PapilloCheck. Instruções para uso IVD

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1 HPV DNA-Chip IVD Fabricado na Áustria 8 C 4 C PapilloCheck Instruções para uso Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais REF Para uso em diagnóstico in vitro somente por profissionais de laboratório Revisão: BQ Março 2016 Greiner Bio-One GmbH Maybachstr Frickenhausen Alemanha Telefone: +49 (0) Fax +49 (0) info@de.gbo.com

2 GLOSSARY OF SYMBOLS en Batch code Use by Consult Instructions for Use Catalog Number Manufacturer In Vitro Diagnostic Medical Device Temperature limitation Contents suffi cient for <n> tests Danger Store in Important the HPV dark DNA-Chip Note de Chargenbezeichnung Mindestens haltbar bis Vor Gebrauch Anweisung lesen Katalognummer Hersteller In-Vitro- Diagnostika Medizinprodukt Temperaturbegrenzung Inhalt ausreichend für <n> Tests Gefahr Im Dunkeln lagern Wichtiger Hinweis fr N o de lot Date limite de conservation jusqu au Lire les instructions avant utilisation Numéro de référence Fabricant Produit médical de diagnostic in-vitro Limite de température Contenu suffi sant pour <n> tests Danger À stocker à l abri de la lumière Note importante es Código de lote A utilizar preferiblemente antes de Antes de usar, lea las instrucciones Número de catálogo Fabricante Producto medicinal de diagnóstica in vitro Contenido sufi ciente para <n> ensayos Peligro Limitación de temperatura Conservar en un lugar oscuro Nota importante it Codice del lotto Da utilizzare entro e non oltre Leggere le istruzioni prima dell uso Numero catalogo Produttore Dispositivo medicodiagnostico in-vitro Contenuto suffi ciente per test <n> Pericolo Limitazione temperatura Conservare al buio Nota importante pt IVD nl Fabricado na Áustria Código do lote Lot nummer A utilizar preferívelmente antes de Tenminste houdbaar tot Antes de usar, leia as instruções Aviso importante Gebruiksaanwijzing lezen Catalogusnummer Número de catálogo Fabricante PapilloCheck Fabrikant Producto medicinal de diagnóstica in vitro In vitro diagnostisch medisch product Limitação de temperatura Conteúdo sufi ciente para <n> ensaios Temperatuurbeperking Voldoende inhoud voor <n> tests Perigo Gevaar Conservar num local escuro Donker bewaren Belangrijke opmerking 8 C 4 C da Lotnummer Anvendes senest Læs brugsanvisningen Katalognummer Producent In vitro meskdicin doag- Instruções para uso nose- apparat Temperaturbegraensær Indeholder nok til <n> test Fare Opbevares mørkt Vigtig henvisning sv Lot nummer Sista förbrukningsdag Läs bruksanvisningen före användning Katalognummer Tillverkare In vitromedicinsk doagnostisk apparatur Temperatur-begränsning Innehållet räcker till <n> tester Fara Förvaras mörkt. Viktigt meddelande pl Kod partii Termin zydatności no batch nr. holdbar til Les REF Przed użyciem przeczytać bruksanvisning før bruk nummer Producent in vitro-diagnostisk medisinsk utstyr temperaturbegrensning Zawartość wystarcza na <n> Innhold tilstrekkelig for <n> tester NIEBEZPIECZ EŃSTWO Numer katalogowy Diagnostyka in vitro Ograniczenie tempera- Equipamento instrukcję para diagnóstico para Produkt a genotipagem tury dos testów tipos do vírus do papiloma humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, yw 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 em amostras katalog- cervicais produsent Fare Przechowywa ć w ciemności Oppbevares mørkt Ważne Viktig merknad el κωδικός παρτίδας το λιγότερο πριν την Para διατηρείται uso em χρήση diagnóstico Καταλόγουin vitro διαβάστε ιατρικά somente por profissionais de laboratório τις οδηγίες Αριθμός Παραγωγός In vitro διαγνωστικά προϊόντα περιoριoμός θερμοκραο ίας Περιεχόμενο αροκετό για <n> τεοτ ΚΊΝΔΥΝΟΣ Αποθηκεύεται στα σκοτεινά Σημαντική Revisão: BQ υπόδειξη Março 2016 tr Parti kodu Son kullanma tarihi: Kullanmadan önce talimatı okuyun Katalog numarası Üretici fi rma In vitro diagnostik tıbbi tanı ürünü Sıcaklık sınırlaması İçeriği <n> test için yeterlidir Greiner Bio-One GmbH Maybachstr Frickenhausen Alemanha Telefone: +49 (0) Fax +49 (0) info@de.gbo.com Tehlikeli Karanlık yerde saklayınız Önemli Not 2

3 ÍNDICE 1. CONTEÚDO DO KIT CONSUMÍVEIS, EQUIPAMENTO E MATERIAL NECESSÁRIO... HPV DNA-Chip6 3. TRANSPORTE E ARMAZENAMENTO INSTRUÇÕES DE SEGURANÇA DESCARTE DE RESÍDUOS INTRODUÇÃO UTILIZAÇÃO PREVISTA TIPOS DE HPV DETECTÁVEIS COM PAPILLOCHECK PRINCÍPIO DE TESTE DESIGN DO CHIP DE DNA PAPILLOCHECK Disposição do chip PapilloCheck Controles no chip INSTRUÇÕES PARA O FLUXO DE TRABALHO DO PAPILLOCHECK IVD Fabricado na Áustria 8 C 4 C 7.1 INSTRUÇÕES GERAIS SEPARAÇÃO DAS SALAS...15 PapilloCheck 7.3 AVISOS E PRECAUÇÕES Prevenção de contaminação Instruções de manuseamento de chips para DNA Precauções gerais...16 Instruções para uso Segurança no trabalho PROCEDIMENTO PAPILLOCHECK COLETA DE AMOSTRAS E EXTRAÇÃO DE DNA Coleta de amostras Extração de DNA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)...21 Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma Preparação do termociclador...21 humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, Tratamento de Uracilo-N-Glicosilase (UNG) , 73, 82 em amostras cervicais Preparação da reação de PCR Procedimento de preparação automática de PCR usando o CheckExtractor REF Manual do procedimento de preparação de PCR Vedação e armazenamento das placas...32 Para uso em diagnóstico in vitro Revisão: BQ Vedação e armazenamento da placa de eluição somente por profissionais de laboratório Março Vedação da placa de PCR Fechar novamente a placa de PCR HIBRIDAÇÃO E LAVAGEM Preparação e disposição Hibridação...36 Greiner Bio-One GmbH Lavagem Maybachstr. e secagem Frickenhausen Alemanha 8.4 ESCANEAMENTO Telefone: E +49 AVALIAÇÃO (0) DO CHIP Fax PAPILLOCHECK +49 (0) info@de.gbo.com 3

4 9. SOLUÇÃO DE PROBLEMAS ASSISTÊNCIA TÉCNICA CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHO DO PAPILLOCHECK HPV DNA-Chip 11.1 DESEMPENHO ANALÍTICO DO PAPILLOCHECK Sensibilidade analítica Especifi cidade analítica tipos de HPV Especifi cidade analítica Organismos Não-HPV REPETIBILIDADE (INTRA-REPRODUTIBILIDADE) REPRODUTIBILIDADE (INTER-REPRODUTIBILIDADE) ROBUSTEZ DESEMPENHO CLÍNICO DO PAPILLOCHECK PROTOCOLO BREVE PAPILLOCHECK SALA 2: PREPARAÇÃO DO MASTERMIX FINAL CONFIGURAÇÃO DA PCR Sala 1: Confi guração Automática de PCR usando o CheckExtractor Sala 2: Preparação manual de PCR SALA 3: HIBRIDAÇÃO - PREPARAÇÃO / REAÇÃO DE HIBRIDAÇÃO SALA 3: LAVAGEM E SECAGEM/ ESCANEAMENTO E AVALIAÇÃO...52 IVD Fabricado na Áustria 8 C 4 C PapilloCheck Instruções para uso Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais REF Para uso em diagnóstico in vitro somente por profissionais de laboratório Revisão: BQ Março 2016 Greiner Bio-One GmbH Maybachstr Frickenhausen Alemanha Telefone: +49 (0) Fax +49 (0) info@de.gbo.com 4

5 1. CONTEÚDO DO KIT Kit de teste 1 PapilloCheck Conteúdo Quantidade PCR MasterMix 6 x PapilloCheck PCR MasterMix 2 6 x µl cada HPV DNA-Chip Preparação MasterMix 6 x frascos para preparação de MasterMix 6 x vazios Caixa de lâminas, 4 x 12 Arrays Tampão de Hibridação TAMP A conc. TAMP B conc. 6 x Caixas de lâminas PapilloCheck com 4 chips 3 PapilloCheck 12 x PapilloCheck Tampão de Hibridação 1 x Tampão A PapilloCheck concentrado 1 x Tampão B PapilloCheck concentrado 24 x 12 Arrays 12 x 1,000 µl 1 x 450 ml 1 x 55 ml 1 Um kit de teste PapilloCheck é sufi ciente para análise de 288 amostras. 2 Contém todos os componentes necessários para PCR exceto para a Taq DNA Polimerase e a Uracilo-N-Glicosilase. 3 Um chip PapilloCheck contém 12 microarrays PapilloCheck. O conjunto principal contém um frasco de Tampão A e um de Tampão B concentrados e seis caixas pequenas de papelão. Cada uma das caixas menores contém materiais adicionais para 48 análises e portanto: um frasco de MasterMix PCR, um frasco para preparação MasterMix, dois frascos de Tampão de Hibridação e uma Caixa de lâmina com quatro chips PapilloCheck. Esse conjunto se baseia no fato de que esse kit não foi feito para ser usado no processamento de remessas menores do que 48 amostras. IVD Fabricado na Áustria 8 C 4 C PapilloCheck Instruções para uso Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais REF Para uso em diagnóstico in vitro somente por profissionais de laboratório Revisão: BQ Março 2016 Greiner Bio-One GmbH Maybachstr Frickenhausen Alemanha Telefone: +49 (0) Fax +49 (0) info@de.gbo.com 5

6 2. CONSUMÍVEIS, EQUIPAMENTO E MATERIAL NECESSÁRIO Recomenda-se a utilização de PapilloCheck em combinação com os consumíveis, equipamento e material indicados e apenas por pessoal profi ssional. Consumíveis Greiner Bio-One Cat. Nº HPV Quantidade DNA-Chip PapilloCheck Kit de teste para 288 reações Kit de teste PapilloCheck amostras Kit de Extração de DNA ocheck / Preparação com Uma Coluna preparações Kit de extração de DNA ocheck - CheckExtractor preparações Pontas de filtro de micropipetas sem DNase, esterilizadas 1 Pontas com fi ltro de 0,5-10 µl Pontas com fi ltro de 0,5-20 µl Pontas com fi ltro de µl Pontas com fi ltro de µl Pontas com fi ltro de µl /960 96/960 96/960 96/960 60/600 Ponteiras de pipeta para o CheckExtractor Ponteiras de pipeta de 300 µl Ponteiras de pipeta de 1000 µl IVD Fabricado na Áustria 8 C 4 C Tubos de ensaio e placas sem DNa-se 2 Tubo de reação de 1,5 ml Tubo de reação de 0.2 ml PapilloCheck 2 8 x tiras de 0,2 ml para PCR Tiras com tampa para 8 x tiras de 0,2 ml para PCR Placa de PCR com código de barras Vedação Instruções para uso Vedação Pearce Vedação Silver CEX / / / / Tubo de polipropileno de 50 ml /450 Pipeta Equipamento de plástico para diagnóstico para a genotipagem ou dos 607 tipos 160 do vírus do papiloma 1/200 humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, /55, 180 ou 45, 76051, 16052, 53, 56, 58, 59, 1/200 66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais ou /200 1 Alguns REF dos 465 tamanhos 088 de pontas mencionados são opcionais dependendo das micropipetas disponíveis. 2 Em princípio, recomenda-se a utilização de tiras de 8 tubos para PCR. Os tubos de reação simples (0,2 ml) são opcionais se as tiras não estiverem disponíveis. Placas de PCR devem ser utilizadas em combinação com o CheckExtractor. 3 Necessário Para uso apenas em se diagnóstico uma centrífuga in de vitro lâminas não estiver disponível. Revisão: BQ somente por profissionais de laboratório Março 2016 Greiner Bio-One GmbH Maybachstr Frickenhausen Alemanha Telefone: +49 (0) Fax +49 (0) info@de.gbo.com 6

