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1 hr-hpv DNA-Chip PapilloCheck high-risk Instruções de Utilização Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 em amostras cervicais REF Para utilização em diagnóstico in vitro apenas por pessoal de laboratório profissional Revisão: BQ Maybachstr Frickenhausen Alemanha Telefone: +49 (0) Fax +49 (0)

2 glossário DE símbolos! en Store in the dark Use by Consult Instructions For Use Catalog Number In Vitro Dianostic Medical Device Manufacturer Temperature limitation contains suffi cient for <n> tests Irritant hr-hpv Batch DNA-Chip Important code Note de Im Dunkeln lagern Mindestens haltbar bis Vor Gebrauch Anweisung lesen Katalog- -nummer Hersteller In-Vitro- Diagnostika Medizinprodukt Temperaturbegrenzung Inhalt ausreichend für <n> Tests Reizend Chargenbezeichnung Wichtiger Hinweis fr À stocker à l abri de la lumière Date limite de conservation jusqu au lire les instructions avant utilisation Numéro de référence Fabricant Produit médical de diagnostic in-vitro limite de température Contenu suffi sant pour <n> tests irritant Code du lot Note importante es Conservar en un lugar oscuro A utilizar preferiblemente antes de Antes de usar, leia instrucciones Número de catálogo Fabricante Producto medicinal de diagnóstico in vitro limitación de temperatura Contenido sufi ciente para <n> ensayos Irritante Código de lote Nota importante it Conservare al buio Da utilizzare entro e non oltre leggere le istruzioni prima dell uso Numero catalogo Produttore Dispositivo medicodiagnostico in-vitro limitazione temperatura Contenuto suffi ciente per test <n> Irritante Codice del lotto Nota importante pt nl da Conservar num local escuro A utilizar de preferência antes de Antes de usar, leia as Instruções Número de catálogo Fabricante Dispositivo médico de diagnóstico in vitro Aviso importante Donker Tenminste Gebruik- Catalo- PapilloCheck Fabrikant In vitro high-risk bewaren houdbaar saanwi- jzing mer gusnum- diagnostisch tot lezen medisch product limitação de temperatura Belangrijke opmerking Opbevares mørkt senest sanvisnin- nummer Anvendes læs brug- Katalog- Producent In vitro Instruções de Utilização meskdicin gen doag- nose- -apparat Temperaturbegraensær Conteúdo sufi ciente para <n> ensaios Temperatuurbeperking Voldoende inhoud voor <n> tests Indeholder nok til <n> test Irritante Irriterend Código do lote lot nummer lokalirriterende lotnummer Vigtig henvisning sv Förvaras mörkt. Sista förbrukningsdag läs bruksanvisningen före användning Katalognummer Tillverkare In vitromedicinsk doagnostisk apparatur Temperatur-begränsning Innehållet räcker till <n> tester irriterande lot nummer Viktigt meddelande pl no el Przechowywa ć w ciemności Termin zydatności holdbar til Ograniczenie tempera- Equipamento para instrukcję diagnóstico para a genotipagem Produkt turydos tipos testówdo vírus do papiloma humano 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, yw 58, 59, 66, 68 em amostras cervicais Oppbeva- REF res mørkt Przed użyciem przeczytać les bruksanvisning før bruk katalognummer Producent produsent in vitro-diagnostisk medisinsk utstyr Para utilização em diagnóstico in vitro apenas por pessoal de laboratório profissional Αποθηκεύεται στα σκοτεινά το λιγότερο διατηρείται πριν την χρήση διαβάστε τις οδηγίες Αριθμός Καταλόγου Παραγωγός In vitro διαγνωστικά ιατρικά προϊόντα Numer katalogowy Diagnostyka in vitro temperaturbegrensning περιoριoμός θερμοκραο ίας Zawartość wystarcza na <n> Innhold tilstrekkelig for <n> tester Περιεχόμενο αροκετό για <n> τεοτ drażniący Kod partii Ważne irriterende batch nr. Viktig merknad ερεθιστικό Revisão: BQ κωδικός Σημαντική παρτίδας Agosto υπόδειξη 2011 tr Karanlık yerde saklayınız Son kullanma tarihi: Kullanmadan önce talimatı Katalog numarası greiner okuyun Bio-One gmbh Maybachstr Frickenhausen Alemanha Telefone: +49 (0) Fax +49 (0) Üretici fi rma In vitro diagnostik tıbbi tanı ürünü Sıcaklık sınırlaması İçeriği <n> test için yeterlidir Tahriş edici Parti kodu Önemli Not 2

3 ÍNDICE 1. CONTEÚDO DO EQUIPAMENTO CONsUMÍVEIs, EQUIPAMENTO E MATERIAL NECEssÁRIO... hr-hpv DNA-Chip6 3. ENVIO E CONsERVAÇÃO INsTRUÇÕEs DE segurança ELIMINAÇÃO DE REsÍDUOs INTRODUÇÃO Utilização prevista Tipos de VPh detectáveis com o PapilloCheck high-risk Princípio do ensaio Desenho da microplaca PapilloCheck high-risk Disposição da microplaca PapilloCheck high-risk Controlos na microplaca INsTRUÇÕEs PARA O FLUXO DE TRABALhO DO PAPIllOChECk high-risk Instruções gerais separação de salas...15 PapilloCheck 7.3 Avisos e precauções...16 high-risk Prevenção de contaminação Instruções de manuseamento de microplacas para ADN Precauções gerais de...16 Utilização Trabalhar em segurança PROCEDIMENTO PAPILLOChECk high-risk Colheita de amostras e extracção de ADN Colheita de amostras Extracção de ADN Reacção em cadeia da polimerase (PCR)...21 Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma Preparação do ciclador térmico...21 humano 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 em amostras cervicais Tratamento da Uracilo-N-Glicosilase (UNG)...22 REF Preparação da reacção de PCR Para hibridação utilização e lavagem diagnóstico...25 in vitro apenas por Preparação pessoal e de disposição laboratório...25 profissional Revisão: BQ Hibridação lavagem e secagem Varrimento e avaliação da microplaca PapilloCheck high-risk...31 Maybachstr Frickenhausen Alemanha Telefone: +49 (0) Fax +49 (0)

