONTEÚDO DO KIT CONSUMÍVEIS, EQUIPAMENTO E HARDWARE NECESSÁRIO... HPV DNA-Chip6 3. TRANSPORTE E ESTOCAGEM INSTRUÇÕES DE SEGURANÇA DESCARTE DE DEJETOS INTRODUÇÃO Finalidade do teste Tipos de HPV detectáveis com Princípio do ensaio Design do chip de DNA Layout do chip Controles na microplaca (On-chip) INSTRUÇÕES DE USO PARA O FLUXO DE TRABALHO PAPILLOCHECK Instruções gerais Separação de salas Cuidados e precauções Prevenção de contaminação Instruções para manipular os chips DNA Precauções gerais Segurança no trabalho PROCEDIMENTO PAPILLOCHECK Coleta de amostras e extração do DNA Coleta de amostras Extração do DNA Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) Preparação do termociclador...21 Kit diagnóstico para a genotipagem de papillomavirus humano tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, , 40, Tratamento 42,43, 44/55, Uracil-N-Glicosilase 45, 51, 52, 53, 56, (UNG) 58, ,66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais Preparação da reação PCR REF Hibridização e lavagem Preparação and disposição...25 Para uso em diagnóstico in vitro Hibridização...27 Apenas por pessoal profissional de laboratório Lavagem e secagem Escaneamento e avaliação do chip

4 9. RESOLUÇÃO DE PROBLEMAS ASSISTÊNCIA TÉCNICA CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO DO PAPILLOCHECK HPV DNA-Chip 11.1 Desempenho analítico do Sensibilidade analítica Especifi cidade analítica Tipos de HPV Especifi cidade analítica Organismos não HPV Repetibilidade Reprodutibilidade Robustez Desempenho clínico do PAPILLOCHECK PROTOCOLO CURTO Sala 2: PCR - Setup da reação mix Sala 2: PCR-adição template DNA / Reação de PCR Sala 3: Preparação da hibridização/ Reação de hibridização Sala 3: Lavagem & Secagem / Scaneamento e Avaliação...44 Kit diagnóstico para a genotipagem de papillomavirus humano tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 3, 40, 42,43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59,66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais. REF Para uso em diagnóstico in vitro Apenas por pessoal profissional de laboratório 4

5 1. CONTEÚDO DO KIT Test Kit 1 Conteúdo Quantidade PCR MasterMix Caixa de lâminas, 5 x 12 Arrays 5 x PCR MasterMix 2 5 x 300 µl 1 x Caixa de lâminas Com 5 chips 3 HPV DNA-Chip 5 x 12 Arrays Tampão de Hibridização Tampão A conc. Tampão B conc. 2 x Tampão de Hibridação 2 x Tampão A concentrado 2 x Tampão B Concentrado 2 x 1000 µl 2 x 40 ml 2 x 15 ml 1 Um kit é sufi ciente para a análise de 60 amostras. 2 Contém todos os componentes necessários para PCR exceto para a DNA Taq Polimerase e o Uracil-N-Glycosilase. 3 Um chip contém 12 microarrays Kit diagnóstico para a genotipagem de papillomavirus humano tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 3, 40, 42,43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59,66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais. REF Para uso em diagnóstico in vitro Apenas por pessoal profissional de laboratório 5

6 2. CONSUMÍVEIS, EQUIPAMENTO E HARDWARE NECESSÁRIO Recomenda-se o uso do em combinação com os consumíveis listados, equipamentos e hardware apenas por profi ssionais. HPV DNA-Chip Consumíveis Greiner Bio-One N Cat Quantidade Test Kit Kit para 60 testes Kit Coleta amostras ocheck DNA Kit de extração / Preparação Coluna Única Kit para 50 preparações ocheck DNA Kit de extração / Preparação 8 Colunas x 8 preparações Ponteiras filtro para micropipetas isentas de DNA, estéreis μl ponteiras fi ltro μl ponteiras fi ltro μl ponteiras fi ltro μl ponteiras fi ltro μl ponteiras fi ltro Tubos de ensaio isentos de DNA Tubo de ensaio 1.5 ml Tubo de ensaio 0.2 ml 2 8 x 0.2 ml para tiras PCR Tampa para tiras 8 x 0.2 ml tiras PCR /960 96/960 96/960 96/960 60/ / / / /1250 Tubo em polipropileno 50ml /450 Pipetas plásticas para pipetador Pipeta de 10 ml Pipeta de 25 ml Pipeta de 50 ml ou ou ou /200 1/200 1/200 1 Algumas das medidas de ponteiras são opcionais dependendo das micropipetas disponíveis. 2 A princípio, recomenda-se utilizar tiras PCR para 8 tubos. Tubos para reação única (0.2ml) são opcionais se as tiras não estiverem disponíveis. 3 Somente é necessário se uma centrífuga de lâminas não estiver disponível. Kit diagnóstico para a genotipagem de papillomavirus humano tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 3, 40, 42,43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59,66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais. REF Para uso em diagnóstico in vitro Apenas por pessoal profissional de laboratório 6