7 Equipamento Greiner Bio-One Cat. Nº Quantidade CheckScanner TM Software Básico CheckReport TM Software CheckReport TM e plugin PapilloCheck Computador para CheckScanner TM e Software CheckReport TM HPV DNA-Chip 1 Câmera de Hibridação com suporte de lâmina ocheck Cabo para suporte de lâminas Washbox ocheck CheckExtractor Vedação térmica Adaptador para vedação térmica Placa centrífuga Enzimas necessárias Taq Polimerase: Polimerase de DNA 5 U/µl de HotStarTaq (Qiagen; , , , ) Uracil-N-Glicosilase: 1 U/µl de Uracil-ADN Glicosilase (Fermentas; #EN0361, #EN0362) Consumíveis adicionais necessários Água reagente de PCR Água destilada ou desionizada Luvas descartáveis IVD Fabricado na Áustria 8 C 4 C Equipamento adicional necessário Microcentrífuga para tubos de ensaio de 1,5 e 2 ml Centrífuga para tubos de polipropileno de PapilloCheck 50 ml (por ex. BeckmanCoulter; Centrífuga Allegra X-22; Rotor de Ângulo Fixo C0650) ou centrífuga de laboratório (por ex. Labnet: Slide Spinner; VWR International: Galaxy MiniArray Centrifuge) Microcentrífuga para tubos de reação simples de 0,2 ml ou tiras de 8 tubos para PCR (por ex. Labnet: Spectrafuge Mini Centrifuge) Instruções 5 Termociclador para PCR: para uso GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems), Termociclador Veriti de 96 Poços (Applied Biosystems) ou peqstar 96X Universal (PEQLAB Biotechnologies GmbH) Banho-maria (50 C) Micropipetas (diferentes gamas de 1 a 1000 µl) Multipipeta de 8 canais (gama: 5-50 µl), por ex. Brand Transferpette -8 (Brand) Pipetador para pipetas de vidro e de plástico Agitador de vórtice Racks para diferentes tubos de reação Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma 4 Para humano o processo 6, de 11, lavagem 16, 18, PapilloCheck 31, 33, 35, são 39, necessárias 40, 42, 43, três 44/55, Caixas de 45, lavagem 51, 52, ocheck 53, 56,. 58, 59, 66, 68, 5 Necessário 70, 73, apenas 82 em na amostras confi guração cervicais manual do PCR. Na confi guração automática da PCR, deve-se usar placas PCR. REF Para uso em diagnóstico in vitro somente por profissionais de laboratório Revisão: BQ Março 2016 Greiner Bio-One GmbH Maybachstr Frickenhausen Alemanha Telefone: +49 (0) Fax +49 (0) info@de.gbo.com 7

8 3. TRANSPORTE E ARMAZENAMENTO O envio do kit de teste PapilloCheck é feito à temperatura ambiente. No entanto, o equipamento tem de ser armazenado imediatamente após a recepção a 4-8 C e deve ser protegido da luz. Sendo conservado corretamente, o kit de teste PapilloCheck e os seus componentes podem ser utilizados até a data de validade indicada. Além disso, nessas condições, a vida útil não diverge do HPV DNA-Chip prazo de validade após a primeira abertura do equipamento e dos seus componentes. 4. INSTRUÇÕES DE SEGURANÇA O kit de teste PapilloCheck é apenas para uso de laboratório, não para medicamento, uso doméstico ou outros propósitos. O produto é destinado apenas para usuários profi ssionais, como técnicos e médicos com treinamento em técnicas de biologia molecular. Sempre use um jaleco, luvas descartáveis e óculos de proteção adequados e siga as instruções de segurança fornecidas neste capítulo e no capítulo 7.3. Informações regulamentares: Em conformidade com o regulamento CE n.º 1272/2008, as embalagens internas devem ser etiquetadas apenas com o(s) símbolo(s) e o identifi cador do produto. Os seguintes componentes do kit de teste PapilloCheck contêm substâncias nocivas ou perigosas. IVD Fabricado na Áustria 8 C 4 C Quantidade de Componentes do kit Conteúdo perigoso toxicidade aguda - PapilloCheck oral (categoria 4), PapilloCheck Tampão de Hibridação, guanidina solução de tiocianato, %, CAS Nº PERIGO toxicidade crônica Instruções para uso Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, Informações 51, 52, de 53, perigo 56, suplementares 58, 59, 66, (EU): 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais Tampão B PapilloCheck, solução dodecilo sulfato de sódio, %, CAS Nº REF Classificação em conformidade com o regulamento (EC) No 1272/2008 toxicidade aguda, inalação (categoria 4), em ambiente aquático (categoria 3) corrosividade cutânea (categoria 1c) irritação cutânea (categoria 2), lesões oculares graves Pictograma GHS e palavra sinal PERIGO Para uso em (categoria diagnóstico 1) in vitro somente por profissionais de laboratório Advertências de perigo e prevenção H302 H332 H314 H412 P273 P280 P305+ P351+P338 EUH032 H315 H318 P280 P305+ P351+P338 Nocivo se ingerido. Nocivo se inalado. Provoca graves queimaduras na pele e lesões oculares. Nocivo para a vida aquática com efeitos duradouros. P273 Evitar a libertação para o ambiente. P280 Usar luvas de proteção/vestuário de proteção/proteção ocular/proteção facial. SE ENTRAR EM CONTATO COM OS OLHOS: Lavar cuidadosamente com água durante vários minutos. No caso de uso de lentes de contato, remova-as, se for fácil. Continue enxaguando. Contate um CENTRO DE INFORMAÇÃO ANTIVENENOS ou um médico Em contato com ácidos libera gases muito tóxicos. Provoca irritação cutânea. Provoca lesões oculares graves. Usar luvas de proteção/proteção ocular/proteção facial SE ENTRAR EM CONTATO COM OS OLHOS: Lavar cuidadosamente com água durante vários minutos. No caso de uso de lentes de contato, remova-as, se for fácil. Continue enxaguando. Revisão: BQ Março 2016 Greiner Bio-One GmbH A versão atual Maybachstr. dos dados 2 de segurança Frickenhausen desse Alemanha produto pode ser baixada no site da Greiner Bio-One: Telefone: (0) Fax +49 (0) info@de.gbo.com 8

9 5. DESCARTE DE RESÍDUOS Após a lavagem e secagem do chip PapilloCheck as soluções de lavagem I, II e III podem ser descartadas sem quaisquer precauções especiais. Descarte o chip PapilloCheck utilizado, os componentes não utilizados do kit e a mistura de hibridação não utilizada com os resíduos químicos do laboratório. Observe todos os regulamentos nacionais, estatais e locais relativos ao descarte. HPV DNA-Chip IVD Fabricado na Áustria 8 C 4 C PapilloCheck Instruções para uso Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais REF Para uso em diagnóstico in vitro somente por profissionais de laboratório Revisão: BQ Março 2016 Greiner Bio-One GmbH Maybachstr Frickenhausen Alemanha Telefone: +49 (0) Fax +49 (0) info@de.gbo.com 9

10 6. INTRODUÇÃO A infeção persistente com um vírus do papiloma humano cancerígeno (HPV) verifi ca-se virtualmente em todos os casos de câncer cervical o segundo câncer mais comum nas mulheres a nível mundial 1. Até a presente data, identifi caram-se mais de 100 tipos de HPV, dos quais cerca de 40 tipos são transmitidos sexualmente e infetam a mucosa genital. Os tipos de HPV cervical estão HPV DNA-Chip classifi cados em um grupo de alto risco (HPV de alto risco, HPVar) e de baixo risco (HPV de baixo risco, HPVbr). Enquanto os tipos de HPV de alto risco estão associados a um aumento do risco de desenvolver câncer cervical, os tipos de HPV de baixo risco causam sobretudo verrugas genitais benignas 2. Contudo, mesmo dentro do grupo de alto risco, o risco relativo para o desenvolvimento de câncer ou de lesões intraepiteliais cervicais (CIN) depende do tipo 3. Por volta de 70% de todos os casos de câncer cervical estão ligados a uma infecção persistente com HPV 16 ou 18. Os tipos de baixo risco mais prevalentes são HPV 6 e 11. Baseado na quase absoluta ligação etiológica entre HPV cancerígeno e câncer cervical, o teste para HPVar está sendo agora considerado como exame primário de câncer cervical Utilização prevista O PapilloCheck é um equipamento para diagnóstico destinado a ser utilizado para a detecção qualitativa e a genotipagem de 24 tipos do papilomavírus humano nas preparações de DNA provenientes de esfregaços cervicais humanos. O equipamento deve ser utilizado apenas por pessoal habilitado. IVD Fabricado na Áustria 8 C 4 C PapilloCheck cumpre os requisitos da Diretriz 98/79/CE, relativa aos dispositivos médicos para diagnóstico in vitro, e, portanto, exibe a marca CE de conformidade. Qualquer resultado de diagnóstico gerado, usando o PapilloCheck deve ser interpretado em conjunto com outros resultados clínicos ou laboratoriais. PapilloCheck É recomendado que o kit de teste PapilloCheck seja usado junto com o CheckExtractor na confi guração automática da PCR. Ele é designado para processar remessas de 48 ou 96 amostras. NÃO é destinado para o processamento de remessas menores do que 48 amostras. Instruções para uso 6.2 Tipos de HPV detectáveis com PapilloCheck O PapilloCheck permite a identifi cação de 18 tipos de papilomavírus humano (HPV) de alto risco ( ) e 6 de baixo risco ( ) (Tabela 1). Tabela 1: Tipos de HPV detectáveis com PapilloCheck HPV 16 HPV 45 HPV 59 HPV 6 Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma HPV humano 18 6, 11, 16, HPV 18, 51 31, 33, 35, HPV 39, 6640, 42, 43, 44/55, HPV 11 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, HPV 70, 31 73, 82 em amostras HPV 52 cervicais HPV 68 HPV 40 HPV 33 REF HPV 53 HPV 70 HPV 42 HPV 35 HPV 56 HPV 73 HPV 43 Para uso em diagnóstico in vitro HPV 39 HPV 58 HPV 82 somente por profissionais de laboratório HPV 44 / HPV 55* * O PapilloCheck não permite a diferenciação entre o VPH 44 e o VPH 55. Revisão: BQ Março Walboomers, J. et al (1999). Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. J Pathol. 189(1): Burd EM. Human papillomavirus and cervical cancer. Clin Microbiol Rev. 2003;16: Bosch F.X. et al. (2008). Epidemiology and natural history of human papillomavirus infections and type-specifi c Greiner Bio-One GmbH implications in cervical neoplasia. Vaccine. 26 Suppl 10:K Meijer, C.J. et al. (2009). Maybachstr. Guidelines for human Frickenhausen papillomavirus Alemanha DNA test requirements for primary cervical cancer screening in women Telefone: 30 years and +49 older. (0) 7022 Int J Cancer. Fax 124(3): (0) info@de.gbo.com 10

11 6.3 Princípio de teste O PapilloCheck é um kit de teste baseado em microarray para a detecção e genotipagem de um fragmento do gene E1 do genoma papilomavírus humano (HPV). O procedimento de teste é resumido na Figura 1. HPV DNA-Chip Antes da análise do PapilloCheck, o DNA tem de ser extraído de uma amostra de esfregaço cervical. A coleta de amostras e a extração de DNA não fazem parte do kit de teste PapilloCheck. Os produtos dedicados para a coleta de amostras (PapilloCheck Collection Kit) e Extração de DNA (Kit de Extração de DNA ocheck ) também estão disponíveis na Greiner Bio-One e têm de ser adquiridos à parte (consulte informações sobre encomendas o Capítulo 2). Após a extração do DNA genômico viral e humano de uma amostra cervical, um fragmento 350 bp do gene viral E1 é amplifi cado pela reação em cadeia da polimerase (PCR) na presença de um conjunto de iniciadores específi cos do HPV. Na mesma reação, um fragmento do gene humano de cópia simples ADAT1 (adenosina deaminase 1 específi ca de tarn humano) é amplifi cado para monitorar a presença de material de amostra humano na amostra cervical (controle da amostra) e um modelo de controle interno presente no PapilloCheck PCR MasterMix é amplifi cado para monitorar o desempenho da PCR (controle da PCR). Além disso, o PapilloCheck PCR MasterMix contém dutp. Assim, a potencial contaminação cruzada de reações de PCR anteriores pode ser eliminada através da utilização do tratamento com Uracilo-N-Glicosilase (UNG) (consulte o capítulo 8.2.2). IVD Fabricado na Áustria 8 C 4 C Os produtos para PCR são então hibridados para sondas específi cas de DNA e controles no chip associados à superfície do chip PapilloCheck. Cada chip contém 12 microarrays de DNA, que permitem a análise simultânea de 12 amostras cervicais. Durante a hibridação, o DNA ligado é etiquetado fl uorescentemente e o DNA não ligado é removido nos passos de lavagem subsequentes. Monitora-se a efi cácia da hibridação (controle da hibridação). PapilloCheck Finalmente, o chip PapilloCheck é automaticamente escaneado, analisado e avaliado utilizando o CheckScanner TM e o Software CheckReport TM, respetivamente (consulte as informações sobre encomenda no Capítulo 2). O CheckScanner Instruções para uso TM é um scanner a laser bicolor (comprimentos de ondas de excitação de 532 nm e 635 nm), que permite a detecção do sinal fl uorescente gerado pela presença dos produtos de amplifi cação específi cos do HPV bem como dos controles (consulte o capítulo 6.4.2). O Software CheckReport TM permite a visualização, análise e avaliação dos resultados e mostra automaticamente os valores correspondentes tanto dos tipos de HPV detectados como dos controles num relatório detalhado. O relatório indica claramente a presença ou ausência de um ou mais dos 24 tipos de HPV detectáveis e os controles abrangentes no chip tornam a análise altamente confi ável. Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais REF Para uso em diagnóstico in vitro somente por profissionais de laboratório Revisão: BQ Março 2016 Greiner Bio-One GmbH Maybachstr Frickenhausen Alemanha Telefone: +49 (0) Fax +49 (0) info@de.gbo.com 11