4 9. REsOLUÇÃO DE PROBLEMAs AssIsTÊNCIA TÉCNICA CARACTERÍsTICAs DE DEsEMPENhO DO PAPIllOChECk high-risk Desempenho analítico do PapilloCheck high-risk...34 hr-hpv DNA-Chip Sensibilidade analítica Especifi cidade analítica tipos de VPH Especifi cidade analítica Organismos Não-VPH Repetibilidade Reprodutibilidade Robustez Desempenho clínico do PapilloCheck high-risk PROTOCOLO CURTO PAPIllOChECk high-risk sala 2: PCR - Preparação da mistura de reacção sala 2: PCR - Adição do modelo de ADN / Reacção da PCR sala 3: hibridação - Preparação / Reacção de hibridação sala 3: Lavagem e secagem / Varrimento e avaliação...43 PapilloCheck high-risk Instruções de Utilização Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 em amostras cervicais REF Para utilização em diagnóstico in vitro apenas por pessoal de laboratório profissional Revisão: BQ Maybachstr Frickenhausen Alemanha Telefone: +49 (0) Fax +49 (0)

5 1. CONTEÚDO DO EQUIPAMENTO Equipamento de ensaio PapilloCheck high-risk 1 Conteúdo Quantidade PCR MasterMix Caixa de lâminas, 5 x 12 Arrays Tampão de Hibridação TAMP A conc. TAMP B conc. 5 x PapilloCheck high-risk PCR MasterMix 2 5 x 300 µl 1 x PapilloCheck high-risk Caixa de lâminas com 5 microplacas 3 PapilloCheck high-risk 2 x PapilloCheck high-risk Tampão de Hibridação 4 2 x 1000 µl 2 x PapilloCheck high-risk Tampão A concentrado 1 x PapilloCheck high-risk Tampão B concentrado hr-hpv DNA-Chip 5 x 12 Arrays 2 x 40 ml 1 x 15 ml 1 Um equipamento de ensaio PapilloCheck high-risk é sufi ciente para a análise de 60 amostras. 2 Contém todos os componentes necessários para PCR excepto para a Taq Polimerase de ADN e a Uracilo-N-Glicosilase. Na etiqueta de cada frasco individual, o PapilloCheck high-risk está abreviado como PapilloCheck hr. 3 Uma microplaca PapilloCheck high-risk contém 12 microarrays PapilloCheck high-risk. Na etiqueta do código de barras de cada microplaca individual PapilloCheck high-risk, o PapilloCheck high-risk está abreviado como PapilloCheck hr. 4 Na etiqueta de cada frasco individual, o PapilloCheck high-risk está abreviado como PapilloCheck hr. PapilloCheck high-risk Instruções de Utilização Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 em amostras cervicais REF Para utilização em diagnóstico in vitro apenas por pessoal de laboratório profissional Revisão: BQ Maybachstr Frickenhausen Alemanha Telefone: +49 (0) Fax +49 (0)

6 2. CONsUMÍVEIs, EQUIPAMENTO E MATERIAL NECEssÁRIO Recomenda-se a utilização de PapilloCheck high-risk em combinação com os consumíveis, equipamento e material indicados e apenas por pessoal profi ssional. Consumíveis Cat. greiner Bio-One N.º Quantidade hr-hpv DNA-Chip Equipamento de ensaio PapilloCheck high-risk Equipamento de ensaio para 60 reacções PapilloCheck Collection Kit amostras Equipamento de Extracção de ADN ocheck / Preparação com Uma Coluna Equipamento de ensaio para 50 preparações Equipamento de Extracção de ADN ocheck / Preparação com 8 Colunas x 8 preparações Pontas com filtro sem DNase para micropipetas, esterilizadas 1 Pontas com fi ltro de 0,5-10 µl Pontas com fi ltro de 0,5-20 µl Pontas com fi ltro de µl Pontas com fi ltro de µl Pontas com fi ltro de µl /960 96/960 96/960 96/960 60/600 Tubos de reacção sem DNase Tubo de reacção de 1,5 ml Tubo de reacção de 0,2 ml 2 8 x tiras de 0,2 ml para PCR Tiras com tampa para 8 x tiras de 0,2 ml para PCR PapilloCheck high-risk / / / /1250 Tubo de polipropileno de 50 ml /450 Pipetas de plástico para pipetador Instruções de Utilização Pipeta de 10 ml Pipeta de 25 ml Pipeta de 50 ml ou ou ou /200 1/200 1/200 1 Alguns dos tamanhos de pontas mencionados são opcionais dependendo das micropipetas disponíveis. 2 Em princípio, recomenda-se a utilização de tiras de 8 tubos para PCR. Os tubos de reacção simples (0,2 ml) são opcionais se as tiras não estiverem disponíveis. 3 Apenas necessário se não estiver disponível uma centrifugadora de lâminas. Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 em amostras cervicais REF Para utilização em diagnóstico in vitro apenas por pessoal de laboratório profissional Revisão: BQ Maybachstr Frickenhausen Alemanha Telefone: +49 (0) Fax +49 (0)