7 Equipamento Greiner Bio-One N Cat Quantidade CheckScanner TM CheckReport TM Software Basic CheckReport TM Software plugin ocheck Hibridização Chamber com porta-lâminas HPV DNA-Chip 1 Cabo para porta-lâminas Caixa de lavagem ocheck ocheck VacSet ocheck VacPump Enzimas necessárias Taq Polimerase: HotStarTaq DNA Polymerase 5 U/μl (Qiagen; , , , ) Uracil-N-Glicosilase : Uracil-DNA Glicosilase 1 U/μl (Fermentas; #EN0361, #EN0362) Consumíveis adicionais necessários Água para PCR (PCR-grade water) Água destilada ou deionizada Luvas de uso único Equipamentos adicionais necessários Microcentrífuga para tubos de ensaio 1.5 e 2 ml Centrífuga para tubos de polipropileno 50ml (por exemplo, BeckmanCoulter - Centrífuga Allegra X-22, C0650 Rotor ângulo fi xo) ou centrífuga de laminas (por exemplo, Labnet - Slide Spinner; VWR International - Centrífuga Galaxy MiniArray) Microcentrífuga tubos de ensaio 0.2 ml (um tubo) ou 8-tubos tiras PCR (por exemplo, Labnet - Spectrafuge Mini Centrífuga) Termociclador PCR Sistema GeneAmp PCR 9700 (Applied Biosystems) ou Veriti Termociclador para 96-poços (Applied Biosystems) Banho-maria (50 C) Micropipetas (diversas capacidades entre μl) Multipipeta 8-Canais multipipeta (faixa: 5-50μl), por exemplo, Brand Transferpette -8 (Brand) Pipetador para pipetas de vidro ou plástico Agitador tipo vórtex Racks para tubos de ensaio de diversas dimensões Hardware adicional necessário Computador (para os requisitos do sistema, consultar as instruções de uso do CheckScanner TM e CheckReport TM Software) 4 Para o procedimento de lavagem, três ocheck Washboxes são necessárias. 5 Somente Kit diagnóstico necessário quando para em a combinação genotipagem com Cat. de No. papillomavirus humano tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 3, 40, 42,43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59,66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais. REF Para uso em diagnóstico in vitro Apenas por pessoal profissional de laboratório 7

8 3. TRANSPORTE E ESTOCAGEM O transporte do Test Kit é realizado a temperatura ambiente. No entanto, o kit deve ser imediatamente estocado após o recebimento entre 4-C ao abrigo da luz. Quando estocado corretamente o Test Kit e seus componentes podem ser utilizados até a data de validade indicada. Além disso, sob estas condições o prazo de validade não se desvia da data de HPV DNA-Chip validade após a primeira abertura do kit e seus componentes 4. INSTRUÇÕES DE SEGURANÇA O Test Kit é exclusivamente de uso laboratorial, não é um medicamento, produto doméstico ou para outras fi nalidades. Utilizar sempre um avental de laboratório, luvas descartáveis e óculos de proteção. Seguir as instruções de segurança apresentadas nesta seção. Os componentes a seguir do Test Kit contém produtos nocivos ou perigosos. Componente Conteúdos Perigosos Símbolo de Perigo Frases de Segurança Frases de Segurança Frases de Segurança Tampão de hibridização Tiocianato de guanidina (25-60%) Nocivo* R 20/21/22 R 32 R 52/53 S13 S61 S36/37 Tampão B <20% de dodecilsulfato de sódio Perigoso* R 21/22 R 36/37/38 S26 S36/37 * Rotulagem de perigo não necessária para embalagens pequenas de até 125g ou ml (de acordo com a 67/548/EEC Art.25, 1999/45/EC Art. 12 e German GefStoffV 20(3) e TRGS ). Para maiores informações consultar a Folha de Dados de Segurança Frases de Risco R 21/22 Perigoso se em contato com a pele e se ingerido. R 20/21/22 Perigoso por inalação, em contato com a pele e se ingerido. R 33 Em contato com ácidos libera gases muito tóxicos. R 36/37/38 Irritante para os olhos, sistema respiratório e pele. R 52/53 Perigoso para organismos aquáticos, pode causar efeitos em longo prazo ao meio ambiente aquático. Frases de Segurança S13 Manter distante de alimentos, bebidas e rações animais. S26 Em caso de contato com os olhos, enxaguar imediatamente com grandes volumes de água e procurar por Kit diagnóstico para a genotipagem de papillomavirus humano tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33, auxílio médico imediatamente. S36/37 35, 3, Utilizar 40, 42,43, roupas 44/55, de proteção 45, 51, adequadas 52, 53, e 56, luvas. 58, 59,66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais. S61 Evitar o descarte ao meio ambiente. Consultar as instruções especiais/folha de dados de segurança. REF A versão atual da Folha de Dados de Segurança para este produto pode ser baixada a partir do website Para da uso Greiner em Bio-One: diagnóstico in vitro Apenas por pessoal profissional de laboratório 8

9 5. DESCARTE DE DEJETOS Após lavar e secar o chip, as soluções de lavagem I, II e III podem ser descartadas sem nenhum tipo de precaução especial. Descartar o chip usado, componentes não utilizados do kit assim como uma mistura de hibridização não utilizada com o descarte químico do laboratório. Cumpra todos os regulamentos nacionais, estatais e locais relativos à eliminação de HPV DNA-Chip resíduos. Kit diagnóstico para a genotipagem de papillomavirus humano tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 3, 40, 42,43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59,66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais. REF Para uso em diagnóstico in vitro Apenas por pessoal profissional de laboratório 9