12 1. Reação da PCR HPV DNA-Chip 2. Hibridação IVD Fabricado na Áustria 8 C 4 C 3. Lavagem e secagem PapilloCheck Instruções para uso ou 4. Escaneamento e análise Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais REF Para uso em diagnóstico in vitro Revisão: BQ Figura somente 1: PapilloCheck por profissionais de laboratório Março 2016 procedimento de teste 1. Reação de PCR: Após a extração de DNA, um fragmento 350 bp do gene viral E1 e os fragmentos de dois objetos de controle são amplifi cados através de PCR. Os produtos de amplifi cação são então hibridados para sondas de DNA complementares no chip. 2. Hibridação: Cada tipo de HPV é detectado por uma sonda de DNA específi ca. Durante a hibridação, introduz-se a etiquetagem fl uorescente. 3. Lavagem e secagem: Greiner O DNA Bio-One não ligado GmbH é removido nos passos de lavagem subsequentes. 4. Escaneamento e análise: O chip PapilloCheck Maybachstr Frickenhausen é escaneado, analisado e avaliado utilizando o CheckScanner Alemanha TM e o Software CheckReport TM. É criado um relatório que indica claramente a presença ou ausência de um ou mais dos 24 tipos de HPV detectáveis. Telefone: +49 (0) Fax +49 (0) info@de.gbo.com 12

13 6.4 Design do chip de DNA PapilloCheck Disposição do chip PapilloCheck Cada chip PapilloCheck contém 12 microarrays designados como poço A1 - B6. Cada microarray PapilloCheck é composto por 28 sondas diferentes e está rodeado por uma borda elevada. Cada HPV DNA-Chip sonda é pintada em cinco réplicas. A disposição do microarray PapilloCheck é ilustrada na Figura 2 e os controles no chip são explicados no Capítulo controle da orientação controle da PCR a) canal vermelho (635 nm) HPV 6 HPV 11 HPV 16 HPV 18 HPV 31 HPV 33 HPV 35 HPV 39 HPV 40 HPV 42 HPV 43 HPV 44/55 HPV 45 HPV 51 HPV 52 HPV 53 HPV 56 HPV 58 HPV 59 HPV 66 HPV 68 HPV 70 HPV 73 HPV 82 b) controle da hibridação controle da amostra IVD Fabricado na Áustria 8 C 4 C PapilloCheck canal verde (532 nm) Instruções para uso c) controle da orientação HPV 6 HPV 11 HPV 16 HPV 18 HPV 31 HPV 33 HPV 35 HPV 39 HPV 40 HPV 42 HPV 43 HPV 44/55 controle da hibridação controle da PCR HPV 45 HPV 51 HPV 52 HPV 53 HPV 56 HPV 58 HPV 59 HPV 66 HPV 68 HPV 70 HPV 73 HPV 82 controle da amostra Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, Figura 70, 2: Design 73, 82 do em chip amostras de DNA PapilloCheck cervicais a) Desenho esquemático do chip PapilloCheck. b) e c) Imagens exibidas pelo Software CheckReport TM para os dois comprimentos REF 465 de 088 onda de excitação diferentes usados para escanear (b) canal vermelho: 635 nm; c) canal verde: 532 nm) e desenhos esquemáticos do microarray PapilloCheck. Indicam-se sondas específi cas para o tipo do HPV e os controles no chip. Para uso em diagnóstico in vitro somente por profissionais de laboratório Revisão: BQ Março 2016 Greiner Bio-One GmbH Maybachstr Frickenhausen Alemanha Telefone: +49 (0) Fax +49 (0) info@de.gbo.com 13

14 6.4.2 Controles no chip O design do chip de DNA PapilloCheck inclui controles abrangentes no chip. Vários sistemas de controle monitoram todos os passos mais importantes tanto do teste como do processamento do chip, incluindo a qualidade das amostras e a extração de DNA (controle da amostra), a qualidade de reação da PCR (controle da PCR), a efi cácia da hibridação (controle da hibridação), bem como a homogeneidade da coloração e a qualidade de impressão (controle da orientação HPV e DNA-Chip controle da impressão). Além da presença ou ausência de tipos de HPV, o Software CheckReport mostra automaticamente os valores correspondentes tanto dos controles como dos tipos de HPV detectados num relatório detalhado. Para a leitura dos diferentes controles, utilizam-se os dois comprimentos de onda de excitação do CheckScanner. Para o controle do desempenho do teste (controle da amostra e da PCR), utiliza-se o canal vermelho (comprimento de onda de excitação de 635 nm), enquanto a qualidade da hibridação e do chip (controle da hibridação, da orientação e da impressão) é avaliada no canal verde (comprimento de onda de excitação de 532 nm). Controle da amostra O PapilloCheck monitora a qualidade da amostra e/ou da extração de DNA amplifi cando um fragmento do gene humano de cópia simples ADAT1 (adenosina deaminase 1 específi ca de tarn humano). Se DNA humano estiver presente numa quantidade adequada no DNA extraído da amostra cervical, é gerado um sinal fl uorescente nas colorações de controle da amostra. Se não ocorrer amplifi cação de ADAT1, ou se for insufi ciente, o Software CheckReport indica que o controle da amostra falhou e tem de se repetir a análise devido à quantidade insufi ciente de células na amostra cervical e/ou desempenho insufi ciente na extração (consulte o Capítulo 9). IVD Fabricado na Áustria 8 C 4 C Controle da PCR O PapilloCheck também monitora a qualidade de reação da PCR. A amplifi cação de um modelo de controle interno presente no PapilloCheck PCR MasterMix gera um sinal nas colorações de controle da PCR no chip PapilloCheck. A qualidade da reação de amplifi cação também é automaticamente avaliada pelo Software CheckReport. Se o desempenho da PCR se situar abaixo de um limite predefi nido, o Software CheckReport indica que o controle da PCR falhou e tem de se repetir a análise (consulte o Capítulo 9). Instruções para uso Se a quantidade de DNA do HPV na amostra for muito elevada, o sinal fl uorescente das colorações de controle da PCR pode ser baixo ou mesmo não estar presente devido à concorrência durante a reação da PCR. Neste caso, o sinal fl uorescente para, pelo menos, uma sonda de DNA específi ca, tem de exceder um limite predefi nido para o teste ser considerado válido. Controle da hibridação O PapilloCheck monitora a efi cácia da hibridação através da utilização de uma sonda fl uorescente etiquetada Equipamento no Tampão para de diagnóstico Hibridação PapilloCheck para a genotipagem, que hibrida dos tipos para sequências do vírus do específi papiloma cas de DNA no humano chip PapilloCheck 6, 11, 16, 18,. 31, Uma 33, efi 35, cácia 39, de 40, hibridação 42, 43, 44/55, adequada 45, 51, resulta 52, 53, em 56, sinais 58, 59, fl uorescentes 66, 68, em cada 70, coloração 73, 82 em de amostras array. Os cervicais resultados de cinco colorações de controle da hibridação no chip PapilloCheck também são avaliados pelo Software CheckReport TM. REF Controle da orientação e da impressão Para uso em diagnóstico in vitro Revisão: BQ As colorações de controle da orientação do chip PapilloCheck geram sinais fl uorescentes somente por profissionais de laboratório Março 2016 independentemente da efi cácia do processo de hibridação. Estas colorações são utilizadas no Software CheckReport TM como pontos de orientação para uma detecção correta da coloração, o que é um pré-requisito para a análise correta dos sinais. Além disso, a qualidade do processo de impressão é controlada através da presença de um sinal fl uorescente em cada coloração do chip (controle da impressão). Greiner Bio-One GmbH Maybachstr Frickenhausen Alemanha Telefone: +49 (0) Fax +49 (0) info@de.gbo.com 14

15 7. INSTRUÇÕES PARA O FLUXO DE TRABALHO DO PAPILLOCHECK 7.1 Instruções gerais Ao implementar técnicas atuais mais avançadas de biologia molecular em um HPV laboratório, DNA-Chipas instruções a seguir devem ser consideradas para garantir o máximo de segurança para a equipe do laboratório e para resultados de alta qualidade. A execução de técnicas de biologia molecular tais como extração de DNA, amplifi cação e detecção de produtos de amplifi cação exige pessoal qualifi cado. Além disso, um fl uxo de trabalho claro e bem estruturado é obrigatório para impedir resultados equivocados, tais como os que ocorrem devido à degradação do DNA ou contaminação dos produtos de amplifi cação. Para garantir isso, é necessário separar as áreas de extração, amplifi cação e detecção conforme descrito no capítulo 7.2. Cada área deve ser equipada com equipamentos, consumíveis, jalecos e luvas próprios. Nunca transfi ra os jalecos, luvas ou equipamentos de uma área específi ca para outra. 7.2 Separação das salas A Figura 3 mostra um exemplo de como um laboratório pode ser separado em três seções distintas. IVD Fabricado na Áustria 8 C 4 C PapilloCheck Sala 1 Sala 2 Sala 3 Instruções para uso Figura 3: Separação de salas de laboratório Uma sala é destinada para a extração de DNA com o CheckExtractor e o processamento da respectiva eluição e das placas de PCR. A confi guração da PCR MasterMix deve ser conduzida na sala 2 (preferencialmente sob uma capela de PCR). Na sala 3 é realizada a hibridação, lavagem, Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma secagem e análise do chip processado PapilloCheck humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, usando o CheckScanner e o Software do 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, CheckReport é conduzido. 70, 73, 82 em amostras cervicais Cada sala é usada exclusivamente para a aplicação ou técnica indicada para impedir a contaminação da amostra. O uso de cores pode ser vantajoso para evitar a troca acidental de equipamentos e REF consumíveis entre as áreas. Para um exemplo mais detalhado de separação de sala usando extração manual Para uso em diagnóstico in vitro Revisão: de DNA BQ e procedimentos de confi guração de PCR, veja as respetivas Instruções de Uso do kit de somente por profissionais de laboratório Março teste 2016 PapilloCheck (REF ) e Kit de Extração de DNA ocheck (REF ). Tanto os equipamentos como os consumíveis não devem ser trocados entre as diferentes salas de laboratório e espaços. Portanto, as duplicações de equipamento e consumíveis são uma necessidade e devem ter Greiner sido consideradas Bio-One ao GmbH equipar o laboratório. Maybachstr Frickenhausen Alemanha Telefone: +49 (0) Fax +49 (0) info@de.gbo.com 15