7 Equipamento Cat. greiner Bio-One N.º Quantidade CheckScanner TM CheckReport TM Software Basic / CheckReport TM Software PapilloCheck high-risk plugin / Câmara de Hibridação ocheck com suporte de lâminas hr-hpv DNA-Chip 1 Pega para suporte de lâminas Caixa de lavagem ocheck ocheck VacSet ocheck VacPump Enzimas necessárias Taq Polimerase: 5 U/µl da Polimerase do ADN HotStarTaq (Qiagen; , , , ) Uracilo-N-Glicosilase: 1 U/µl da Uracilo-ADN Glicosilase (Fermentas; #EN0361, #EN0362) Consumíveis adicionais necessários Água de grau PCR Água destilada ou desionizada luvas descartáveis Equipamento adicional necessário Microcentrifugadora para tubos de reacção de 1,5 e 2 ml Centrifugadora para tubos de polipropileno de 50 ml (por ex. BeckmanCoulter; Centrifugadora Allegra X-22; Rotor de Ângulo Fixo C0650) ou centrifugadora de lâminas (por ex. labnet: Slide Spinner; VWR International: Galaxy MiniArray Centrifuge) Microcentrifugadora para tubos de reacção simples de 0,2 ml ou tiras de 8 tubos para PCR (por ex. labnet: Spectrafuge Mini Centrifuge) Ciclador térmico para PCR: GeneAmp PapilloCheck high-risk PCR system 9700 (Applied Biosystems) ou Ciclador Térmico Veriti de 96 Poços (Applied Biosystems) Banho-maria (50 C) Micropipetas (diferentes gamas de 1 a 1000 µl) Multipipeta de 8 canais (gama: 5-50 µl), por ex. Brand Transferpette Instruções de Utilização -8 (Brand) Pipetador para pipetas de vidro e de plástico Agitador vortex Racks para diferentes tubos de reacção Material adicional necessário Computador (relativamente aos requisitos do sistema, consulte as Instruções de Utilização do CheckSanner TM e CheckReport TM Software) 4 CheckReport TM Software está disponível em duas versões. As Cat. N.º / cumprem adicionalmente o requisitos Equipamento de 21 CFR Parte para 11. diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma 5 Para humano o processo 16, de lavagem 18, 31, de 33, PapilloCheck 35, 39, 45, high-risk 51, 52, são 56, necessárias 58, 59, 66, três 68 caixas em amostras de lavagem cervicais ocheck. 6 Apenas necessário em combinação com a Cat. N.º REF Para utilização em diagnóstico in vitro apenas por pessoal de laboratório profissional Revisão: BQ Maybachstr Frickenhausen Alemanha Telefone: +49 (0) Fax +49 (0)

8 3. ENVIO E CONsERVAÇÃO O envio do equipamento de ensaio PapilloCheck high-risk é feito à temperatura ambiente. No entanto, o equipamento tem de ser conservado imediatamente após a recepção a 4-8 C e deve ser protegido da luz. Sendo conservado correctamente, o equipamento de ensaio PapilloCheck high-risk e os seus componentes podem utilizar-se até à data de validade indicada. Além disso, hr-hpv DNA-Chip nestas condições, a duração não diverge do prazo de validade após a primeira abertura do equipamento e dos seus componentes. 4. INsTRUÇÕEs DE segurança O equipamento de ensaio PapilloCheck high-risk destina-se apenas a utilização no laboratório, não para utilização como medicamento, em casa, ou outras fi nalidades. Use sempre uma bata de laboratório adequada, luvas descartáveis e óculos de protecção e cumpra as instruções de segurança fornecidas nesta secção. Os componentes seguintes do equipamento de ensaio PapilloCheck high-risk contêm substâncias nocivas e perigosas. Componente Conteúdos Perigosos símbolo de Perigo Frases de segurança Frases de segurança Frases de segurança Tampão de hibridação Tampão B Cloridrato de tiocianato (25-60 %) Nocivo* PapilloCheck high-risk <20 % de dodecilo sulfato de sódio Perigoso* Instruções de Utilização R20/21/22 R32 R52/53 R21/22 R36/37/38 S13 S61 S36/37 S26 S36/37 * A rotulagem de preparações perigosas não é necessária para embalagens pequenas até 125 g ou ml (de acordo com o art. 25.º da Directiva 67/548//CEE, o art. 12.º da Directiva 1999/45/CE e os regulamentos alemães GefStoffV 20 (3) e TRGS ). Para mais informações, consulte a Ficha de Dados de Segurança. Frases de risco R 21/22 Nocivo em contacto com a pele e por ingestão R 20/21/22 Nocivo por inalação, em contacto com a pele e por ingestão R 32 Em contacto com ácidos liberta gases muito tóxicos R 36/37/38 Irritante para os olhos, vias respiratórias e pele R 52/53 Nocivo para os organismos aquáticos, podendo causar efeitos nefastos a longo prazo no ambiente Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma aquático humano 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 em amostras cervicais Frases de segurança S13 REF 505 Manter 060afastado de alimentos e bebidas, incluindo os dos animais S26 Em caso de contacto com os olhos, lavar imediata e abundantemente com água e consultar um especialista S36/37 Para utilização Usar vestuário em de diagnóstico protecção e luvas in adequadas vitro S61 apenas Evitar por a libertação pessoal para de laboratório o ambiente. Obter profissional instruções específi cas/fi cha de dados de segurança. Revisão: BQ A versão actual da Ficha de Dados de Segurança para este produto pode ser descarregada a partir do sítio da Internet Greiner Bio-One: Maybachstr Frickenhausen Alemanha Telefone: +49 (0) Fax +49 (0)