10 6. INTRODUÇÃO Uma infecção persistente com o papillomavirus carcinogênico humano (HPV) é encontrado virtualmente em todos os casos de câncer cervical o segundo câncer mais comum em nível mundial entre as mulheres 1. Até a presente data acima de 100 tipos de HPV foram identifi cados, dos quais cerca de 40 tipos são sexualmente transmissíveis e infectam a mucosa cervical. Os tipos HPV DNA-Chip de HPV cervical são classifi cados tanto como alto risco (HPV alto risco, hrhpv) e grupo de baixo risco (baixo risco HPV, lrhpv). Considerando que os tipos de HPV de alto risco estão associados com um risco maior de desenvolvimento de câncer cervical, os tipos de PHV de baixo risco causam sobretudo verrugas genitais benignas 2. Contudo, mesmo dentro do grupo de alto risco, o risco relativo para o desenvolvimento de cancro ou de lesões intraepiteliais cervicais (CIN) depende do tipo do vírus 3. Cerca de 70% de todos os casos de câncer cervical estão conectados a uma infecção persistente tanto por HPV 16 como HPV 18. Os tipos de baixo risco mais prevalente são os HPV 6 e HPV 11. Com base na ligação etiológica quase absoluta entre HPV carcinogênico e o câncer cervical, os testes para hrhpv (alto risco) atualmente estão sendo considerados para o rastreamento primário de câncer cervical Finalidade do teste é um kit para diagnóstico in vitro para a detecção qualitativa e genotipagem de 24 tipos do papillomavirus humano em preparações de DNA obtidas de esfregaços cervicais humanos. O kit destina-se a ser utilizado apenas por pessoal profi ssionalmente qualifi cado. PapilloCheck preenche os requisitos da Norma Européia In Vitro Diagnostic Medical Device Directive (98/79/EC) e portanto possui a marca de conformidade CE. Qualquer resultado de diagnóstico obtido, utilizando o, deve ser interpretado em conjunto com outras descobertas clínicas ou laboratoriais. 6.2 Tipos de HPV detectáveis com permite a identifi cação de 18 tipos de HPV de alto risco risco do papillomavirus humano (HPV). (Tabela 1) e 6 tipos de HPV de baixo Tabela 1: Tipos de HPV detectáveis com HPV 16 HPV 45 HPV 59 HPV 6 HPV 18 HPV 51 HPV 66 HPV 11 HPV Kit diagnóstico 31 HPV para 52a genotipagem HPV 68de papillomavirus HPV 40 humano tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33, HPV 35, 33 3, 40, 42,43, HPV 44/55, 53 45, 51, 52, HPV 53, 7056, 58, 59,66, HPV 68, 42 70, 73, 82 em amostras cervicais. HPV REF HPV 56 HPV 73 HPV 43 HPV 39 HPV 58 HPV 82 HPV 44 / HPV 55* Para uso em diagnóstico in vitro * PapilloCheck Apenas não por permite pessoal a diferenciação profissional entre de o HPV laboratório 44 e o HPV

11 6.3 Princípio do ensaio é um teste baseado na tecnologia de microarray para a detecção e genotipagem de um fragmento do gene E1 do genoma do papillomavirus humano (HPV). O procedimento de teste está resumido na Figura 1. HPV DNA-Chip Antes da análise do, o DNA deve ser extraído de uma amostra de esfregaço cervical. A coleta da amostra e a extração por DNA não fazem parte do Test Kit. Os produtos para coleta de amostras ( Collection Kit) e extração do DNA (ocheck DNA Extraction Kit) também estão disponíveis na Greiner Bio-One e devem ser adquiridos em separado (consultar as especifi cações para aquisição no Capítulo 2). Após a extração do DNA genômico humano e viral de uma amostra cervical, o fragmento 350 bp do gene viral E1 é amplifi cado por uma reação em cadeia da polimerase na presença de um conjunto de primers para HPV específi cos. Na mesma reação, um fragmento do gene humano ADAT1 de cópia simples (deaminase-1 adenosina trna-específi ca humana) é amplifi cada para monitorar a presença do material da amostra humana na amostra cervical (amostra controle) e um template-controle interno presente no PCR MasterMix é amplifi cado para monitorar o desempenho do PCR (Controle PCR). Além disso, o PCR MasterMix contém dutp. Assim, a potencial contaminação cruzada de reações de PCR anteriores ( carry-over ) pode ser eliminada através da utilização do tratamento com Uracilo-N-Glicosilase (UNG) (ver capítulo 8.2.2). Os produtos PCR são então hibridizados para sondas DNA específi ca e controles on-chip ligados à superfície do chip. Cada chip contém 12 microarrays de DNA, permitindo a análise simultânea de 12 amostras cervicais. Durante a hibridização, o DNA ligado é marcado por fl uorescência e o DNA não ligado é removido nas etapas de lavagem subsequentes. A efi ciência da hibridização é monitorada (controle de hibridização). Finalmente, o chip é scaneado, analisado e avaliado automaticamente usando o CheckScanner PapilloCheck TM e CheckReport TM Software, respectivamente (consultar as especifi cações para aquisição no Capítulo 2). O CheckScanner TM é um scanner a laser bicolor (comprimento de onda de excitação 532nm e 635nm) que possibilita a detecção do sinal de fl uorescência gerado pela presença do produto de amplifi cação específi cos de HPV bem como os controles (ver Capítulo 6.4.2). Instruções O CheckReport de Uso TM Software possibilita a visualização, análise e avaliação dos resultados e apresenta automaticamente os valores correspondentes tanto dos tipos de HPV detectados como dos controles em um relatório detalhado. O relatório indica claramente a presença ou ausência de um ou mais dos 24 tipos de HPV detectáveis e os controles abrangentes no-chip tornam a análise altamente confi ável.. Kit diagnóstico para a genotipagem de papillomavirus humano tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 3, 40, 42,43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59,66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais. REF Para uso em diagnóstico in vitro Apenas por pessoal profissional de laboratório 11

12 1. Reação PCR: HPV DNA-Chip 2. Hibridização 3. Lavagem e secagem ou 4. Scaneamento e análise Kit diagnóstico para a genotipagem de papillomavirus humano tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 3, 40, 42,43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59,66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais. REF Para uso em diagnóstico in vitro Apenas por pessoal profissional de laboratório Figura 1: Procedimento do teste 1. Reação PCR: Após a detecção do DNA, um fragmento de 350 bp do gene viral E1 e dois fragmentos dos controles alvo são amplifi cados por PCR. Os produtos de amplifi cação são então hibridizados para sondas DNA complementares no chip. 2. Hibridização: Cada tipo de HPV é detectado por uma sonda DNA presente no chip em cinco replicatas. Durante a hibridização uma marcação fl uorescente é introduzida. 3. Lavagem e secagem: O DNA não ligado é removido nas etapas de lavagem subsequentes. 4. Scaneamento e análise: Greiner Bio-One O chip GmbH é scaneado e avaliado utilizado o CheckScannerTM e o CheckReport TM Software. Maybachstr. Um relatório é criado, Frickenhausen o qual indica claramente Alemanhaa presença ou ausência de um ou mais tipos de HPV detectáveis. 12