16 7.3 Avisos e precauções Prevenção de contaminação Jalecos devem ser usados durante o procedimento e conjuntos diferentes de jalecos são necessários para cada sala de laboratório. HPV DNA-Chip As luvas têm de ser usadas durante cada passo da análise e têm de ser mudadas com frequência, especialmente durante a extração de DNA. O local de trabalho tem de ser descontaminado com um produto de limpeza apropriado. Nunca toque no interior da tampa de um tubo de reação. Para evitar contaminação cruzada, abra somente um tubo de cada vez. Pontas com fi ltro adequadas para micropipetas com proteção contra aerossóis (sem DNase, RNase e DNA humano) devem ser utilizadas. As ponteiras da pipeta devem ser sempre trocadas entre as transferências de líquido Instruções de manuseamento de chips para DNA IVD Fabricado na Áustria 8 C 4 C Os chips para DNA devem ser utilizados em um ambiente sem poeira. Deve evitar-se a deposição de poeiras e de outras partículas na superfície do chip. Não toque na zona de hibridação na superfície do chip. Apenas o lado etiquetado do chip se destina a hibridação. Não utilize canetas marcadoras para a identifi cação de chips de DNA, pois causam fl uorescência não específi ca no chip. Os arrays de DNA só podem ser utilizados uma vez. Os chips hibridados não podem ser reutilizados. Guarde os chips não utilizados na caixa original dentro do saco com fecho contendo o dessecante. PapilloCheck Instruções para uso Precauções gerais Este equipamento destina-se exclusivamente a diagnóstico in vitro e deve ser utilizado apenas por pessoal treinado na prática de laboratório de diagnóstico in vitro. Após a chegada do produto, verifi que se os componentes do kit estão danifi cados. Caso um dos componentes esteja danifi cado (por exemplo, os recipientes do tampão), entre em contato com o seu distribuidor Greiner Bio-One local. Não use componentes danifi cados do kit, pois os mesmos podem levar a um baixo desempenho do kit. Não Equipamento utilize o kit de para teste diagnóstico PapilloCheck para após a genotipagem o prazo de validade. dos tipos do vírus do papiloma humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, Não use reagentes vencidos. 70, 73, 82 em amostras cervicais Não misture reagentes de lotes diferentes. Use REF somente reagentes/equipamentos fornecidos com o kit e aqueles recomendados pelo fabricante. Deve-se Para uso fazer em uma diagnóstico calibração/manutenção in vitro regular nos equipamentos de laboratório, Revisão: como BQ micropipetas somente por e banho-maria. profissionais de laboratório Março 2016 A pipetagem de pequenas quantidades de líquido com a micropipeta pode ser um desafi o. Portanto, tome cuidado e faça a pipetagem da forma mais precisa possível. Para evitar contaminação microbiana dos reagentes, tome cuidado ao remover as alíquotas dos tubos do reagente. Greiner Bio-One GmbH Todos os passos Maybachstr. da centrifugação devem Frickenhausen ser conduzidos Alemanha à temperatura ambiente (18-25 C). Telefone: +49 (0) Fax +49 (0) info@de.gbo.com 16

17 7.3.4 Segurança no trabalho Cuidado ao manusear amostras biológicas contendo materiais humanos potencialmente infecciosos. Manuseie e descarte todas as amostras biológicas como se fossem capazes de transmitir agentes infecciosos. Nunca faça a pipetagem de soluções oralmente. HPV DNA-Chip Não coma, beba, fume ou aplique produtos cosméticos nas áreas de trabalho. Evite o contacto direto com as amostras biológicas, bem como salpicar ou pulverizar nas amostras. Sempre use o jaleco, as luvas e os óculos de proteção enquanto estiver trabalhando com amostras humanas. Lave as mãos cuidadosamente após manusear amostras e reagentes. IVD Fabricado na Áustria 8 C 4 C PapilloCheck Instruções para uso Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais REF Para uso em diagnóstico in vitro somente por profissionais de laboratório Revisão: BQ Março 2016 Greiner Bio-One GmbH Maybachstr Frickenhausen Alemanha Telefone: +49 (0) Fax +49 (0) info@de.gbo.com 17

18 8. PROCEDIMENTO PAPILLOCHECK O capítulo seguinte descreve detalhadamente os diferentes passos de trabalho que finalmente levam à produção de um relatório detalhado, indicando claramente a presença ou ausência de um ou mais dos 24 tipos de HPV detectáveis em cada amostra cervical analisada. A Figura 4 mostra uma visão geral dos diferentes passos necessários. Também indica o subcapítulo correspondente que descreve o passo de teste específico. Os passos têm de ser executados na ordem descrita neste capítulo. Cada passo específico com intervenção é indicado por uma seta azul. A coleta de amostras, a extração de DNA e a análise com o Software CheckReport TM não fazem parte do kit de teste PapilloCheck. Portanto, a descrição desses passos é abreviada neste capítulo. Para mais informações, consulte as Instruções de Uso correspondentes, por exemplo, do PapilloCheck Collection Kit, do Kit de Extração de DNA ocheck, do Kit de Extração de DNA ocheck - CheckExtractor e do Software CheckReport TM. 8.1 Coleta de amostras e extração de DNA Coleta de amostras A coleta de amostras não faz parte do kit de teste PapilloCheck. O equipamento de ensaio dedicado a amostras cervicais (PapilloCheck Collection Kit) também está disponível na Greiner Bio-One (consulte as informações sobre encomendas no Capítulo 2). DNA preparado com Greiner Bio-One CheckExtractor, um sistema automatizado de extração de DNA e configuração de PCR, usando o Kit de Extração de DNA ocheck - CheckExtractor (Greiner Bio-One, ) é adequado para a análise PapilloCheck. Para essa extração automática de DNA, o esfregaço cervical humano deve ter sido coletado com um dos seguintes sistemas ou meios de coleta: PapilloCheck Collection Kit (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemanha) PreservCyt (Hologic, Bedford, MA, EUA) PapilloCheck foi validado utilizando o DNA preparado com o Kit de Extração de DNA ocheck (Greiner Bio-One, ) proveniente de esfregaços cervicais humanos coletados através de um dos seguintes sistemas ou meios de coleta: PapilloCheck Collection Kit (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemanha) PreservCyt (Hologic, Bedford, MA, EUA) Surepath (BD, Franklin Lakes, NJ, EUA) STM TM (Qiagen, Venlo, Países Baixos) Easyfix (Labonord, Templemars, França) Cyt-All (Alphapath, Mauguio, França) Para mais informações sobre os meios de transporte adequados ou os sistemas de extração de DNA, contate o seu distribuidor local Greiner Bio-One ou consulte o site da Greiner Bio-One: 18

19 Capítulo Extração de DNA ocheck Kit de Extração de DNA CheckExtractor OU ocheck Kit de Extração de DNA Capítulo 8.2 PCR Capítulo Hibridação Capítulo Lavagem e secagem ou Capítulo 8.4 Escaneamento e avaliação Figura 4: Visão geral do passo-a-passo do PapilloCheck 19

20 8.1.2 Extração de DNA A extração de DNA não faz parte do kit de teste PapilloCheck. Extração de DNA anterior à análise PapilloCheck deve ser feita ou automaticamente usando o Greiner Bio-One CheckExtractor junto com o Kit de Extração de DNA ocheck - CheckExtractor, ou manualmente, usando o Kit de Extração de DNA Greiner Bio-One ocheck (consulte informações de encomenda no Capítulo 2). Recomenda-se usar o kit de teste PapilloCheck junto com o Greiner Bio-One CheckExtractor e o respetivo Kit de Extração de DNA de acordo com a designação para processar remessas de 48 ou 96 amostras. Ele não é destinado para o processamento de remessas menores do que 48 amostras. Amostras cervicais coletadas com diferentes sistemas ou meios de coleta devem ser tratadas de modo diferente depois da extração de DNA. Adicionalmente, existem diferenças na preparação de amostras usando extração manual ou automática de DNA. Para uma descrição detalhada dos procedimentos de preparação de amostras e extração de DNA, por favor siga corretamente as Instruções de Uso do Kit de Extração de DNA ocheck - CheckExtractor ou Kit de Extração de DNA ocheck, respetivamente. 20

21 8.2 Reação em cadeia da polimerase (PCR) A PCR é um método muito sensível que pode detectar quantidades extremamente pequenas de DNA. Devem tomar-se precauções especiais para evitar a contaminação da reação (consulte o Capítulo 7). A Polimerase HotStarTaq e a Uracilo-N-Glicosilase são necessárias mas não são fornecidas com o kit de teste PapilloCheck e devem ser adquiridas separadamente (consulte o Capítulo 2). O kit de teste PapilloCheck foi validado utilizando Polimerase HotStarTaq da Qiagen e Uracilo-N- Glicosilase da Fermentas (consulte as informações sobre encomendas no Capítulo 2). A utilização destas enzimas é obrigatória para se obter o desempenho estabelecido Preparação do termociclador O kit de teste PapilloCheck foi validado com os termocicladores seguintes: GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems), Termociclador Veriti de 96 Poços (Applied Biosystems), peqstar 96X Universal (PEQLAB Biotechnologies GmbH). É imprescindível utilizar um dos termocicladores mencionados acima para se obter o desempenho estabelecido. O programa do termociclador de PCR PapilloCheck encontra-se resumido na Tabela 2. Tabela 2: Programa do termociclador de PCR PapilloCheck Tempo Temp. C Nº de ciclos 20 min 37 C 1 15 min 95 C 1 30 s 25 s 45 s 30 s 45 s 95 C 55 C 72 C 95 C 72 C Pausa 10 C Além disso, têm de se definir os parâmetros de execução seguintes para cada termociclador. Para uma descrição sobre como definir estes parâmetros, consulte as Instruções de Uso do respectivo termociclador. GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems) Defina o volume de reação para 26 µl, a velocidade de rampa para 9600 e utilize uma temperatura da tampa de 103 C. Termociclador Veriti de 96 Poços (Applied Biosystems) Utilize a ferramenta Método de Conversão do Termociclador Veriti 96-Poços para entrar no programa PCR PapilloCheck e selecione 9600 Emulation Mode. Defina o volume de reação para 26 µl e a temperatura da tampa para 103 C. peqstar 96X Universal (PEQLAB Biotechnologies GmbH) Utilize o programa PCR pré-programado PapilloCheck PapilloCheck.js fornecido com o termociclador. Normalmente o programa pode ser aberto usando o seguinte caminho: local/scripts/ GreinerBioOne/PapilloCheck.js. 21

22 8.2.2 Tratamento de Uracilo-N-Glicosilase (UNG) 5 O PapilloCheck PCR MasterMix contém dutp que se inclui nos produtos de amplificação durante a PCR PapilloCheck, tornando os produtos da PCR suscetíveis à degradação pela UNG. A UNG divide o produto da PCR em locais onde se incluiu um resíduo de desoxiuridilato. Os produtos divididos da PCR não serão amplificados numa reação posterior. Assim, pode se utilizar um tratamento de UNG para eliminar a potencial contaminação cruzada de reações de PCR anteriores 6. Dilua a Uracilo-N-Glicosilase 1:200 em água reagente de PCR. Utilize uma diluição fresca de UNG para cada preparação de reação de PCR PapilloCheck (consulte o Capítulo 8.2.3). Não reutilize a UNG diluída. Misture a diluição de UNG cuidadosamente com o agitador vórtex durante 2 segundos, e depois reduzindo a rotação, ou através de pipetagem várias vezes. A concentração original da Uracilo-N-Glicosilase é de 1 U/µl. Portanto, a concentração da diluição é 0,005 U/µl. Validou-se o kit de teste PapilloCheck utilizando a Uracilo-N-Glicosilase da Fermentas (consulte o Capítulo 2). A utilização desta enzima é obrigatória para se obter o desempenho estabelecido. Adicione1 µl dessa diluição a cada reação de PCR PapilloCheck (consulte o Capítulo 8.2.3, Tabela 3). Esta quantidade é suficiente para eliminar a contaminação cruzada de PCR. Tenha cuidado para não utilizar uma solução de UNG mais concentrada, pois isso poderia ter efeito adverso sobre o desempenho da PCR, resultando numa sensibilidade reduzida do PapilloCheck. Geralmente, para o tratamento da UNG, a mistura de reação de PCR é incubada durante 20 minutos a 37 C. Posteriormente, a UNG é inativada por um passo adicional de incubação durante 15 minutos a 95 C. Esses dois passos já estão incluídos na PCR PapilloCheck e correspondem aos dois primeiros passos do programa do termociclador (consulte a Tabela 2). Durante o segundo passo (15 minutos a 95 C) ocorre tanto a inativação da Uracilo-N-Glicosilase como a ativação da Polimerase HotStarTaq. O sistema UNG incorporado da PCR PapilloCheck eliminará apenas a contaminação cruzada com produtos da PCR provenientes de reações anteriores da PCR. Não se consegue eliminar outra contaminação, por exemplo que ocorra durante a preparação da amostra, extração de DNA ou adição de modelo de PCR. Portanto, ainda é necessário cumprir as instruções e precauções especiais para evitar a contaminação descrita no Capítulo 7. 5 A aquisição do PapilloCheck vem acompanhada de uma licença limitada com os Números de Patentes Norteamericanas , , , e , e as patentes estrangeiras correspondentes. 6 Longo, M.C., et al., Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions, Gene, 93, ,