9 5. ELIMINAÇÃO DE REsÍDUOs Após a lavagem e a secagem da microplaca PapilloCheck high-risk, as soluções de lavagem I, II e III podem ser eliminadas sem quaisquer precauções especiais. Elimine a microplaca PapilloCheck high-risk utilizada, os componentes não utilizados do equipamento e a mistura de hibridação não utilizada com os resíduos químicos do laboratório. Cumpra todos os regulamentos nacionais, hr-hpv DNA-Chip estatais e locais relativos à eliminação. PapilloCheck high-risk Instruções de Utilização Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 em amostras cervicais REF Para utilização em diagnóstico in vitro apenas por pessoal de laboratório profissional Revisão: BQ Maybachstr Frickenhausen Alemanha Telefone: +49 (0) Fax +49 (0)

10 6. INTRODUÇÃO A infecção persistente com um vírus do papiloma humano cancerígeno (VPH) verifi ca-se virtualmente em todos os casos de cancro cervical o segundo cancro mais comum nas mulheres a nível mundial. 1 Até à data, identifi caram-se mais de 100 tipos de VPH, dos quais cerca de 40 tipos são transmitidos sexualmente e infectam a mucosa genital. Os tipos de VPH cervical estão classifi cados hr-hpv DNA-Chip como um grupo de alto risco (VPH de alto risco, VPHar) e de baixo risco (VPH de baixo risco, VPHbr). Ao passo que os tipos de VPH de alto risco estão associados a um aumento do risco de desenvolver cancro cervical, os tipos de VPH de baixo risco causam sobretudo verrugas genitais benignas. 2 Contudo, mesmo dentro do grupo de alto risco, o risco relativo para o desenvolvimento de cancro ou de lesões intraepiteliais cervicais (CIN) depende do tipo. 3 Cerca de 70 % de todos os casos de cancro cervical está associado a uma infecção persistente com VPH 16 ou 18. Os tipos de baixo risco mais prevalecente são VPH 6 e 11. Com base na ligação etiológica quase absoluta entre o VPH cancerígeno e o cancro cervical, o teste ao VPHbr está agora a ser considerado para o rastreio primário do cancro cervical Utilização prevista O PapilloCheck high-risk é um equipamento para diagnóstico e destina-se a ser utilizado para a detecção qualitativa e a genotipagem de 14 tipos do vírus do papiloma humano de alto risco (VPHar) nas preparações de ADN provenientes de esfregaços cervicais humanos. O equipamento destina-se a ser utilizado apenas por pessoal habilitado. O PapilloCheck high-risk cumpre os requisitos da Directiva 98/79/CE, relativa aos dispositivos médicos para diagnóstico in vitro, e, portanto, exibe a marca CE de conformidade. Qualquer resultado de diagnóstico obtido, utilizando o PapilloCheck high-risk deve ser interpretado em conjunto com outras descobertas clínicas ou laboratoriais. PapilloCheck high-risk 6.2 Tipos de VPh detectáveis com o PapilloCheck high-risk O PapilloCheck high-risk permite a identifi cação de 14 tipos de vírus do papiloma humano cancerígeno de alto risco (VPHar) (Tabela 1). Instruções de Utilização Tabela 1: Tipos de VPh detectáveis com o PapilloCheck high-risk VPh 16 VPh 51 VPh 18 VPh 52 VPh 31 VPh 56 VPh Equipamento 33 para VPh 58 diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 em amostras cervicais VPh 35 VPh 59 REF VPh 39 VPh 66 Para utilização em diagnóstico in vitro VPh 45 VPh 68 apenas por pessoal de laboratório profissional Revisão: BQ Walboomers, J. et al (1999). Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. J Pathol. 189(1): Burd EM. Human papillomavirus and cervical cancer. Clin Microbiol Rev. 2003;16: Bosch F.X. et al. (2008). Epidemiology and natural history of human papillomavirus infections and type-specifi c implications in cervical neoplasia. Vaccine. 26 Suppl 10:K Meijer, C.J. et al. (2009). Maybachstr. Guidelines for human Frickenhausen papillomavirus Alemanha DNA test requirements for primary cervical cancer screening in women Telefone: 30 years and +49 older. (0) 7022 Int J Cancer. Fax 124(3): (0)