13 6.4 Design do chip de DNA Layout do chip Cada chip contém 12 microarrays designados como poços A1-B6. Cada microarray é composto por 28 sondas diferentes e está rodeado por uma borda elevada. Cada HPV DNA-Chip sonda é colorida em cinco réplicas. A disposição do microarray na lamina do é ilustrada na Figura 2 e os controles onchip são explicados no Capítulo controlo da orientação controlo da PCR a) b) canal vermelho (635 nm) canal verde (532 nm) VPH 6 VPH 11 VPH 16 VPH 18 VPH 31 VPH 33 VPH 35 VPH 39 VPH 40 VPH 42 VPH 43 VPH 44/55 controlo da hibridação controlo da orientação VPH 6 VPH 11 VPH 16 VPH 18 VPH 31 VPH 33 VPH 35 VPH 39 VPH 40 VPH 42 VPH 43 VPH 44/55 VPH 45 VPH 51 VPH 52 VPH 53 VPH 56 VPH 58 VPH 59 VPH 66 VPH 68 VPH 70 VPH 73 VPH 82 controlo da amostra controlo da PCR VPH 45 VPH 51 VPH 52 VPH 53 VPH 56 VPH 58 VPH 59 VPH 66 VPH 68 VPH 70 VPH 73 VPH 82 c) controlo da hibridação controlo da amostra Kit diagnóstico para a genotipagem de papillomavirus humano tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 3, 40, 42,43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59,66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais. REF Figura 2: Design do chip a) Esquema do chip PapilloCheck Para uso em diagnóstico. b) e c) Imagens apresentadas pelo CheckReport in vitro TM Sofware para os dois comprimentos de excitação de onda utilizados para scanear (b) canal vermelho: 635nm; c) canal verde: 532nm) e esquemas da disposição Apenas do microarray por pessoal PapilloCheck profissional de laboratório. As sondas HPV específi cas e os controles on-chip estão indicados. 13

14 6.4.2 Controles na microplaca (On-chip) O design do chip DNA inclui controles abrangentes on-chip. Diversos sistemas de controle monitoram todas as etapas críticas tanto do ensaio como do processamento do chip, incluindo a qualidade da amostra e extração do DNA (controle da amostra), qualidade da reação PCR (controle PCR), a efi cácia da hibridização (controle da hibridização), assim como a homogeneidade das colorações e qualidade da impressão (controle da orientação e controle da HPV impressão). DNA-Chip Além disso a presença ou ausência dos tipos HPV, o CheckReport Software mostra automaticamente os valores correspondentes tanto dos controles como dos tipos de HPV detectados em um relatório detalhado. Para a leitura dos diferentes controles ambos os comprimentos de excitação de onda do CheckScanner são utilizados. Para o controle do desempenho do teste (amostra e controle PCR), o canal vermelho é usado (comprimento de excitação de onda de 635nm), enquanto a qualidade da hibridização e o chip (hibridização, orientação e controle de impressão) é avaliado no canal verde (comprimento de excitação de onda de 532nm). Controle da amostra monitora a qualidade da amostra e/ou extração do DNA amplifi cando um fragmento do gene humano de cópia simples - ADAT1(adenosina deaminase-1 trna - específi co de humano). Se o DNA humano estiver presente em uma quantidade adequada no DNA extraído da amostra cervical, um sinal fl uorescente é gerado nas colorações de controle de amostra. Se não houver uma amplifi cação ADAT1, ou se for insufi ciente, o CheckReport Software irá relatar a amostra controle como failed (falha) e deverá se repetir a análise devido à quantidade insufi ciente de células na amostra cervical e/ou um desempenho de extração insufi ciente (ver Capítulo 9). Controle PCR também monitora a qualidade da reação PCR. A amplifi cação de um template de controle interno presente no PCR MasterMix gera um sinal nas colorações de controle de PCR no chip. A qualidade da reação de amplifi cação também é automaticamente avaliada pelo CheckReport Software. Se o desempenho PCR estiver abaixo de um patamar prédefi nido, o CheckReport Software irá indicar o controle PCR como failed e a análise deve ser repetida (ver Capítulo 9). Se o total de DNA do HPV na amostra for muito alto, o sinal de fl uorescência das colorações de controle Instruções de PCR pode fi car baixo de ou até Uso ausente, devido à competição durante a reação PCR. Neste caso, o sinal fl uorescente para, pelo menos, uma sonda de HPV específi ca, deve exceder um patamar pré-defi nido para que o teste seja considerado válido. Controle de hibridização monitora a efi cácia da hibridização através do uso de uma sonda marcada para fl uorescência dentro do Tampão de Hibridização do, que hibridiza com sequências específi cas de DNA no chip do.uma efi cácia de hibridação adequada resulta em sinais fl uorescentes em cada coloração de array. Os resultados das cinco colorações de controle de Kit diagnóstico para a genotipagem de papillomavirus humano tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33, hibridização no chip PapilloCheck 35, 3, 40, 42,43, 44/55, 45, 51, são também avaliadas pelo CheckReport 52, 53, 56, 58, 59,66, 68, 70, 73, 82 em amostras TM Software. cervicais. Orientação REF 465 e Controle 060 da Impressão As colorações de controlo da orientação do chip geram sinais de fl uorescência independentes Para uso em da efi diagnóstico ciência do in processo vitro de hibridização. Estas colorações são usadas pelo CheckReport Apenas TM por Software pessoal como profissional pontos guia de para laboratório encontrar uma coloração correta, o que é um prérequisito para a análise correta dos sinais. Além disso, a qualidade do processo de impressão é monitorada pela presença do sinal de fl uorescência verde em cada mancha do chip (controle da impressão). 14