23 8.2.3 Preparação da reação de PCR Procedimento de preparação automática de PCR usando o CheckExtractor Com exceção da Polimerase HotStarTaq e da Uracilo-N-Glicosilase, o PapilloCheck PCR MasterMix já contém todos os componentes necessários para executar a reação de PCR (tampão de PCR, MgCl 2, dntps, iniciadores, modelo de controle da PCR). Baseado nisso, o procedimento de preparação da PCR PapilloCheck pode ser dividido em duas partes: a preparação do mastermix final, adicionando enzimas ao PapilloCheck PCR MasterMix, e a preparação da reação de PCR final, adicionando o DNA extraído ao modelo. Enquanto a primeira parte é manual, a segunda pode ser feita automaticamente utilizando o Greiner Bio-One CheckExtractor. Validou-se o kit de teste PapilloCheck utilizando a Polimerase HotStarTaq da Qiagen (consulte o Capítulo 2). A utilização desta enzima é obrigatória para se obter o desempenho estabelecido. A preparação da mistura de reação é executada da melhor forma num ambiente protegido, por exemplo, com uma estação de PCR, para evitar a contaminação da reação. Para a preparação, deve ser utilizado o frasco com código de barras para preparação mastermix. Esse frasco pode ser encontrado junto com os frascos do PapilloCheck PCR MasterMix e do Tampão de hibridação PapilloCheck com as caixas de papelão menores incluindo material para 48 análises cada. Para assegurar a possibilidade de uso do mastermix final para a configuração de PCR com o CheckExtractor é obrigatório o uso de frasco com código de barras já que esse código é usado para identificação do reagente enquanto o CheckExtractor funciona. A quantidade necessária de mastermix final depende do número de amostras a serem analisadas e consequentemente do número de reações de PCR a serem preparadas. Para uma preparação de PCR de 48 amostras, é necessário um frasco com código de barras cheio; para uma preparação com 96 amostras, dois frascos são necessários. Se menos de 48 ou 96 amostras forem analisadas, por exemplo, 43 ou 87, a quantidade de mastermix necessária que deve ser preparada é para reações de 48 ou 96. A quantidade final de mastermix necessário pode ser calculada pelo Software CheckExtractor. Consequentemente, por favor siga as instruções do software enquanto estiver equipando o transportador de tubo. Por favor, saiba que o CheckExtractor não vai começar a preparação de PCR se for usado menos mastermix final do que o Software CheckExtractor calculou. Prepare o mastermix final (que consiste em PapilloCheck PCR MasterMix, Polimerase HotStarTaq e Uracilo-N-Glicosilase) como descrito na Tabela 3. Tabela 3: Preparação do mastermix final Preparação de um frasco suficiente para até 48 reações de PCR PapilloCheck PCR MasterMix 1148,4 µl Polimerase HotStarTaq (5 U/µl) 11,6 µl Uracilo-N-Glicosilase (Diluição de 1:200, U/µl) 58 µl Volume total do mastermix final 1218 µl 23

24 Na tela inicial, selecione PCR para começar um método de preparação de PCR. Vai aparecer uma tela pedindo informações básicas. Complete as informações: Em 1) Kits, por favor, escolha PapilloCheck MasterMix no menu suspenso e coloque seu ID de usuário em 2) Used ID. Em 3) Amostras, pressione o botão Importar para escolher a placa de eluição a ser processada. Certifique-se de selecionar o arquivo certo conferindo o nome do arquivo, o código de barra e a data exata de emissão. Se a placa de eluição já tiver sido usada em uma preparação de PCR, você deve importar o arquivo com a última data de emissão. Depois de importar os dados para uma placa de eluição específica, uma lista de amostras vai aparecer. Por pré-definição, o Software CheckExtractor vai marcar cada amostra, para cada extração de DNA que foi desempenhada com sucesso, como ativa. A preparação de PCR será desempenhada em todas as amostras ativas. Se a preparação tiver que ser desempenhada em menos amostras, as amostras devem ser desativadas pelo usuário. Novamente, os consumíveis necessários, ponteiras conhecidas emastermix final são calculados pelo Software CheckExtractor. Por favor siga as instruções do software enquanto estiver equipando os diferentes transportadores. 24

25 Em 4) Detalhes do Kit, coloque o cursor na caixa em branco para Código de barra. Escaneie o código de barra do kit PapilloCheck a ser usado com o scanner portátil fornecido. O software vai automaticamente preencher a caixa em branco com o número de referência do kit e as outras duas caixas com o número de lote e o prazo de validade do kit. O código de barras do kit PapilloCheck pode ser encontrado no canto superior esquerdo da tampa do kit. Pressione o botão iniciar no canto superior esquerdo da tela para começar a preparação de PCR. Uma tela descrevendo o carregamento de ponteiras vai aparecer. Equipe o transportador de ponteiras com as ponteiras. Certifique-se de usar as posições corretas do transportador. Coloque os transportadores de ponteiras na plataforma de carregamento como mostrado, começando com o trilho 1. Pressione o botão OK. O CheckExtractor vai carregar os transportadores automaticamente. Para se certificar de que o transportador será carregado pelo CheckExtractor, coloque o transportador na plataforma com e empurre cuidadosamente o transportador no trilho direito até perceber uma leve parada mecânica. Nessa posição, o transportador vai ser automaticamente carregado depois de confirmar com "OK". 25

26 O Editor de Ponteiras vai aparecer. Verifique se a configuração de ponteiras mostrada está correta. Ponteiras ainda disponíveis para o procedimento serão mostradas em marrom. Posições de ponteiras vazias serão mostradas em cinzento. Se a configuração de ponteiras for mostrada corretamente, pressione o botão OK. Se a configuração de ponteiras tiver que ser ajustada, procure as Instruções de Uso do CheckExtractor para uma explicação de como se usa o editor. Uma tela descrevendo o carregamento de placas vai aparecer. Equipe o transportador de placas com uma placa vazia com código de barra e a placa de eluição a ser processada. Coloque a placa de PCR na posição 1 no transportador e a placa de eluição na posição 2. Os códigos de barra das duas placas devem ficar voltados para a direita e, portanto, na direção do leitor de códigos de barras. 26

27 Para ter um fluxo de trabalho otimizado e evitar ciclos desnecessários de congelamento e degelo, é recomendando que o método de preparação de PCR aconteça diretamente após o fim de uma extração. Nesse caso, a placa de eluição da extração prévia ainda está na posição 2 e apenas uma placa vazia de PCR deve ser adicionada. Se uma placa mais "velha" de eluição for utilizada no método de preparação de PCR, que tenha sido vedada e armazenada anteriormente, certifique-se de descongelar a placa, centrifuga-la rapidamente em uma centrífuga de placas e remover a vedação antes de colocá-la no transportador de placas (consulte também o capítulo 8.2.4). Coloque o carregador de placas na plataforma de carregamento nos trilhos Pressione o botão OK. O CheckExtractor vai carregar os transportadores automaticamente. Para se certificar de que o transportador será carregado pelo CheckExtractor, coloque o transportador na plataforma e empurre cuidadosamente o transportador no trilho direito até perceber uma leve parada mecânica. Nessa posição, o transportador vai ser automaticamente carregado depois de confirmar com "OK". O código de barra da placa de eluição usada deve caber na placa escolhida antes na tela de definição 3) Amostras Se não, uma mensagem de erro vai aparecer. Uma tela descrevendo o carregamento do mastermix final vai aparecer. Misture o mastermix final preparado cuidadosamente com o agitador de vórtice durante 2 segundos, e depois reduzindo a rotação, ou através de pipetagem várias vezes. Equipe o transportador de tubos com os frascos com código de barra para a preparação de mastermix. Certifique-se de que os adaptadores estão colocados corretamente. 27

28 Para um preparação de PCR de até 48 amostras, coloque um frasco com código de barras cheio com o mastermix final preparado no adaptador, na posição 23 do transportador. Para uma preparação de PCR de até 96 amostras, coloque dois frascos cheios no transportador de tubos. Use adaptadores nas posições 23 e 24 do carregador. Novamente, certifique-se de que os códigos de barra das duas placas fiquem voltados para a direita e, portanto, na direção do leitor de códigos de barras. Se a solução for misturada pelo vórtice e então a tampa inclusa do frasco com código de barra estiver usado, essa tampa deve ser removida antes de colocar o frasco nos adaptadores de tubo. Coloque o transportador de placas na plataforma de carregamento no trilho 19. Pressione o botão OK. O CheckExtractor vai carregar os transportadores automaticamente. Para se certificar de que o transportador será carregado pelo CheckExtractor, coloque o transportador na plataforma com e empurre cuidadosamente o transportador no trilho direito até perceber uma leve parada mecânica. Nessa posição, o transportador vai ser automaticamente carregado depois de confirmar com "OK". O carregamento está completo. O CheckExtractor exibirá o tempo de verificação estimado e solicitará uma confirmação para iniciar a preparação de PCR. Pressione OK para começar a preparação de PCR. 28

29 No final da preparação, pressione OK para começar os procedimentos de descarregamento e a limpeza da plataforma. Depois da confirmação, o CheckExtractor vai automaticamente descarregar todos os transportadores. Por favor, remova-os da plataforma de carregamento. Siga as instruções na ordem correta exibida na tela para descarregar com segurança o CheckExtractor. Tire a placa de eluição do transportador de placas. Manuseie a placa com cuidado para evitar que ela vaze. Para armazenar a placa de eluição para análises ou reanálises futuras, vede a placa de eluição com uma lâmina adesiva (consulte o capítulo 8.2.4) e armazene a -20 C. Tire a placa de PCR com a mistura de reação do transportador de placas. Manuseie a placa com cuidado para evitar que ela vaze. Vede a placa de PCR usando vedação térmica, como descrito no capítulo Transfira a placa vedada para o ciclador de PCR e inicie a reação de PCR utilizando o programa do termociclador descrito no Capítulo (Tabela 2). Após a conclusão da PCR, os produtos de amplificação devem ser utilizados imediatamente para hibridação ou conservados no escuro a -20 C por até uma semana. 29

30 Armazene o transportador de ponteiras completo com as ponteiras de filtro não usadas ainda no mesmo lugar. Descarte os frascos com código de barra do mastermix. Descarte as ponteiras usadas nos resíduos sólidos do laboratório. Limpe todos os transportadores e as ponteiras descartadas com a solução de limpeza recomendada (para maiores informações, consulte as Instruções de Uso do CheckExtractor ). Use o método da luz UV por 30 minutos para auxiliar na descontaminação de DNA do CheckExtractor. Confirme a limpeza completa da plataforma pressionando OK. Assim, o percurso de armazenamento dos arquivos do relatório serão mostrados. Para voltar para a tela inicial do Software, pressione OK. A mesma configuração de amostra da placa de PCR resultante está incluída nos arquivos do relatório. Essa é a base para o processo pós-pcr, incluindo hibridação e lavagem. Esteja consciente de que a disposição pode ser diferente de uma das placas de eluição, já que tanto amostras da extração não funcionam como amostras desativadas são puladas. Isso resulta em poços potencialmente não utilizados nas últimas posições da placa de PCR. 30

31 Manual do procedimento de preparação de PCR Esse kit PapilloCheck é destinado apenas para remessas de 48 amostras. Consequentemente, a preparação de mastermix final é conduzida como o descrito no capítulo anterior usando frascos com código de barra para a preparação do mastermix. Em contraste com o procedimento automático de configuração de PCR, não é obrigatório usar o frasco com código de barra na preparação do mastermix final. Qualquer tubo de ensaio padrão pode ser usado. Prepare o mastermix final (que consiste em PapilloCheck PCR MasterMix, Polimerase HotStarTaq e Uracilo-N-Glicosilase) como descrito na Tabela 3. Para a preparação manual da mistura final da reação: Misture o mastermix final preparado cuidadosamente com o agitador de vórtice durante 2 segundos, e depois reduzindo a rotação, ou através de pipetagem várias vezes. Aliquote o mastermix final através da pipetagem de 21 µl do mastermix final para cada reação de PCR em um tubo de reação de PCR fino, de 0,2 ml, de uma tira de PCR, ou em um poço de uma placa de PCR. Efetue a adição do DNA modelo num ambiente de trabalho diferente do da preparação do mastermix final (consulte o Capítulo 7.2). Adicione 5 µl do DNA extraído a cada tubo de ensaio ou poço e misture com o agitador de vórtice durante 2 segundos, e depois reduzindo a rotação, ou através de pipetagem várias vezes. O volume total da reação de PCR final é 26 µl. Recomenda-se incluir um controle negativo para cada remessa de mastermix preparado. Como controlo negativo, pode utilizar-se o tampão de eluição de DNA do equipamento de extração de DNA apropriado ou água de grau PCR. Feche as tiras de PCR com as tampas adequadas e a placa de PCR usando ou uma tampa de tira ou vedação (consulte o Capítulo 8.2.4). Transfira os tubos de reação ou a placa de PCR para o termociclador e inicie a reação de PCR utilizando o programa do termociclador descrito no Capítulo (Tabela 2). Após a conclusão da PCR, os produtos de amplificação devem ser utilizados imediatamente para hibridação ou conservados no escuro a -20 C por até uma semana. 31