11 6.3 Princípio do ensaio O PapilloCheck high-risk é um equipamento de ensaio baseado em microarray para a detecção e genotipagem de um fragmento do gene E1 do genoma vírus do papiloma humano (VPH). O procedimento de ensaio é resumido na Figura 1. hr-hpv DNA-Chip Antes da análise PapilloCheck high-risk, o ADN tem de ser extraído de uma amostra de esfregaço cervical. A colheita de amostras e a extracção de ADN não fazem parte do equipamento de ensaio PapilloCheck high-risk. Os produtos dedicados para a colheita de amostra (PapilloCheck Collection Kit) e a extracção de ADN (Equipamento de Extracção de ADN ocheck ) também estão disponíveis da Greiner Bio-One e têm de ser adquiridos em separado (consulte as informações sobre encomendas no Capítulo 2). Após a extracção do ADN genómico viral e humano de uma amostra cervical, um fragmento 350 bp do gene viral E1 é amplifi cado pela reacção em cadeia da polimerase (PCR) na presença de um conjunto de iniciadores específi cos do VPH. Na mesma reacção, um fragmento do gene humano de cópia simples ADAT1 (adenosina deaminase 1 específi ca de tarn humano) é amplifi cado para vigiar a presença de material de amostra humano na amostra cervical (controlo da amostra) e um modelo de controlo interno presente no PapilloCheck high-risk PCR MasterMix é amplifi cado para vigiar o desempenho da PCR (controlo da PCR). Além disso, o PapilloCheck high-risk PCr MasterMix contém dutp. Assim, a potencial contaminação cruzada de reacções de PCR anteriores pode ser eliminada através da utilização do tratamento com Uracilo-N-Glicosilase (UNG) (consulte o capítulo 8.2.2). Os produtos para PCR são então hibridados para sondas específi cas de ADN e controlos na microplaca associados à superfície da microplaca PapilloCheck high-risk. Cada microplaca contém 12 microarrays de ADN, que permitem a análise simultânea de 12 amostras cervicais. Durante a hibridação, o ADN ligado é etiquetado fl uorescentemente e o ADN não ligado é removido nos passos de lavagem subsequentes. Controla-se a efi cácia da hibridação (controlo da hibridação). PapilloCheck high-risk Por último, a microplaca PapilloCheck high-risk é varrida, analisada e avaliada automaticamente utilizando o CheckScanner Instruções TM e o CheckReport de Utilização TM Software, respectivamente (consulte as informações sobre encomenda no Capítulo 2). O CheckScanner TM é um scanner a laser bicolor (comprimentos de onda de excitação de 532 nm e 635 nm), que permite a detecção do sinal fl uorescente gerado pela presença dos produtos de amplifi cação específi cos do VPH bem como dos controlos (consulte o capítulo 6.4.2). O CheckReport TM Software permite a visualização, análise e avaliação dos resultados e mostra automaticamente os valores correspondentes tanto dos tipos de VPH detectados como dos controlos num relatório detalhado. O relatório indica claramente a presença ou ausência de um ou mais dos 14 tipos de VPH de alto risco detectáveis Equipamento e os para controlos diagnóstico abrangentes para a na genotipagem microplaca tornam dos tipos a análise do vírus altamente do papiloma fi ável. humano 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 em amostras cervicais REF Para utilização em diagnóstico in vitro apenas por pessoal de laboratório profissional Revisão: BQ Maybachstr Frickenhausen Alemanha Telefone: +49 (0) Fax +49 (0)

12 1. Reacção da PCR hr-hpv DNA-Chip 2. hibridação 3. Lavagem e secagem PapilloCheck high-risk ou Instruções de Utilização 4. Varrimento e análise Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 em amostras cervicais REF Para utilização em diagnóstico in vitro apenas por pessoal de laboratório profissional Revisão: BQ Figura 1: Processo de ensaio PapilloCheck high-risk 1. Reacção da PCR: após a extracção de ADN, um fragmento 350 bp do gene viral E1 e os fragmentos de dois objectivos de controlo são amplifi cados através de PCR. Os produtos de amplifi cação são então hibridados para sondas de ADN complementares na microplaca. 2. hibridação: cada tipo de VPH é detectado por uma sonda de ADN específi ca presente em cinco réplicas. Durante a hibridação, introduz-se a etiquetagem fl uorescente. 3. Lavagem e secagem: o ADN não ligado é removido nos passos de lavagem subsequentes. 4. Varrimento e análise: greiner a microplaca Bio-One PapilloCheck gmbh high-risk é varrida, analisada e avaliada utilizando o CheckScanner TM e o CheckReport TM Maybachstr. Software. É criado um relatório Frickenhausen que indica claramente Alemanhaa presença ou ausência de um ou mais dos 14 tipos de VPH detectáveis. Telefone: +49 (0) Fax +49 (0)

13 6.4 Desenho da microplaca PapilloCheck high-risk Disposição da microplaca PapilloCheck high-risk Cada microplaca PapilloCheck high-risk contém 12 microarrays concebidos como poço A1 - B6. Cada microarray PapilloCheck high-risk é composto por 28 sondas diferentes e está rodeado hr-hpv DNA-Chip por um rebordo elevado. Cada sonda é colorida em cinco réplicas. A disposição do microarray PapilloCheck high-risk é ilustrada na Figura 2 e os controlos na microplaca são explicados no Capítulo a) b) canal vermelho (635 nm) controlo da orientação HPV 16 HPV 18 HPV 31 HPV 33 HPV 35 HPV 39 HPV 45 controlo da amostra controlo da orientação controlo da hibridação HPV 51 HPV 52 HPV 56 HPV 58 HPV 59 HPV 66 HPV 68 controlo da PCR controlo da hibridação canal verde (532 nm) PapilloCheck high-risk HPV 16 HPV 18 HPV 31 HPV 33 HPV 35 HPV 39 HPV 45 controlo da amostra HPV 51 HPV 52 HPV 56 HPV 58 HPV 59 HPV 66 HPV 68 controlo da PCR c) Instruções de Utilização Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 em amostras cervicais Figura REF 2: Desenho da microplaca PapilloCheck high-risk a) Esquema da microplaca PapilloCheck high-risk. b) e c) Imagens exibidas pelo CheckReport TM Software para os dois comprimentos Para utilização de onda de excitação em diagnóstico diferentes utilizados in vitro para varrimento (b) canal vermelho: 635 nm; c) canal verde: 532 nm) e esquemas da disposição do microarray PapilloCheck apenas por pessoal de laboratório profissional high-risk. Indicam-se as sondas específi Revisão: cas para o tipo BQ do VPH e os controlos na microplaca. Maybachstr Frickenhausen Alemanha Telefone: +49 (0) Fax +49 (0)