15 7. INSTRUÇÕES DE USO PARA O FLUXO DE TRABALHO PAPILLOCHECK 7.1 Instruções gerais Quando se implantam as técnicas modernas, atualmente utilizadas, de biologia HPV molecular DNA-Chip num laboratório, devem se ter em conta as instruções seguintes para garantir a máxima segurança da equipe do laboratório e resultados de alta qualidade. A execução de técnicas de biologia molecular tais como extração do DNA, amplifi cação e detecção dos produtos de amplifi cação necessita pessoas apropriadamente qualifi cadas. Além disso, um fl uxo de trabalho bem estruturado e limpo é necessário para impedir resultados errôneos, tais como os que ocorrem devido à degradação do DNA ou contaminação por produtos de amplifi cação. Para assegurar isto, é necessário separar as áreas de extração, amplifi cação e detecção, como descrito no Capítulo 7.2. Cada área deve estar equipada com equipamentos, consumíveis, aventais e luvas exclusivas. Nunca transferir aventais de laboratório, luvas e equipamentos de uma sala para outra. 7.2 Separação de salas A Figura 3 apresenta um exemplo de como um laboratório pode ser separado em três seções distintas. Uma utilizada apenas para a extração do DNA, outra para a instalação e realização das reações PCR e a última é para hibridização e análise. Cada sala é usada exclusivamente para a aplicação ou técnica indicada para impedir a contaminação das amostras. O uso de códigos de cores pode ser vantajoso para evitar a troa acidental de equipamentos e consumíveis entre as áreas. Sala 1 Sala 2 Sala 3 Figura Kit 3: Separação diagnóstico das salas para a genotipagem de papillomavirus humano tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33, Sala 1: Todo o procedimento de extração do DNA deve ser realizado nesta sala. Sala 2: 35, Dentro 3, 40, desta 42,43, sala, a 44/55, reação 45, mix 51, para 52, o PCR 53, é 56, realizada 58, 59,66, e aliquotada 68, 70, (de 73, modo 82 em ótimo amostras sob uma capela cervicais. PCR). A adição de amostras de DNA extraídas na sala 1 deve ser realizada em um espaço separado dentro da sala 2. Sala 3: REF Dentro 465 da 060 Terceira sala do laboratório ocorre a reação de hibridização, etapas de lavagem e secagem do chip. Adicionalmente, o CheckScanner TM em conjunto com o CheckReport TM Software são utilizados para a análise fi nal do teste PapilloCheck Para uso. em diagnóstico in vitro Apenas por pessoal profissional de laboratório Não se deve trocar nem equipamento nem consumíveis entre as diferentes salas e espaços do laboratório.! Portanto, as duplicações de equipamento e consumíveis são uma necessidade e devem ser consideradas ao equipar o laboratório 15

16 7.3 Cuidados e precauções Prevenção de contaminação Devem ser utilizados aventais de laboratório durante todo o procedimento e conjuntos diferentes de aventais são necessários para cada sala do laboratório. HPV DNA-Chip As luvas devem ser utilizadas durante cada etapa da análise e devem ser trocadas com frequência especialmente durante a extração de DNA O local de trabalho devem ser descontaminados com uma solução de limpeza apropriada. Não tocar nunca a parte interna da tampa do tubo de ensaio. Para evitar a contaminação cruzada, abrir um tubo de cada vez. Ponteiras de micropipetas com fi ltro e barreira de aerosol adequadas devem ser utilizadas (isentas de DNAse, RNAse, DNA humano). As ponteiras das pipetas sempre devem ser trocadas entre as transferências de líquidos Instruções para manipular os chips DNA Os chips devem ser utilizados em um ambiente isento de poeira. A deposição de poeira e outras partículas na superfície do chip deve ser evitada. Não tocar a zona de hibridização na superfície do chip. Apenas o lado marcado do chip desgina-se à hibridização. Não utilizar quaisquer canetas marcadoras para a identifi cação dos chips de DNA, pois causam fl uorescência inespecífi ca no chip. Os arrays DNA são para uso único. Os chips hibridizados não podem ser reutilizados. Estocar os chips não utilizados na embalagem original dentro da embalagem com zíper contendo o dessecante Precauções gerais Este kit é de uso exclusivo para diagnóstico in vitro e só pode ser utilizado por pessoal treinado na prática de laboratório de diagnóstico in vitro. Desde o recebimento, verifi car os componentes do kit em relação a danos. Se um dos componentes estiver danifi cado (por exemplo, os frascos dos tampões), contatar o seu distribuidor da Greiner Bio-One. Não utilizar componentes do kit danifi cados, pois o seu uso pode causar um desempenho defi ciente. Não utilizar o Test Kit após a data de validade. Kit diagnóstico para a genotipagem de papillomavirus humano tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33, Não 35, utilizar 3, 40, reagentes 42,43, 44/55, vencidos. 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59,66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais. Não misturar reagentes de lotes diferentes. REF Utilizar reagentes/equipamentos fornecidos com o kit e os recomendados pelo fabricante. Deve Para se uso efectuar em diagnóstico a calibração/manutenção in vitro regular das micropipetas, do banho-maria e do bloco de Apenas aquecimento. por pessoal profissional de laboratório A pipetagem de pequenos volumes de líquido na faixa de microlitros é um desafi o. Portanto, tomar cuidado para pipetar da forma mais precisa possível. Para evitar a contaminação microbiana dos reagentes, tomar cuidado ao remover alíquotas dos tubos de reagentes. Todas as etapas Greiner de centrifugação Bio-One GmbH devem ser realizadas a temperatura ambiente (18-25 C). 16

17 7.3.4 Segurança no trabalho Tomar cuidado quando manipular amostras biológicas contendo materiais humanos potencialmente infecciosos. Para minimizar o risco de infecção de materiais potencialmente infecciosos, recomenda-se trabalhar sob uma cabine de segurança biológica até a lise da amostra seja concluida. Manipular e descartar todos as amostras biológicas como se fossem capazes de transmitir agentes infecciosos. HPV DNA-Chip Nunca pipetar soluções com a boca. Não comer, beber, fumar ou aplicar produtos cosméticos nas áreas de trabalho. Evitar o contato direto com as amostras biológicas assim como respingar ou pulverizar as amostras. Utilizar sempre um avental de laboratório, luvas e óculos de proteção ao manipular amostras de origem humana. Lavar cuidadosamente as mãos após manipular amostras e reagentes. Kit diagnóstico para a genotipagem de papillomavirus humano tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 3, 40, 42,43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59,66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais. REF Para uso em diagnóstico in vitro Apenas por pessoal profissional de laboratório 17