32 8.2.4 Vedação e armazenamento das placas Vedação e armazenamento da placa de eluição Para armazenamento a uma temperatura -20 C, a placa de eluição deve ser fechada após o descarregamento do CheckExtractor. Feche a placa de eluição após remover o dispositivo colocando um papel alumínio adesivo da Greiner Bio-One (Silver seal, 80.0 / 140 MM, REF ). Pressione-o firmemente sobre a superfície da placa. Armazena a placa a uma temperatura -20 C. Recomenda-se usar a folha metálica adesiva da Greiner Bio-One (Silver seal, REF ) para armazenamento da placa de eluição já que a mesma pode ser facilmente removida da placa se a mesma tiver que ser reutilizada para uma configuração de PCR usando o CheckExtractor. Mas também é possível usar o procedimento de vedação descrito no capítulo para a placa de PCR para fechar a placa de eluição Vedação da placa de PCR Após o procedimento de descarregamento do CheckExtractor, descrito no capítulo 8.2.3, a placa de PCR deve ser vedada antes de transferi-la para o ciclador de PCR. Para esta finalidade, uma folha metálica de vedação (Pierce Seal, REF ) é soldada sobre a placa de PCR através de um equipamento de vedação térmica (Modelo: 4S3, REF ). Esse procedimento é descrito na Figura 5. Ligue o equipamento de vedação térmica usando o botão na parte traseira da armação. Ligue-o por volta de 5 minutos antes de usá-lo para garantir que a temperatura de vedação necessária de 170 C pode ser alcançada. Verifique a temperatura de vedação programada e a duração do procedimento de vedação apertando a tecla SET (1x: a temperatura de vedação é exibida; 2x: a duração do procedimento de vedação é exibida). Para uma vedação correta da placa, uma temperatura de vedação de 170 C e uma duração de vedação de t2.0 segundos devem ser definidas. Se um desses valores ou ambos não estiverem corretos, ajuste os valores usando as teclas e. Para ajustar a temperatura de vedação, aperte a tecla "SET" no canto superior esquerdo da parte da frente do dispositivo. A temperatura de vedação definida é exibida na tela e fica piscando. A temperatura exigida pode ser então definida usando as teclas e. Ao apertar novamente, a última temperatura de vedação visível é confirmada e a duração atualmente definida para o procedimento de vedação é exibida (também piscando). A duração pode ser então definida usando as teclas e. Ao apertar novamente a tecla SET, o tempo de duração é confirmado e armazenado no dispositivo. Aguarde até que o dispositivo tenha alcançado uma temperatura de 170 C (a temperatura real é constantemente exibida). Além da temperatura ser exibida, também é possível identificá-la através de um aviso sonoro (bipe) que pode ser ouvido quando o dispositivo está pronto para uso. Abra o dispositivo pressionando a tecla OPERAR. A bandeja com enchimento para a placa de PCR abrirá automaticamente. Remova a estrutura de metal e coloque a placa de PCR sobre o enchimento da bandeja. Depois, coloque a folha metálica de vedação (Pierce Seal, REF ) sobre a placa de PCR. Verifique se a linha azul está virada para cima e se todos os poços estão bem cobertos. Coloque a estrutura de metal na parte de cima da placa. Feche o dispositivo pressionando novamente a tecla OPERAR. A bandeja fechará automaticamente e o procedimento de vedação será iniciado. Após o procedimento de vedação, a bandeja abre novamente automaticamente. Primeiro, remova a estrutura de metal e depois a placa de PCR vedada. 32

33 Após a remoção da placa de PCR, o dispositivo pode ser fechado apertando a tecla CLOSE (FECHAR). Para evitar dobrar a estrutura de metal recomenda-se manter a mesma dentro do dispositivo. Quando estiver fechado, o dispositivo pode ser desligado a qualquer momento, usando o interruptor na parte traseira da armação. Centrifugue brevemente a placa PCR vedada usando uma centrífuga de placas (ver capítulo ) e transfi ra a placa imediatamente para um ciclador de PCR. Inicie a PCR usando o programa PapilloCheck (descrito no capítulo 8.2.1, Tabela 2). Ligue o aparelho de vedação térmica 5 minutos antes de usá-lo. Use uma temperatura de vedação de 170 C e um duração de t2.0 segundos. Aperte OPERATE (OPERAR) para abrir o dispositivo. s 170 Remova a estrutura de metal e coloque a placa de PCR sobre o enchimento da bandeja. Coloque a folha de vedação (Pierce Seal, REF ) sobre a placa de PCR. Coloque a estrutura de metal na parte de cima da placa. Aperte OPERATE (OPERAR). Remova a placa vedada, aperte "CLOSE" (FECHAR). Desligue o equipamento de vedação. s 170 Figura 5: Procedimento de vedação usando o equipamento de vedação térmica Fechar novamente a placa de PCR Após realizar a hibridização (consulte o capítulo 8.3), a placa de PCR pode ser vedada e armazenada novamente a uma temperatura -20 C. Feche a placa de PCR fi xando um papel alumínio adesivo da Greiner Bio-One (Silver seal, REF ). Pressione-o fi rmemente sobre a superfície da placa. Armazene a placa a uma temperatura de -20 C. O papel alumínio adesivo é fi xado diretamente sobre o fi lme de vedação. Ao remover o papel alumínio, é possível que a vedação subjacente esteja parcialmente desprendida da placa. Entretanto, isso não é um problema para tirar os produtos da PCR da placa de PCR. 33

34 8.3 Hibridação e lavagem Os passos pós-pcr a seguir, chamados hibridação e lavagem, são descritos apenas para remessas de 48 amostras. O kit de teste PapilloCheck não é destinado para processar remessas menores. Consequentemente, todos os passos são descritos para o processamento simultâneo de quatro chips PapilloCheck Preparação e disposição A hibridação deve ser efetuada à temperatura ambiente (20-25 C). Inicie os preparativos necessários para a hibridação e os passos de lavagem com pelo menos 30 minutos de antecedência antes de começar o processo de hibridação. Para dissolver os potenciais precipitados na hibridação e nos tampões de lavagem, exponha-os à temperatura ambiente (20-25 C) durante 30 minutos e misture bem antes de utilizar. Armazenar o kit de teste PapilloCheck à 4-8 C pode resultar em precipitação do SDS no Tampão B. Deixe as soluções equilibrarem à temperatura ambiente e depois agite o tubo no agitador de vórtice ou agite o frasco até qualquer precipitado ficar dissolvido. Prepare a Câmara de Hibridação ocheck. coloque uma toalha de papel úmida na Câmara de Hibridação e feche a tampa para criar uma atmosfera saturada de umidade. Para evitar a evaporação do pequeno volume de mistura de hibridação utilizado no chip, é necessário executar a hibridação numa atmosfera saturada de umidade. Uma Câmara de Hibridação dedicada para a análise PapilloCheck está disponível na Greiner Bio-One (consulte o Capítulo 2). Incube quatro chips PapilloCheck na Câmara de Hibridação preparada à temperatura ambiente (20-25 C) durante, pelo menos, 10 minutos. Prepare as soluções de lavagem I, II e III de acordo com as instruções seguintes. Preparação das soluções de lavagem I, II e III: Prepare a solução de lavagem para as soluções de lavagem I, II e III como descrito na Tabela 4. Divida em alíquotas três volumes iguais da mistura da solução de lavagem em três caixas de lavagem ocheck e identifique-as no rótulo como solução de lavagem I, II e III. Por favor, use uma escala graduada em cada caixa de lavagem ocheck para preencher a quantidade correta da solução de lavagem para 4 chips. Pré-aqueça a solução de lavagem II a 50 C em banho-maria com a temperatura controlada durante, pelo menos, 20 minutos antes de utilizar. Certifique-se de que o nível de enchimento do banho-maria seja igual ao nível de enchimento da solução de lavagem II. 34

35 Tabela 4: Preparação da mistura da solução de lavagem Os volumes resumidos nesta tabela são suficientes para os três passos de lavagem (soluções de lavagem I, II e III) para quatro chipspapillocheck. Componentes Água destilada ou desionizada 560 ml Tampão A PapilloCheck 56 ml Tampão B PapilloCheck, 7 ml Volume total 623 ml Nunca reutilize as soluções de lavagem, pois isso pode originar uma acumulação do produto de lavagem da PCR que possivelmente interfere com os resultados do PapilloCheck. Utilize soluções de lavagem novas para cada ensaio. A mistura da solução de lavagem preparada pode ser conservada por até uma semana à temperatura ambiente. Verifique se ocorreu precipitação de SDS. Caso tenha ocorrido, aqueça a mistura da solução de lavagem até que o precipitado esteja dissolvido e novamente equilibrado à temperatura ambiente. Em seguida, prepare a experiência de hibridação seguinte. 35

36 8.3.2 Hibridação A hibridação deve ser efetuada à temperatura ambiente (20-25 C). Os principais passos de trabalho para a hibridação dos produtos da PCR da reação de PCR PapilloCheck para o chip PapilloCheck são ilustrados na Figura 6. Misture os produtos da PCR antes de utilizar. Centrifugue brevemente. Se uma placa de PCR vedada foi usada, use uma centrífuga de placas adequada. Se os produtos da PCR foram conservados a -20 C até à hibridação, primeiro descongele os produtos da PCR antes de misturar e, em seguida, continue conforme descrito. Agite o Tampão de Hibridação no agitador de vórtice antes de utilizar. Centrifugue brevemente. Transfira 30 µl do Tampão de Hibridação PapilloCheck em um tubo de ensaio novo com 8x tiras de PCR. Se for mais conveniente, também pode ser usado um novo poço de uma placa de PCR. Adicione 5 µl dos produtos de PCR no Tampão de Hibridação. Se o Greiner Bio-One CheckExtractor foi usado para a preparação de PCR, os produtos de PCR estão presentes na placa vedada de PCR. A lâmina de vedação é perfurável e pode ser perfurada com a ponta de uma pipeta. Para fechar novamente a placa de PCR, consulte o capítulo Centrifugue brevemente. Transfira 25 µl da mistura de hibridação para cada poço do chip utilizando os seis canais de uma pipeta multicanal. Evite a formação de bolhas de ar Para conseguir o tempo correto da hibridação, é obrigatório processar em paralelo seis amostras usando uma multipipeta de 8 canais (ver Figura 6) Isto aumenta a eficiência de manuseamento, a velocidade, reduzindo, assim, o risco de evaporação. Se possível, hibride todos os 12 poços de um chip. Caso se processem menos de 12 amostras, deixe vazios os poços não utilizados. Os poços não utilizados num chip processado não podem ser utilizados para amostras no futuro. Manuseie o chip cuidadosamente para evitar derramar a mistura de hibridação. O derramamento pode originar contaminação cruzada das amostras e resultados falso positivos. Incube os chips durante exatamente 15 minutos à temperatura ambiente (20-25 C) dentro da Câmara de Hibridação preparada numa atmosfera escura saturada de umidade. Tenha cuidado para não mover a Câmara de Hibridação durante a hibridação. Nunca altere o tempo ou a temperatura de incubação da reação de hibridação, pois isso pode ocasionar a perda de intensidade do sinal fluorescente ou um aumento da fluorescência não específica. Não exponha os chips hibridados à luz solar direta. 36

37 Prepare um ambiente saturado úmido na Câmara de Hibridação. Incube quatro chips PapilloCheck na Câmara de Hibridação à temperatura ambiente (20-25 C) (consulte o Capítulo 8.3.1). Misture 30 µl do Tampão de Hibridação PapilloCheck em um tubo de ensaio de 0.2 ml de uma tira de PCR ou poço com 5 µl do produto de PCR. Misture cuidadosamente. Transfi ra 25 µl da mistura de hibridação para cada poço do chip PapilloCheck usando uma pipeta multicanal. Feche a Câmara de Hibridação e incube o chip PapilloCheck durante exatamente 15 minutos à temperatura ambiente (20-25 C). Figura 6: Passos de trabalho do processo de hibridação 37