14 6.4.2 Controlos na microplaca O desenho da microplaca de ADN PapilloCheck high-risk inclui controlos abrangentes na microplaca. Vários sistemas de controlo vigiam todos os passos mais importantes tanto do ensaio como do processamento da microplaca, incluindo a qualidade das amostras e a extracção de ADN (controlo da amostra), a qualidade de reacção da PCR (controlo da PCR), a efi cácia da hibridação (controlo da hibridação), bem como a homogeneidade da coloração e a qualidade de impressão hr-hpv DNA-Chip (controlo da orientação e controlo da impressão). Para além da presença ou ausência de tipos de VPH, o CheckReport Software mostra automaticamente os valores correspondentes tanto dos controlos como dos tipos de VPH detectados num relatório detalhado. Para a leitura dos diferentes controlos, utilizam-se os dois comprimentos de onda de excitação do CheckScanner. Para o controlo do desempenho do ensaio (controlo da amostra e da PCR), utiliza-se o canal vermelho (comprimento de onda de excitação de 635 nm), enquanto a qualidade da hibridação e da microplaca (controlo da hibridação, da orientação e da impressão) é avaliada no canal verde (comprimento de onda de excitação de 532 nm). Controlo da amostra O PapilloCheck high-risk vigia a qualidade da amostra e/ou da extracção de ADN amplifi cando um fragmento do gene humano de cópia simples ADAT1 (adenosina deaminase 1 específi ca de tarn humano). Se estiver presente ADN humano numa quantidade adequada no ADN extraído da amostra cervical, é gerado um sinal fl uorescente nas colorações de controlo da amostra. Se não ocorrer amplifi cação de ADAT1, ou se for insufi ciente, o CheckReport Software indica que o controlo da amostra falhou e tem de repetir-se a análise devido à quantidade insufi ciente de células na amostra cervical e/ou desempenho insufi ciente na extracção (consulte o Capítulo 9). Controlo da PCR O PapilloCheck high-risk também vigia a qualidade de reacção da PCR. A amplifi cação de um modelo de controlo interno presente PapilloCheck no PapilloCheck high-risk high-risk PCR MasterMix gera um sinal nas colorações de controlo da PCR na microplaca PapilloCheck high-risk. A qualidade da reacção de amplifi cação também é automaticamente avaliada pelo CheckReport Software. Se o desempenho da PCR se situar abaixo de um limite predefi nido, o CheckReport Software indica que o controlo da PCR falhou e tem de repetir-se a análise (consulte o Capítulo 9). Instruções de Utilização Se a quantidade de ADN do VPH na amostra for muito elevada, o sinal fl uorescente das colorações de controlo da PCR pode ser baixo ou mesmo não estar presente devido à concorrência durante a reacção da PCR. Neste caso, o sinal fl uorescente para, pelo menos, uma sonda de ADN específi ca tem de exceder um limite predefi nido para o ensaio ser considerado válido. Controlo da hibridação O PapilloCheck Equipamento high-risk vigia a efi cácia da hibridação através da utilização de uma sonda para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma fl uorescente etiquetada no Tampão de Hibridação PapilloCheck humano 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 em high-risk, que hibrida para amostras cervicais sequências específi cas de ADN na microplaca PapilloCheck high-risk. Uma efi cácia de hibridação adequada REF 505 resulta 060em sinais fl uorescentes em cada coloração de array. Os resultados de cinco colorações de controlo da hibridação na microplaca PapilloCheck high-risk também são avaliados pelo CheckReport Para utilização TM Software. em diagnóstico in vitro apenas por pessoal de laboratório profissional Revisão: BQ Controlo da orientação e da impressão As colorações de controlo da orientação da microplaca PapilloCheck high-risk geram sinais fl uorescentes independentemente da efi cácia do processo de hibridação. Estas colorações são utilizadas no CheckReport TM Software como pontos de orientação para uma detecção correcta da coloração, o que é um pré-requisito para a análise correcta dos sinais. Para além disso, a qualidade do processo de impressão é controlada através da presença de um sinal fl uorescente em cada Maybachstr Frickenhausen Alemanha coloração da microplaca Telefone: (controlo +49 (0) 7022 da impressão) Fax +49 (0)