18 8. PROCEDIMENTO PAPILLOCHECK O capítulo a seguir descreve detalhadamente as diferentes etapas de trabalho as quais finalmente levam à realização de um relatório detalhado, indicando claramente a presença ou ausência de um ou mais dos 24 tipos de HPV detectáveis em cada amostra cervical analisada. A Figura 4 apresenta um resumo das diferentes etapas de trabalho necessárias. Também indica o sub-capítulo correspondente que descreve a etapa específica do teste. As etapas de trabalho devem ser realizadas na sequência descrita neste capítulo. Cada etapa específica que necessita de trabalho manual está indicado com uma flecha.! Coleta de amostras, extração do DNA e análise com o CheckReport TM Software não são parte do Test Kit. Desta forma, a descrição destas etapas de trabalho está abreviadas dentro deste capítulo. Para informações mais detalhadas, favor consultar as instruções de uso correspondentes instruções de uso, por exemplo, do Collection Kit, ocheck DNA Extraction Kit e o CheckReport TM Software. 8.1 Coleta de amostras e extração do DNA Coleta de amostras A coleta da amostras não faz parte do Test Kit. Uma coleta específica para amostras cervicais ( Collection Kit) também está disponível na Greiner Bio-One (consultar as especificações para aquisição no Capítulo 2). O foi validado utilizando DNA preparado com o ocheck DNA Extraction Kit a partir de esfregaços cervicais humanos coletados com um dos seguintes sistemas ou meios de coleta: Collection Kit (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemanha) PreservCyt (Hologic, Bedford, MA, EUA) Surepath (BD, Franklin Lakes, NJ, EUA) STM TM (Qiagen, Hilden, Alemanha). Para maiores informações a respeito de meios de transporte adequados ou sistemas de extração de DNA, favor contatar o seu distribuidor da Greiner Bio-One ou consultar o website 18

19 Capítulo Extracção de ADN Capítulo 8.2 PCR Capítulo Hibridação Capítulo Lavagem e secagem ou Capítulo 8.4. Varrimento e avaliação Figura 4: Resumo das diferentes etapas de trabalho do 19

20 8.1.2 Extração do DNA A extração do DNA não faz parte do Test Kit. A extração do DNA antes da análise pelo deve ser realizada usando o ocheck DNA Extraction Kit, também fornecido pela Greiner Bio-One (consultar as especificações para aquisição no Capítulo 2). Favor consultar as cuidadosamente quando utilizar ocheck DNA Extraction Kit. Para a extração do DNA com o ocheck DNA Extraction Kit, é necessário o uso de 250μl de solução de amostra. As amostras cervicais humanas que forem coletadas com: Collection Kit (Greiner Bio-One, cód ) PreservCyt Collection Medium (Hologic, Bedford, MA, USA) podem ser processadas diretamente. As amostras cervicais humanas que forem coletadas com: Surepath TM Collection Medium (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) devem ser lavadas antes do uso: centrifugar 250μl da amostra durante 5 minutos a 11,000 g e resuspender o pellet em 250μl de água destilada. Subsequentemente, os 250μl podem ser processados com ocheck DNA Extraction Kit. As amostras cervicais humanas que forem coletadas com: STM TM Collection Medium (Qiagen, Hilden, Germany) devem ser diluídas: usar 100μl da amostra e adicionar 150μl de água destilada. O volume 250μl da amostra diluída pode ser processada com o ocheck DNA Extraction Kit. Em geral, se a amostra de esfregaço cervical parecer muito concentrada e já agregada. A amostra deve ser diluída e homogeneizada antes de iniciar a extração do DNA! Os esfregaços de amostras cervicais que estão muito diluídas e sem células visíveis devem ser concentradas de modo a atingir um rendimento mais alto de células para a extração do DNA: centrifugar até 1000μl da amostra durante 5 minutos a 11,000g e resuspender o pellet em 250μl de água destilada. Subsequentemente os 250μl podem ser processados com o ocheck DNA Extraction Kit! Esta etapa de concentração é apenas apropriada para amostras cervicais que são coletadas com o Collection Kit, em PreservCyt Collection Medium ou em Surepath TM Collection Medium. Se o STM TM Collection Medium tiver sido utilizado, uma concentração por centrifugação não será possível. 20

21 8.2 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) PCR é um método muito sensível que pode detectar quantidades extremamente pequenas de DNA. Deve se tomar precauções especiais para evitar contaminação da reação (ver capítulo 7). As enzimas HotStarTaq Polymerase e Uracil-N-Glicosilase são necessárias mas não são fornecidas com o Test Kit e devem ser adquiridas em separado. (Ver Capítulo 2).! O Test Kit foi validado usando HotStarTaq Polymerase da Qiagen e Uracil-N-Glicosilase da Fermentas (consultar as especificações para aquisição no Capítulo 2). O uso destas enzimas é mandatório de modo a atingir o desempenho estabelecido Preparação do termociclador O Test Kit foi validado com os seguintes termocicladores: GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) Veriti 96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems).! É imprescindível usar um dos dois termocicladores mencionados acima de modo a alcançar o desempenho estabelecido. O programa do termociclador do está resumido na Tabela 2. Tabela 2: Programa do termociclador do PCR Tempo Temp. C N.º de ciclos 20 minutos 37 C 1 15 minutos 95 C 1 30 segundos 25 segundos 45 segundos 30 segundos 45 segundos 95 C 55 C 72 C 95 C 72 C Manter 10 C Além disso, os parâmetros devem ser configurados para cada termociclador. Para uma descrição de como configurar estes parâmetros, consultar as do respectivo termociclador. GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems) Ajustar o volume da reação para 26μl, a velocidade ramp para 9600 e fixar a temperatura da tampa para 103 C. Veriti 96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems) Utilize a ferramenta Método de Conversão (Convert Method) do Termociclador Veriti de 96 Poços para entrar no programa PCR e seleccione 9600 Emulation Mode. Ajustar volume da reação para 26μl e fixar a temperatura da tampa para 103 C. 21

