HPV cavidade oral e oro faringe

Transcrição

1 HPV cavidade oral e oro faringe O Que se sabe hoje... Daniela Cochicho Carmo Ornelas Laboratório de Virologia do IPOLFG Serviço de Patologia Clínica

2 Cronologia IARC HPV como Agente causal suficiente na carcinogénese da cavidade oral, orofaringe e amígdala National comprehensive Cancer network (NCCN) Guidelines version updates head and neck cancers. Detecção HPV sugerida para recomendada Syrjanen: Morphological and immunohistochemical evidence suggesting humam papilomavirus (HPV) involvement in oral squamous cell carcinogenesis Tina Dalianis Karolinska Institute Local immunological reactivity in oral squamous cell lesions of possible HPV (human papillomavirus) origin. Em 1983, foi sugerido que o cancro da cavidade oral e laringe podia ser causado por HPV. Parece haver uma justaposição entre o epitélio de células escamosas e o tecido linfático da oro faringe, assim como a zona de transformação do colo. São áreas altamente susceptíveis à infecção por HPV. Em 2009: Ao longo da última década ( ) houve uma aumento de 2.6% por ano. Em homens brancos com idade inferior a 50 anos sem história de consumo de tabaco ou de álcool (Europa do norte e central). 2

3 HPV como agente causal Nos carcinomas de cabeça e pescoço os dados epidemiológicos e laboratoriais evidenciam que HPV é agente causal. 3

4 Epidemiologia 4

5 Epidemiologia In BMC Cancer 2012, 12:30 Estimation of the epidemiological burden of human papillomavirus-related cancers and non-malignant diseases in men in Europe: a review 5

6 Epidemiologia In BMC Cancer 2012, 12:30 Estimation of the epidemiological burden of human papillomavirus-related cancers and non-malignant diseases in men in Europe: a review 6

7 Epidemiologia Prevalência dos tipos de HPV na Cabeça e Pescoço (IARC) Cancer epidemiology, Biomarkers & Prevention, 14 (2005) IARC 7

8 HPV como factor de risco Nos carcinomas de células escamosas de cabeça pescoço temos duas realidades distintas: Tumores HPV (+) Tumores HPV ( ) 8

9 Modelo de carcinogénese: HPV (-) Instabilidade genómica (álcool, tabaco e higiene oral), originando: aneuploidia, mutações na p53 e na p16 HPV (+) Supraexpressão E6 e E7 que interagem com os genes supressores de tumor (p53 e prb)- Roberto Haddad, NEJM, 359, 11,

10 Hoje... Subset OSSC HPV (+) Estratégica terapêutica diferente Ensaios clínicos (profilaxia mais adequada) 10

11 Factores de risco Gillson ML J Clin Oncol Jun 10;30(17): doi: /JCO Epub 2012 May 7. Tobacco smoking and increased risk of death and progression for patients with p16-positive and p16-negative oropharyngeal cancer. 11

12 Nova classificação Proposta 2013 Risk stratification in the new age: low; intermediate and high risk of death on basis of four factors: HPV status; pack-year tobacco; tumour stage and nodal stage Low risk: tumours HPV(+) (best survival) Intermediate risk: smokers with N2b and N3 & non-smokers with T2 or T3 High risk: HPV (-) tumours (worst survival) 100,0% 50,0% 0,0% Survival 3y 93,0% 70,8% 46,2% Low Risk Interm. Risk High Risk Survival 3y N E J Medicine Ang K, et al

13 Porquê detectar o HPV? Tumor primário Oculto NCCN National comprehensive Cancer network (NCCN) Guidelines version updates head and neck cancers 13

14 Ensaios clínicos Pathos trial randomised, multicentre, phase II/III Post-operative Adjuvant Treatment for HPV-positive Tumours (PATHOS) Trial Description Summary The main objectives of the PATHOS study are: To assess whether swallowing function can be improved following transoral resection of HPV-positive OPSCC, by reducing the intensity of adjuvant treatment protocols. The aim is to personalise treatment, based on disease biology (HPV status and pathology findings), to optimise patient outcomes. To demonstrate feasibility of recruitment- if the phase II recruits successfully, PATHOS will continue to a Phase III study aiming to show non-inferiority of survival in the reduced intensity treatment arms. Hisham Mehanna Universidad of Birmingham ( Head of head and neck surgery 14