15 7. INsTRUÇÕEs PARA O FLUXO DE TRABALhO DO PAPIllOChECk high-risk 7.1 Instruções gerais Quando se implementam as técnicas modernas actualmente utilizadas em biologia hr-hpv molecular DNA-Chip num laboratório, devem ter-se em conta as instruções seguintes para garantir a máxima segurança do pessoal do laboratório e resultados de elevada qualidade. A execução de técnicas de biologia molecular, como extracção de ADN, amplifi cação e detecção dos produtos de amplifi cação, requer pessoal devidamente habilitado. Para além disso, é necessário um fl uxo de trabalho limpo e bem estruturado para prevenir resultados errados, tais como os que ocorrem devido à degradação ou contaminação de ADN através dos produtos de amplifi cação. Para garantir isto, é necessário separar as áreas de extracção, amplifi cação e detecção conforme descritas no Capítulo 7.2. Cada área deve estar equipada com equipamento, consumíveis, batas e luvas em separado. Nunca transfi ra batas, luvas ou equipamento de laboratório de uma área para outra. 7.2 separação de salas A Figura 3 mostra um exemplo de como um laboratório pode ser separado em três secções distintas. Uma utiliza-se apenas para a extracção de ADN, outra para a preparação e realização de reacções de PCR e a última destina-se a hibridação e análise. Cada sala utiliza-se exclusivamente para a aplicação ou técnica indicada, para evitar a contaminação de amostras. A utilização de codifi cação de cores pode ser vantajosa para evitar a troca acidental de equipamento e consumíveis entre as áreas. PapilloCheck high-risk Instruções de Utilização sala 1 sala 2 sala 3 Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 em amostras cervicais Figura 3: separação de salas sala 1: REF Todo 505 o processo 060 de extracção de ADN tem de executar-se nesta sala. sala 2: Nesta sala, prepara-se e divide-se a mistura de reacção para PCR em alíquotas (de preferência sob uma protecção para PCR). Para A adição utilização das amostras em diagnóstico de ADN extraídas in vitro na sala 1 tem de efectuar-se num espaço separado dentro da sala 2. sala 3: Na terceira sala de laboratório, ocorre a reacção de hibridação e realizam-se os passos de lavagem apenas por pessoal de laboratório profissional Revisão: e secagem BQ da microplaca. Para além disso, utiliza-se o CheckScanner TM em conjunto com o CheckReport TM Software para a análise fi nal do ensaio PapilloCheck high-risk.! Não se deve trocar nem equipamento nem consumíveis entre as diferentes salas de laboratório e espaços. Portanto, as duplicações de equipamento e consumíveis são uma necessidade e devem ter sido consideradas ao equipar o laboratório. Maybachstr Frickenhausen Alemanha Telefone: +49 (0) Fax +49 (0)

16 7.3 Avisos e precauções Prevenção de contaminação As batas de laboratório têm de ser usadas durante o procedimento e são necessários conjuntos diferentes de batas para cada sala de laboratório. hr-hpv DNA-Chip As luvas têm de ser usadas durante cada passo da análise e têm de ser mudadas com frequência. especialmente durante a extracção de ADN. O local de trabalho tem de ser descontaminado com um produto de limpeza apropriado. Nunca toque no interior da tampa do tubo de reacção. Para evitar contaminação cruzada, abra um tubo de cada vez. Têm de utilizar-se pontas com fi ltro adequadas para micropipetas com protecção contra aerossóis (sem DNase, RNase e ADN humano). As pontas das pipetas devem ser sempre mudadas entre transferências de líquidos Instruções de manuseamento de microplacas para ADN As microplacas para ADN devem utilizar-se num ambiente sem poeiras. Deve evitar-se a deposição de poeiras e de outras partículas na superfície das microplacas. Não toque na zona de hibridação na superfície da microplaca. Apenas o lado etiquetado da microplaca se destina a hibridação. Não utilize canetas marcadoras para a identifi cação de microplacas de ADN, pois causam fl uorescência não específi ca na microplaca. Os arrays de ADN destinam-se a uma única utilização. As microplacas hibridadas não podem ser reutilizadas. Guarde as microplacas não utilizadas PapilloCheck na caixa original dentro do saco com fecho fornecido com dessecante. high-risk Instruções de Utilização Precauções gerais Este equipamento destina-se exclusivamente a diagnóstico in vitro e deve ser utilizado apenas por pessoal treinado na prática de laboratório de diagnóstico in vitro. No momento da chegada, verifi que se os componentes do equipamento têm danos. Se um dos componentes estiver danifi cado (por ex. frascos de tampão), contacte o seu distribuidor local Greiner Bio-One. Não utilize componentes do equipamento danifi cados, pois a sua utilização pode levar a um fraco desempenho do equipamento. Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma Não utilize o equipamento de ensaio PapilloCheck high-risk após o prazo de validade. humano 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 em amostras cervicais Não utilize reagentes fora do prazo de validade. Não REF misture reagentes de diferentes lotes. Utilize Para apenas utilização equipamento/reagentes em diagnóstico in vitro fornecidos com o equipamento e os recomendados pelo fabricante. apenas por pessoal de laboratório profissional Revisão: BQ Deve efectuar-se a calibração/manutenção regular das micropipetas, do banho-maria e do Agosto bloco 2011 de aquecimento. A pipetagem de quantidades pequenas de líquido na gama do microlitro é um desafi o. Portanto, tenha cuidado para pipetar com a maior precisão possível. Para evitar a contaminação microbiana dos reagentes, tenha cuidado ao retirar as alíquotas dos tubos de reagentes. Maybachstr Frickenhausen Alemanha Todos os passos Telefone: da centrifugação +49 (0) 7022 devem efectuar-se Fax +49 (0) 7022 à temperatura ambiente (18-25 C). 16