22 8.2.2 Tratamento Uracil-N-Glicosilase (UNG) 1 O PCR MasterMix contém dutp que é incorporada nos produtos de amplificação durante a fase PCR, tornando os produtos PCR passíveis de degradação pela UNG. A UNG cliva os produtos PCR em locais onde o resíduo desoxiuridilato tenha sido incorporado. Os produtos PCR clivados não serão amplificados em uma reação subsequente. Por isso, um tratamento UNG pode se utilizado para eliminar uma contaminação cruzada (carry-over) de reações prévias PCR. 2 Diluir a Uracil-N-Glicosilase 1:200 em água de grau PCR. Usar uma diluição fresca de UNG para cada conjunto de reações de PCR (ver capítulo 8.2.3). Não reutilizar a UNG diluída. Misturar a diluição UNG cuidadosamente com agitador vórtex durante dois segundos e e depois reduzindo a rotação, ou através de pipetagem várias vezes. A concentração original da Uracil-N-Glicosilase é 1U/μl. Consequentemente a concentração da diluição é de U/μl.! VO kit foi validado usando a Uracil-N-Glicosilase da Fermentas (ver capítulo 2). A utilização desta enzima é obrigatória para se obter o desempenho estabelecido. Adicionar 1μl desta diluição a cada reação de PCR (ver capítulo 8.2.3, Tabela 3). Este total é suficiente para eliminar a contaminação cruzada ( carry-over ) do PCR. Tenha cuidado para não utilizar uma solução de UNG com concentração mais elevada, pois pode causar um efeito adverso no desempenho do PCR, resultando numa sensibilidade reduzida do. Em geral, para o tratamento da UNG, o MIX da reação de PCR é incubada durante 20 minutos a 37 C. Posteriormente, a UNG é inativada através de uma etapa de incubação adicional de 15 minutos a 95 C. Estas duas etapas já estão incorporadas no PCR e correspondem às duas primeiras etapas do programa do termociclador (ver Tabela 2). Dentro da segunda etapa (15 minutos a 95 C) ocorre tanto a inativação da Uracil-N-Glicosilase como a ativação da HotStarTaq Polymerase.! O sistema UNG incorporado no kit eliminará apenas a contaminação cruzada ( carry-over ) com produtos provenientes de reações de PCR prévias. Outra contaminação, por exemplo, que ocorra durante a preparação da amostra, extração do DNA ou adição do template PCR, não podem ser eliminadas. Portanto, é necessário seguir as instruções e precauções especiais para impedir a contaminação descrita no Capítulo 7. 1 A aquisição de faz-se acompanhada de uma licença limitada com os Números de Patentes Norteamericanas , , , e , e as patentes estrangeiras correspondentes. 2 Longo, M.C., et al., Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions, Gene, 93, ,

23 8.2.3 Preparação da reação PCR Com exceção da HotStarTaq Polymerase e da Uracil-N-Glicosilase, o PCR MasterMix já contém todos os componentes necessários para a realização da reação PCR (Tampão PCR, MgCl2, dntps, sondas, template do controle PCR).! O Test Kit foi validado utilizando HotStarTaq Polymerase da Qiagen (ver capítulo 2). A utilização desta enzima é obrigatória para se obter o desempenho estabelecido. A melhor forma de preparar o mix de reação é realizada num ambiente protegido, por exemplo, com uma proteção para PCR, para evitar a contaminação da reação. Preparae o Mix da reação (que consiste em PCR MasterMix, HotStarTaq Polymerase e Uracil-N-Glicosilase ) na quantidade necessária para as reações PCR como descrito na Tabela 3. Para analisar múltiplas amostras, o Mix da reação deve ser preparado em um lote (na quantidade necessária para todas as análises). Para ajustar as variações de volume durante a pipetagem, recomenda-se aumentar (n) por 1 para cada chip (=n+1), por exemplo, preparar um volume de mix de reação para 13 reações de amplificação se 12 amostras devem ser testadas (ver Tabela 3). Sempre utilizar um frasco de MasterMix para as reações de um chip.! Recomenda-se incluir um controle negativo para cada lote de PCR MasterMix preparado. Pode ser utilizado o tampão de eluição DNA do kit de extração DNA apropriado como controle negativo ou água grau PCR. Misture o Mix da reação cuidadosamente com o agitador vórtex durante 2 segundos e depois reduzindo a rotação, ou através de pipetagem várias vezes Aliquotar o mix de reação pipetando 21μl da reação mix para cada reação de PCR em um tubo de reação para PCR de paredes finas de 0.2 ml Efetue a adição do DNA template em um sala separada da de preparação do Mix de reação (ver capítulo 7.2) Adicionar 5μl do extrato DNA para cada reação PCR e misture com o agitador vortex durante 2 segundos, e depois reduzindo a rotação, ou através de pipetagem várias vezes. O volume total de uma reacção de PCR é 26μl. Coloque os tubos de reação no termociclador e inicie a reação de PCR utilizando o programa do termociclador descrito no capítulo (Tabela 2).! Após a conclusão da PCR, os produtos de amplificação devem ser utilizados imediatamente para hibridização ou estocados ao abrigo da luz a -20 C durante uma semana. 23

24 Tabela 3: Preparação da reação de PCR 1 reação 13 reações (1 chip ) 26 reações (2 chips ) 39 reações (3 chips ) 52 reações (4 chips ) PCR MasterMix 19,8 µl 257,4 µl 514,8 µl 772,2 µl 1029,6 µl HotStarTaq Polimerase (5 U/µl) 0,2 µl 2,6 µl 5,2 µl 7,8 µl 10,4 µl Uracil-N-Glycosilase (Diluição de 1:200, U/μl) 1 µl 13 µl 26 µl 39 µl 52 µl Volume total antes da adição da amostra DNA 21 µl 273 µl 546 µl 819 µl 1092 µl Extrato DNA de amostra cervival (DNA template) 5 µl Volume total da reação 26 µl 24