38 8.3.3 Lavagem e secagem O equipamento especial fornecido pela Greiner Bio-One permite a lavagem paralela de até quatro chips PapilloCheck (consulte o Capítulo 2). O equipamento adicional necessário para o processamento dos chips PapilloCheck inclui três caixas de lavagem ocheck e uma alça para o suporte magnético da Câmara de Hibridação. Os diferentes passos são mostrados na Figura 7. Retire cuidadosamente o suporte magnético de lâminas que contém as lâminas hibridadas da Câmara de Hibridação. Coloque o suporte de lâminas diretamente na caixa de lavagem ocheck que contém a solução de lavagem I. Certifique-se de que o lado magnético esteja virado para cima. Fixe a alça ocheck ao suporte de lâminas e dê início ao primeiro dos três passos de lavagem. Lave o chip à temperatura ambiente (20-25 C) na solução de lavagem I movimentando-a rapidamente para cima e para baixo durante 10 segundos. Os arrays devem permanecer sempre cobertos com solução de lavagem. Lave os chips durante 60 segundos na solução de lavagem IIa 50 C movimentando vigorosamente para cima e para baixo o suporte de lâminas. Lave o chip à temperatura ambiente (20-25 C) na solução de lavagem III movimentando-a rapidamente para cima e para baixo durante 10 segundos. Retire imediatamente qualquer líquido da superfície do chip através de centrifugação. Se utilizar uma microcentrífuga especial para microarrays, centrifugue durante 1 minuto. Se utilizar uma microcentrífuga aplicável aos tubos de 50 ml, coloque cada chip PapilloCheck lavado num tubo de 50 ml e centrifugue à temperatura ambiente durante 3 minutos a 500 g. O chip PapilloCheck está, então, pronto para escaneamento e deve ser escaneado imediatamente. Para a limpeza das caixas de lavagem ocheck, enxagúe várias vezes com água após cada procedimento de lavagem e secagem estar concluído. 38

39 Primeiro passo da lavagem Remova cuidadosamente o suporte magnético de lâminas da Câmara de Hibridação. Coloque rapidamente o suporte de lâminas na caixa de lavagem ocheck com solução de lavagem I. Fixe o cabo ocheck. Lave os chips PapilloCheck na solução de lavagem I à temperatura ambiente durante 10 segundos movendo o suporte de lâminas para cima e para baixo. Segundo passo da lavagem Lave os chips PapilloCheck na solução de lavagem II em banho-maria à 50 C durante 60 segundos movendo o suporte de lâminas para cima e para baixo. Terceiro passo da lavagem Lave os chips PapilloCheck na solução de lavagem III à temperatura ambiente durante 10 segundos movendo o suporte de lâminas para cima e para baixo. Secagem Imediatamente remova qualquer líquido da superfície do chip PapilloCheck através de centrifugação. 3 minutos 500 g ou 1 minuto velocidade máxima Figura 7: Passos do processo de lavagem Diferentes passos de lavagem e processo de secagem antes da análise do chippapillocheck com o CheckScanner TM e com o Software CheckReport TM. 39

40 8.4 Escaneamento e avaliação do chip PapilloCheck. Coloque os chips PapilloCheck nocheckscanner TM e continue com o escaneamento conforme descrito em detalhes no Guia do Usuário do Software CheckReport TM. Para mais detalhes sobre a instalação do CheckScanner TM e do Software CheckReport TM assim HPV DNA-Chip como os requisitos do sistema do computador, consulte as Instruções de Uso do CheckScanner TM e do Software CheckReport TM. Sempre que analisar dados usando o Software CheckReport TM, certifi que-se de que a versão do software instalada em seu computador corresponde à versão recomendada no kit PapilloCheck que está sendo utilizado. Se as versões não corresponderem, atualize o Software CheckReport TM. A versão mais recente do Software pode ser baixada no site da Greiner Bio-One: IVD Fabricado na Áustria 8 C 4 C PapilloCheck Instruções para uso Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais REF Para uso em diagnóstico in vitro somente por profissionais de laboratório Revisão: BQ Março 2016 Greiner Bio-One GmbH Maybachstr Frickenhausen Alemanha Telefone: +49 (0) Fax +49 (0) info@de.gbo.com 40

41 9. SOLUÇÃO DE PROBLEMAS Se ocorrer uma das mensagens de erro seguintes durante o escaneamento do chip ou se a análise PapilloCheck falhar devido a controles específi cos no chip, continue conforme descrito abaixo. Não hesite em contatar o seu distribuidor local Greiner Bio-One se tiver dúvidas ou difi culdades durante a utilização do PapilloCheck. Para solucionar problemas em outros passos do teste, por HPV DNA-Chip exemplo, extração de DNA, veja as respetivas Instruções de Uso. PROBLEMA e causa MENSAGEM DE ERRO "NÃO FOI POSSÍVEL LER O CÓDIGO DE BARRAS" Código de barras danificado O chip não foi carregado corretamente MENSAGEM DE ERRO "COLORAÇÕES EM FALTA", CONTROLE DA IMPRESSÃO FALHOU OU CONTROLE DA ORIENTAÇÃO FALHOU Poeira no chip Comentários e sugestões Verifi que se o código de barras está danifi cado. Introduza o código de barras manualmente quando aparecer a janela apropriada. Verifi que a orientação do chip e faça o escaneamento do chip na orientação correta. Repita a hibridação do(s) produto(s) da PCR em outro chip. IVD Fabricado na Áustria 8 C 4 C Formação de bolhas de ar durante a transferência de líquido no chip CONTROLE DE HIBRIDAÇÃO FALHOU Temperatura incorreta da solução de lavagem II PapilloCheck Temperatura incorreta do banho-maria Instruções para uso Preparação errada da mistura de hibridação CONTROLE DA PCR FALHOU Repita a hibridação do(s) produto(s) da PCR em outro chip. Pipete cuidadosamente para evitar a formação de bolhas. O segundo passo da lavagem tem de ser realizado a 50 C. Certifi que-se de que a solução de lavagem II seja aquecida a 50 C. O segundo passo da lavagem tem de ser realizado a 50 C. Verifi que a temperatura do banho-maria. Certifi que-se de que a temperatura do banhomaria esteja a 50 C. Se necessário, confi ra a temperatura com um termômetro. Repita a preparação da mistura de hibridação com os volumes corretos e hibride os produtos da PCR em outro chip. Sem adição de Polimerase de DNA HotStarTaq no MasterMix Repetir análise do PapilloCheck começando com a preparação da reação da PCR. Adição de uma Polimerase Repetir análise do PapilloCheck começando com a preparação da reação da de DNA HotStarTaq que não PCR. funciona corretamente ao MasterMix Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma Adição humano de Uracilo-N-Glicosilase 6, 11, 16, 18, 31, 33, Repetir 35, análise 39, 40, do 42, PapilloCheck 43, 44/55, começando 45, 51, 52, com 53, a preparação 56, 58, 59, da 66, reação 68, da não 70, diluída 73, a 82 MasterMix em amostras cervicais PCR. Mistura de reação não foi Repetir a análise do PapilloCheck começando com a reação da PCR. Tenha misturada REF 465 o suficiente 088 cuidado para misturar cuidadosamente a mistura de reação. Inibidores da PCR estão Repita a extração de DNA e a análise do PapilloCheck Para uso em diagnóstico in vitro. presentes na amostra somente por profissionais de laboratório Hibridação executada sem Repita a hibridação. adição de produto da PCR Mistura de hibridação não foi misturada o suficiente Repita a hibridação. Revisão: BQ Março 2016 Problemas com o Greiner Bio-One Verifi GmbH que o desempenho do termociclador e se a respectiva programação está termociclador Maybachstr correta Frickenhausen (passos da PCR, Alemanha rampa de aquecimento, volume). Telefone: +49 (0) Use 7022 apenas termocicladores Fax +49 (0) 7022 válidos com o PapilloCheck. info@de.gbo.com 41

42 PROBLEMA e causa CONTROLE DA AMOSTRA FALHOU Não existe adição de DNA da amostra à reação da PCR Comentários e sugestões Repetir a análise do PapilloCheck começando com a reação da PCR. Preparação do DNA falhou Repita a extração do DNA. HPV DNA-Chip Não existe material de amostra o suficiente A coleta da amostra falhou. A amostra é muito clara. Concentre a amostra de acordo com a descrição do Capítulo 9.1 e repita a extração de DNA ou repita a coleta da amostra. PCR E/OU CONTROLES DA AMOSTRA NÃO FALHARAM, MAS EXIBEM UM VALOR DE RELAÇÃO SINAL/RUÍDO DE 0 Esse resultado é classifi cado como válido se o Software CheckReport TM detectar, pelo menos, um tipo de HPV na amostra com um sinal acima de um limite defi nido. A amostra e/ou o controle da PCR podem então mostrar sinais fl uorescentes baixos ou mesmo ausentes devido a competição durante a PCR. 10. ASSISTÊNCIA TÉCNICA A Greiner Bio-One dispõe de um departamento de assistência técnica que conta com cientistas experientes, com uma vasta experiência teórica e prática em biologia molecular e nos produtos ocheck. Se houver quaisquer dúvidas ou difi culdades relativas aos produtos ocheck, não hesite em contatar o seu distribuidor local Greiner Bio-One. IVD Fabricado na Áustria 8 C 4 C PapilloCheck Instruções para uso Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais REF Para uso em diagnóstico in vitro somente por profissionais de laboratório Revisão: BQ Março 2016 Greiner Bio-One GmbH Maybachstr Frickenhausen Alemanha Telefone: +49 (0) Fax +49 (0) info@de.gbo.com 42

43 11. CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHO DO PAPILLOCHECK 11.1 Desempenho Analítico do PapilloCheck Sensibilidade analítica HPV DNA-Chip Para acessar a sensibilidade analítica, o limite de detecção (LoD95 = menor número de cópias do DNA alvo que pode ser detectado em 95% dos casos) foi estabelecido usando como referência plasmídeos para cada tipo de HPV detectável contendo a região E1 visada pelo PapilloCheck. Para a análise, os plasmídeos genótipo de HPV específico foram fortificados em meio de transporte incluindo células do tipo humana (células HEK) como base. O DNA foi extraído de cada amostra e subsequentemente analisado com o kit PapilloCheck. O LoD95 foi calculado para cada genótipo de HPV individualmente usando 2 séries de diluições independentes e análise Probit. O LoD95 foi verificado com uma terceira série de diluição para cada genótipo de HPV. Os limites de detecção para os diferentes genótipos de HPV estão resumidos na Tabela 5. IVD Fabricado na Áustria 8 C 4 C Tabela 5: Sensibilidade Analítica do PapilloCheck Limite de Detecção (LoD95) para Limite de detecção (LoD95) para Genótipo do o PapilloCheck HPV* o PapilloCheck [cópias/pcr]** [cópias/extração]*** HPV HPV HPV HPV HPV HPV PapilloCheck 1800 HPV HPV HPV Instruções para uso HPV HPV HPV HPV HPV HPV Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma HPV humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, HPV , 73, 82 em amostras cervicais HPV HPV REF HPV Para uso em diagnóstico in vitro Revisão: BQ HPV somente por profissionais de laboratório Março 2016 HPV HPV HPV HPV Greiner Bio-One GmbH * Plasmídio genótipo de Maybachstr. HPV específi 2 co com Frickenhausen de células humanas Alemanha HEK como base em PreservCyt (Hologic). ** Reação de LoD95 por PCR calculado por LoD95 por extração (consulte ***) *** LoD95 baseado em Telefone: análises de probabilidade +49 (0) 7022 incluindo o sistema Fax +49 recomendado (0) 7022 de Extração de DNA ocheck da Greiner Bio-One info@de.gbo.com 43