17 7.3.4 Trabalhar em segurança Tenha cuidado quando manusear amostras biológicas que contenham materiais humanos potencialmente infecciosos. Para minimizar o risco de infecção de material potencialmente infeccioso, recomenda-se trabalhar em condições de fl uxo de ar laminar até a lise das amostras estar concluída. Manuseie e elimine todas as amostras biológicas como se fossem capazes de transmitir agentes infecciosos. hr-hpv DNA-Chip Nunca pipete soluções com a boca. Não coma, beba, fume nem aplique produtos cosméticos nas áreas de trabalho. Evite o contacto directo com as amostras biológicas, bem como salpicar ou pulverizar as amostras. Use sempre uma bata, luvas e óculos de protecção quando trabalha com amostras humanas. lave as mãos cuidadosamente após manusear amostras e reagentes. PapilloCheck high-risk Instruções de Utilização Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 em amostras cervicais REF Para utilização em diagnóstico in vitro apenas por pessoal de laboratório profissional Revisão: BQ Maybachstr Frickenhausen Alemanha Telefone: +49 (0) Fax +49 (0)

18 8. PROCEDIMENTO PapilloCheck high-risk O capítulo seguinte descreve pormenorizadamente os diferentes passos de trabalho que por último ocasionam a realização de um relatório detalhado, indicando claramente a presença ou ausência de um ou mais dos 14 tipos de VPH de alto risco detectáveis em cada amostra cervical analisada. A Figura 4 mostra os diferentes passos de trabalho necessários. Também indica o subcapítulo correspondente que descreve o passo do ensaio específico. Os passos de trabalho têm de ser executados pela ordem descrita neste capítulo. Cada passo específico com intervenção é indicado por uma seta azul.! A colheita de amostras, a extracção de ADN e a análise com o CheckReport TM Software não fazem parte do equipamento de ensaio PapilloCheck high-risk. Portanto, a descrição destes passos de trabalho é abreviada neste capítulo. Para informações mais detalhadas, consulte as Instruções de Utilização correspondentes, por exemplo, do PapilloCheck Collection Kit, do Equipamento de Extracção de ADN ocheck e do CheckReport TM Software. 8.1 Colheita de amostras e extracção de ADN Colheita de amostras A colheita de amostras não faz parte do equipamento de ensaio PapilloCheck high-risk. O equipamento de ensaio dedicado a amostras cervicais (PapilloCheck Collection Kit) também está disponível na Greiner Bio-One (consulte as informações sobre encomendas no Capítulo 2). O PapilloCheck high-risk foi validado utilizando o ADN preparado com o Equipamento de Extracção de ADN ocheck proveniente de esfregaços cervicais humanos colhidos através de um dos sistemas ou meios de colheita seguintes: PapilloCheck Collection Kit (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemanha) PreservCyt (Hologic, Bedford, MA, EUA) Surepath (BD, Franklin Lakes, NJ, EUA) STM TM (Qiagen, Hilden, Alemanha). Para mais informações sobre os meios de transporte adequados ou os sistemas de extracção de ADN, contacte o seu distribuidor local Greiner Bio-One ou consulte o sítio da Internet Greiner Bio-One: 18

19 Capítulo Extracção de ADN Capítulo 8.2 PCR Capítulo Hibridação Capítulo Lavagem e secagem ou Capítulo 8.4. Varrimento e avaliação Figura 4: Apresentação dos diferentes passos de trabalho do PapilloCheck high-risk 19

20 8.1.2 Extracção de ADN A extracção de ADN não faz parte do equipamento de ensaio PapilloCheck high-risk. Deve realizar-se a extracção de ADN antes da análise PapilloCheck high-risk utilizando o Equipamento de Extracção de ADN ocheck, também fornecido pela Greiner Bio-One (consulte as informações sobre encomendas no Capítulo 2). Cumpra rigorosamente as Instruções de Utilização quando usar o Equipamento de Extracção de ADN ocheck. Para a extracção de ADN com o Equipamento de Extracção de ADN ocheck, devem utilizar-se 250 µl de solução de amostra. As amostras de esfregaços cervicais humanos que são colhidas com o PapilloCheck Collection Kit (Greiner Bio-One; Cat. N.º ) em meio de colheita PreservCyt (Hologic, Bedford, MA, EUA) podem ser processadas directamente. As amostras cervicais que são colhidas em meio de colheita Surepath TM (BD, Franklin Lakes, NJ, EUA) têm de ser lavadas antes da utilização: centrifugue 250 µl da amostra durante 5 minutos a g e volte a suspender a pellet em 250 µl de água destilada. Posteriormente, podem processar-se os 250 µl com o Equipamento de Extracção de ADN ocheck. As amostras cervicais que são colhidas em meio de colheita STM TM (Qiagen, Hilden, Alemanha) têm de ser diluídas: utilize 100 µl da amostra e adicione 150 µl de água destilada. Podem processar-se os 250 µl de amostra diluída com o Equipamento de Extracção de ADN ocheck. Regra geral, se a amostra do esfregaço cervical parecer ser muito concentrada e já estiver agregada, a amostra tem de ser diluída e homogeneizada antes de se iniciar a extracção de ADN! As amostras de esfregaços cervicais que sejam muito diluídas e não apresentem células visíveis devem ser concentradas para se obter um rendimento mais elevado de células para extracção de ADN: centrifugue até 250 µl da amostra durante 5 minutos a g e volte a suspender a pellet em 250 µl de água destilada. Posteriormente, podem processar-se os 250 µl com o Equipamento de Extracção de ADN ocheck.! Este passo de concentração só é adequado para amostras de esfregaços cervicais que foram colhidas com o PapilloCheck Collection Kit, em meio de colheita PreservCyt ou em meio de colheita Surepath TM. Se se utilizou o meio de colheita STM TM, não é possível uma concentração através de centrifugação. 20

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