25 8.3 Hibridização e lavagem Preparação and disposição A hibridização deve ser realizada a temperatura ambiente (20-25 C). Iniciar com as preparações necessárias para as etapas de hibridização e lavagem pelo menos 30 minutos antes do início do procedimento de hibridização. Para dissolver os potenciais precipitados nos tampões de hibridização e de lavagem, deixar os mesmos à temperatura ambiente (20-25 C) durante 30 minutos e misture bem antes do uso. A estocagem do Test Kit entre 4-C pode resultar na precipitação do SDS no Tampão de Hibridização e no Tampão B. Deixe as soluções atinjam a temperatura ambiente e a seguir agitar no vórtex o tubo ou agitar o frasco até que qualquer precipitado se dissolva. Prepare a Câmara de Hibridização (ocheck Hibridização Chamber): coloque um papel toalha novo e úmido dentro da Câmara de Hibridização ocheck e fechee a tampa para criar uma atmosfera saturada de umidade. Para evitar a evaporação do pequeno volume de mix de hibridização usado no chip, é necessário realizar a hibridização em uma atmosfera saturada em umidade. Uma Câmara de Hibridização exclusiva para a análise do está à disposição na Greiner-Bio-One (ver Capítulo 2). Incube a quantidade necessária de chips na Câmara de Hibridização a temperatura ambiente (20-25 C) durante, pelo menos, 10 minutos.! O suporte magnético de Lâminas da Câmara de Hibridização contém um ímã em apenas uma das duas extremidades. Se menos que quatro chips de devem ser hibridizados em paralelo, tomar o cuidado de preencher o suporte de lâminas com os chips de do lado oposto do ímã. Senão, os chips de não serão recobertos com o líquido durante o procedimento de lavagem. Prepare as soluções de lavagem I, II e III de acordo com as instruções a seguir. Preparação das soluções de lavagem I, II e III: Prepare o mix para as soluções de lavagem I, II e III adequada ao número de chips de a serem analisados, como demonstrado na Tabela 4. Aliquotar três volumes iguais de mix de solução de lavagem em três ocheck WashBoxes e etiquetar as mesmas como solução de lavagem I, II e III. Cada ocheck WashBox contém uma escala gravada indicando o volume correto de solução necessária para até 4 chips. Utilize esta escala para verificar a quantidade de tampão. Pré-aquecer a solução de lavagem II a 50 C em um banho-maria com temperatura controlada pelo menos 20 minutos antes do uso.certifique-se de que o nível do banho-maria seja igual ao nível da solução de lavagem II. 25

26 Tabela 4: Preparação do mix de solução de lavagem Os volumes apresentados nesta tabela são suficientes para todas as três etapas de lavagem (soluções de lavagem I, II e III) para o número indicado de chips de. Número de chips Componentes Água destilada ou deionizada 140 ml 280 ml 420 ml 560 ml Tampão A 14 ml 28 ml 42 ml 56 ml Tampão B 1,75 ml 3,5 ml 5,25 ml 7 ml Volume total 155,75 ml 311,50 ml 467,25 ml 623 ml! Nunca reutilizae as soluções de lavagem, pois isto pode originarum acúmulo de produtos PCR lavados que possivelmente interferem com os resultados. Utilize soluções de lavagem novas para cada ensaio. O mix de solução de lavagem pode ser estocado até uma semana à temperatura ambiente. Verificar se ocorre precipitação de SDS. Se isto ocorrer, aquecer o mix de solução de lavagem até que o precipitado se dissolva e se equilibre novamente à temperatura ambiente. Em seguida, prepare a nova reação de hibridização. 26

27 8.3.2 Hibridização A hibridização deve ser realizada à temperatura ambiente (20-25 C). As principais etapas de trabalho para a hibridização dos produtos de reação PCR para o dentro do chip são apresentadas na Figura 5. Misture os produtos de PCR antes do uso. Centrifugue brevemente. Se os produtos de PCR foram estocados a -20 C até a hibridização, primeiro descongele os produtos de PCR antes de misturar e a seguir proceder conforme está descrito. Agitar com o vórtex o tampão de hibridização antes do uso. Centrifugue brevemente. Misture 30μl do tampão de hibridização em um tubo de reação limpo ou em uma tira 8x de PCR com 5µl do produto de PCR por agitação no vórtex ou pipetando para cima e para baixo diversas vezes. Centrifugue Brevemente. Transferir 25μl do mix de hibridização em cada poço de chips utilizando seis canais de uma pipeta multicanal. Evitar a formação de bolhas de ar! Recomenda-se processar seis amostras em paralelo utilizando uma pipeta multicanal com 8 ponteiras e tiras PCR 8x (ver Figura 5). Isto aumenta a eficiência de manipulação, a velocidade e desta forma reduz o risco de evaporação. Se for necessário processar mais de um chip por vez, o uso de pipeta multicanal é obrigatório de modo a alcançar o tempo correto de hibridização. Se for possível, hibridizar todos os 12 poços de um chip. No caso de processos inferiores a 12 amostras, deixar os poços não utilizados vazios. Os poços não utilizados de um chip processado não podem ser utilizados para amostras futuras.! Manipular o chip cuidadosamente para evitar derramar o mix de hibridização. Os respingos ou derrames podem causar contaminação cruzada das amostras e resultados falso positivos. Incube o chip exatamente 15 minutos a temperatura ambiente (20-25 C) dentro da Câmara de Hibridização, ao abrigo da luz, em atmosfera saturada de umidade. Tomar cuidado para não mover a Câmara de Hibridização durante a hibridização.! Nunca altere o tempo ou a temperatura de incubação da reação de hibridação, pois isso pode ocasionar a perda de intensidade do sinal fluorescente ou um aumento da fluorescência não específica. Não exponha os chips hibridizados a ação da luz solar direta. 27

28 Prepare a atmosfera saturada de umidade na Câmara de Hibridização. Incube o total necessário de chips a temperatura ambiente (20-25 C) (ver capítulo 8.3.1). Misture 30μl tampão de hibridização em um tubo de reação de 0,2ml de uma tira PCR com 5μl do produto PCR. Misture cuidadosamente. Transfera 25μl do mix de hibridização em cada um dos poços do chip usando uma pipeta multicanal. Feche a câmara de incubação e incube o chip por exatamente 15 minutos a temperatura ambiente (20-25 C). Figura 5: Etapas de trabalho do processo de hibridização 28