44 Especificidade analítica tipos de HPV O Papillocheck foi testado em sua especificidade analítica usando plasmídeos de referência de genótipo de HPV específico. Os seguintes genótipos de HPV foram testados com cópias de 10 5 /reações de PCR: HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 26, HPV 30, HPV 31, HPV 33, HPV 34, HPV HPV 35, HPV DNA-Chip 39, HPV 40, HPV 42, HPV 43, HPV 44, HPV 45, HPV 51, HPV 52, HPV 53, HPV 54, HPV 55, HPV 56, HPV 58, HPV 59, HPV 61, HPV 66, HPV 67, HPV 68, HPV 69, HPV 70, HPV 71, HPV 73, HPV 81, HPV 82, HPV 84, HPV 85. Detectaram-se as hibridações cruzadas seguintes: O HPV 55 dá um sinal na sonda do HPV 44. Como resultado, o Software CheckReport exibe um resultado combinado de HPV 44/HPV 55. O HPV 13 pode reagir de forma cruzada com a sonda do HPV 11, mas não resulta num sinal falso positivo pois o HPV 13 não está presente nas amostras cervicais Especificidade analítica Organismos Não-HPV O Papillocheck foi testado em sua especificidade analítica usando os seguintes organismos não- HPV (1ng DNA genômico/reação de PCR): IVD Fabricado na Áustria 8 C 4 C Bacteroides ureolyticus, Bacteroides uniformis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium adolescentis, Chlamydia trachomatis, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Enterobacter sakazakii, Enterobacter faecium, Enterobacter durans, Enterobacter faecalis, Escherichia coli, Fusobacterium nucleatum, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Peptostreptococcus anaerobius, Peptostreptococcus micros, Proteus hauseri, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Trichomonas vaginalis, Candida albicans PapilloCheck Nenhum sinal não-específico foi detectado com PapilloCheck Repetibilidade (Intra-Reprodutibilidade) Instruções para uso A repetibilidade mede a variação de desempenho entre diferentes testes em um laboratório. Para fazer a avaliação de repetibilidade de DNA de 12 amostras, contendo modelos de HPV diferentes (incluindo os genótipos de HPV HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV35, HPV43, HPV44/55, HPV 45, HPV51, HPV52, HPV53) baseado em células humanas foi extraído usando o CheckExtractor em combinação com o Kit de Extração de DNA ocheck -CheckExtractor e analisado com o PapilloCheck Kit. Cada amostra foi analisada em 6 repetições independentes e em 3 testes independentes. Equipamento Ou seja, para 18 diagnóstico repetições para de cada a genotipagem amostra e 216 dos amostras tipos do num vírus total do foram papiloma testadas pela avaliação humano 6, de 11, repetibilidade. 16, 18, 31, 33, Todas 35, 39, as 40, amostras 42, 43, foram 44/55, testadas 45, 51, 52, pelo 53, mesmo 56, 58, 59, usuário, 66, 68, com equipamentos 70, 73, 82 e em kit do amostras mesmo lote. cervicais Além disso, a avaliação de repetibilidade descrita foi executada em 3 locais de teste, então, no total, 648 análises foram conduzidas. Uma concordância de 99,3% em média REF foi 465 obtida 088 em todos os testes de repetibilidade (consulte Tabela 6). Tabela 6: Resultados dos testes de repetibilidade com PapilloCheck Para uso em diagnóstico in vitro somente Local de teste por profissionais Concordância de laboratório Revisão: BQ Março 2016 Local de teste 1 98 % Local de teste % Local de teste % Greiner Bio-One GmbH Concordância média: Maybachstr ,3 % Frickenhausen Alemanha Telefone: +49 (0) Fax +49 (0) info@de.gbo.com 44

45 11.3 Reprodutibilidade (Inter-Reprodutibilidade) A reprodutibilidade mede a variação de desempenho entre diferentes testes feitos em diferentes laboratórios. Para fazer a avaliação de repetibilidade de DNA de 12 amostras, contendo modelos de HPV diferentes (incluindo os genótipos de HPV HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV35, HPV43, HPV DNA-Chip HPV44/55, HPV 45, HPV51, HPV52, HPV53) baseado em células humanas foi extraído usando o CheckExtractor em combinação com o Kit de Extração de DNA ocheck -CheckExtractor e analisado com o PapilloCheck Kit. O procedimento foi executado paralelamente em 3 locais de teste diferentes. Cada amostra foi analisada em 6 repetições independentes e 3 testes independentes em cada local de teste. Ou seja, 18 repetições de cada amostra e 216 amostras num total foram testadas em cada local de teste. Cada local de testes usou diferentes equipamentos (CheckExtractor, ciclador de PCR, CheckScanner ) e kits de lotes diferentes. No total, 648 amostras foram testadas. Uma concordância de 99,7% foi obtida com os resultados dos diferentes locais de teste Robustez Para avaliar a robustez do sistema de testes do PapilloCheck consideraram-se variações dos parâmetros seguintes: Temperatura de Hibridação Tempo de hibridação Temperatura de lavagem IVD Fabricado na Áustria 8 C 4 C Todos os testes foram realizados em 3 repetições com concentrações de modelos altos (cópias de 10 5 /reações de PCR de plasmídeo de referência HPV) e com concentração de modelos perto do limite de detecção (concentração dependendo do genótipo de HPV). Os testes foram executados em cada genótipo de HPV detectável com PapilloCheck o PapilloCheck. Os intervalos dos valores dos parâmetros determinados no qual uma detecção robusta de HPV é possível encontram-se resumidos na Tabela 7. Instruções Parâmetro para Intervalo uso Tabela 7: Robustez do PapilloCheck Temperatura de hibridação C Tempo de hibridação minutos Temperatura de lavagem C Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais REF Para uso em diagnóstico in vitro somente por profissionais de laboratório Revisão: BQ Março 2016 Greiner Bio-One GmbH Maybachstr Frickenhausen Alemanha Telefone: +49 (0) Fax +49 (0) info@de.gbo.com 45

46 11.5 Desempenho Clínico do PapilloCheck Para determinar o desempenho clínico do PapilloCheck e do teste de alto risco PapilloCheck em termos de sensibilidade e especificidade clínicas,realizou-se um estudo comparativo utilizando o PapilloCheck e o teste GP5+/6+-PCR EIA 12. Para este estudo, analisaram-se amostras de 1437 mulheres representativas com citologia normal (grupo de controle) com mais de 40 anos de HPV DNA-Chip idade (idade média, 49 anos; faixa etária dos 40 aos 60 anos) e 192 mulheres representativas (idade média, 34 anos; faixa etária dos 30 aos 60 anos) com lesões CIN3+ histologicamente confirmadas (grupo de casos). Todas as amostras utilizadas neste estudo foram colhidas originalmente durante a fase do estabelecimento da linha de base a partir de mulheres no grupo de intervenção do ensaio de implementação, POBASCAM, aleatório e com controle, baseado na população 13. Após restringir a análise PapilloCheck aos 14 tipos de HPV de alto risco visados pelo GP5+/6+- PCR-EIA, e pelo novo PapilloCheck de alto risco, o PapilloCheck teve uma sensibilidade Em comparação, estes valores foram 96,4 % (185/192; 95 % IC: 93,9-98,9) e 97,7 % (95 % IC: 96,9-98,5), respetivamente, para GP5+6+-PCR-EIA (consulte a Tabela 8 e 9). Tabela 8: Comparação dos resultados de PapilloCheck (14 tipos de HPV de alto risco visados pelo PapilloCheck ) e GP5+/6+ PCR-EIA resultados estratifi cados para controles e casos. IVD Fabricado na Áustria 8 C 4 C PapilloCheck (14 tipos de HPV de alto risco) Controles - + total Casos - + total PapilloCheck GP5+/6+-PCR/EIA Instruções para uso Total (96,5 %) 18 (1,3 %) (97,7 %) 4 (2,1 %) 3 (1,6 %) 7 (3,6 %) 4 (0,3 %) 29 (2,0 %) 36 (2,3 %) 4 (2,1 %) 181 (94,3 %) 185 (96,4 %) (96,7 %) 47 (3,3 %) (4,2 %) 184 (95,8 %) 192 Tabela 9: Sensibilidade e especifi cidades clínicas de PapilloCheck e GP5+/6+-PCR-EIA (resultados para um ou mais dos 14 tipos de HPV de alto risco: HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, ou 68). 14 HPV de alto risco PapilloCheck GP5+/6+ Sensibilidade Clínica para CIN3 95,8 % 96,4 % Especificidade Clínica para CIN2 96,7 % 97,7 % Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais REF Para uso em diagnóstico in vitro somente por profissionais de laboratório Revisão: BQ Março Comparison of the clinical performance of PapilloCheck human papillomavirus detection with that of the GP5+/6+-PCRenzyme immunoassay in population-based cervical screening. Hesselink AT, Heideman DA, Berkhof J, Topal F, PolRP, Meijer CJ, Snijders PJ. J Clin Microbiol Mar;48(3): Epub 2009 Dec Bulkmans, N. W., L. Rozendaal, P. J. Snijders, F. J. Voorhorst, A. J. Boeke, G. R. Zandwijken, F. J. van Kemenade, R.H. Verheijen, K. Groningen, Greiner M. E. Bio-One Boon, H. GmbH J. Keuning, M. van Ballegooijen, A. J. van den Brule, and C. J. Meijer POBASCAM, a population-based Maybachstr. randomized controlled Frickenhausen trial for implementation Alemanha of high-risk HPV testing in cervical screening: design, methods and Telefone: baseline data +49 of (0) 44, women Int. Fax J. +49 Cancer (0) 110: info@de.gbo.com 46

47 Para acessar o teste de reprodutibilidade do PapilloCheck com amostras clínicas, um estudo foi conduzido em 2012 nos Países Baixos e na Alemanha. Nesse estudo, foram usadas amostras cervicais obtidas de um painel de mulheres que participaram de exames regulares de citologia cervical na província de Utrecht nos Países Baixos. Usando um conjunto definido de 550 amostras, pré-testadas, o PapilloCheck mostrou uma concordância de reprodutibilidade intralaboratório e inter-laboratório de 97,6% e 94%, respetivamente. O conjunto de dados da avaliação de reprodutibilidade está resumido nas Tabelas 10 e 11. HPV DNA-Chip Tabela 10: Reprodutibilidade Intra-Laboratório PapilloCheck time 1 pos PapilloCheck time 1 neg PapilloCheck time 2 pos PapilloCheck time 2 neg Resultados: Reprodutibilidade [%]: 97,3 Menor confiabilidade [%] = 96,3 Kappa = 0,941 Tabela 11: Concordância Inter-Laboratório PapilloCheck time 1 pos PapilloCheck time 1 neg PapilloCheck time 2 pos PapilloCheck time 2 neg IVD Fabricado na Áustria 8 C 4 C Resultados: Reprodutibilidade [%]: 94 Menor confiabilidade [%] = 92,1 Kappa = 0,842 PapilloCheck Instruções para uso Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais REF Para uso em diagnóstico in vitro somente por profissionais de laboratório Revisão: BQ Março 2016 Greiner Bio-One GmbH Maybachstr Frickenhausen Alemanha Telefone: +49 (0) Fax +49 (0) info@de.gbo.com 47

48 PCR Sala 2 P R O T O C O L O B R E V E 48

49 s PROTOCOLO BREVE PAPILLOCHECK 12.1 Sala 2: Preparação do mastermix final PCR Sala 1 Dilua a Uracilo-N-Glicosilase 1:200 em água reagente de PCR. Misture cuidadosamente a diluição da UNG. Prepare o mastermix fi nal utilizado um frasco com código de barra para preparação de mastermix. Preparação de um frasco suficiente para até 48 reações de PCR PapilloCheck PCR MasterMix 1148,4 µl Polimerase HotStarTaq (5 U/µl) 11,6 µl Uracilo-N-Glicosilase (Diluição de 1:200, U/µl) 58 µl Volume total do mastermix final 1218 µl Misture o mastermix fi nal cuidadosamente. Prepare um ou dois frascos de acordo com a quantidade de amostras a serem analisadas ou calculadas pelo software CheckExtractor, respetivamente. 170 P R O T O C O L O OPCIONAL: configuração manual do PCR Aliquote o mastermix fi nal: adicione21 µl do mastermix fi nal para cada reação de PCR em um tubo de reação de PCR, de 0,2 ml, de uma tira de PCR, ou em um poço de uma placa de PCR. Continue com as instruções de adição manual do modelo de DNA (consulte o capítulo ) Configuração da PCR B R E V E 49

50 Sala 1: Configuração Automática de PCR usando o CheckExtractor PCR Sala 2 Iniciando a PCR - método de confi guração. Complete as informações: Carregue o transportador de ponteiras com a quantidade necessária. Carregue o transportador de placas com placa de eluição e uma placa de PCR vazia. Carregue o frasco de mastermix com código de barras no transportador de tubos. Carregue o transportador de tubos. Inicie a verifi cação de confi guração de PCR Depois que a verifi cação de confi guração terminar, vede a placa de PCR usando uma Vedação Pierce e um vedador térmico. Use uma temperatura de vedação de 170 C e um duração de t2.0 segundos. Transfi ra a placa vedada para um ciclador de PCR e inicie o termociclador P R O T O C O L O Depois que a verifi cação de confi guração de PCR tiver terminado, comece a descarregar e feche a placa de eluição. Inicie o procedimento de limpeza. B R E V E 50

51 Sala 2: Preparação manual de PCR Hibrid. e Lavagem Sala 3 OPCIONAL: Adicione 5 µl do modelo de DNA a cada reação da PCR. Misture cuidadosamente. Se uma placa de PCR foi utilizada, vede a placa usando uma Vedação Pierce e vedação térmica. Use uma temperatura de vedação de 170 C e um duração de t2,0 segundos. Inicie a reação de PCR com o programa do termociclador preparado. Tempo Temp. C N.º de ciclos s 170 P R O T O C O L O 20 min 37 C 1 15 min 95 C 1 30 s 25 s 45 s 30 s 45 s 95 C 55 C 72 C 95 C 72 C Pausa 10 C 12.3 Sala 3: Hibridação - Preparação / Reação de hibridação B R E V E 51