15 Detecção do HPV em laboratório 15

16 Recolha da Amostra biológica Áreas de intervenção Laringe Faringe Nariz e Seios-perinasais Pescoço Glândulas Salivares Traqueia Base do Crâneo Tiroideia Natureza do produto Biópsias Esfregaço Meio de conservação Meio liquido ThinPrep Meio seco em Tubo estéril Meio liquido ThinPrep 16

17 Como detectar? Vírus a DNA Cadeia dupla Genoma com 8kbp A região L1 é a mais conservada 17

18 Testes Laboratoriais: DNA HPV - região L1, E1, E6/E7: Presença do DNA do HPV Detecção do mrna (E6; E7): Actividade dos principais oncogenes envolvidos na transformação celular p16: HPV E7 inactiva prb -> aumento da p16 ->interferência na apoptose Leemans et al, Nature Reviews Cancer 11, 9-22 (2011) 18

19 Casuística no IPOLFG HPV & HN samples 19

20 Metodologia in house CONTROLO QUALIDADE O sucesso de um resultado depende: Qualidade na recolha da amostra Da rentabilidade da extracção (quantificação e pureza do DNA Nanodrop) Validação Analítica e Clínica do teste utilizado Resultados fiáveis exigem controlo de qualidade apertado 20

21 PCR EM TEMPO REAL: VALIDAÇÃO ANALÍTICA Implementação de uma Metodologia in house Com validação analítica e clínica Com controlos interno e externo Um método válido para a detecção de HPV em displasias e neoplasias Detecção de cerca de 40 tipos de HPV Cada tipo de HPV apresenta um limite de detecção TIPOS DE HPV CONCENTRAÇÃO DETECTADA EM qpcr (IU/5 ul)

22 Processamento de amostras Preparação da amostra Isolamento das células por meio de centrifugação Lavagem do pellet com soro fisiológico Lise Celular Tampão de lise Proteinase K (enzima) Duração O/N Extracção do DNA Kit comercial em sistema de colunas (membrana de sílica) Eluição em 50 ul de tampão Quantificação e pureza do DNA Leitura das absorvências nos comprimentos de onda de 260 e 280 nm, permite determinar a quantidade de DNA obtido do método de extracção e em que pureza se encontra. 22

23 PCR EM TEMPO REAL: PRINCIPIO TEÓRICO Amplificação e detecção do produto especifico é realizada num único sistema. A quantidade de produto de PCR é medido em cada ciclo de amplificação e durante a fase exponencial. O aumento do sinal de fluorescência é directamente proporcional ao número de moléculas de produto amplificado (amplicon) formadas na fase exponencial do PCR. DNA Extraído Primers específicos Placa de 96 poços 7900 fast Aplied Biosystems 23

24 Controlo de qualidade interno Controlo positivo Células CaSki/Siha/HeLa Controlo interno Amplificação do gene da albumina Células: As células Caski, SiHa e HeLa infectadas com ADN de HPV 16 e HPV 18 mantidas em cultura no laboratório e armazenadas em alíquotas de células e células respectivamente, previamente contadas com a câmara de NeuBauer. A quantidade de DNA numa célula diplóide é cerca de 6pg. Se uma célula CaSki contem cerca de 600 GE HPV16, então, 1pg DNA CaSki 100 GE HPV16 Controlo de extracção Branco de extracção Controlo Negativo Água bidestilada 24

25 Técnica de genotipagem do HPV Tecnologia Microarrays O kit Papillocheck utiliza uma metodologia em microarrays, tem a capacidade de identificar 24 genótipos de VPH: 15 genótipos de alto risco (VPH 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82) 2 de provavel alto risco (VPH 53 e 66) e 7 de baixo risco (VPH 6, 11, 40, 42, 43, 44/55, 70). Tecnologia Inno-Lipa O Kit INNO-LIPA utiliza uma metodologia em LiRAS, tem a capacidade de detectar 28 genótipos diferentes de VPH: 15 de alto risco (VPH 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 e 82), 3 de provável alto risco (VPH 26, 53 e 66) e 7 de baixo risco (VPH 6, 11, 26, 40, 43, 44, 54 e 70). Os genótipos VPH 69, 71 e 74 detectados pelo kit não se encontram classificados. 25

26 Sequenciação Amplificação Produto de 190pb da região L1 do DNA do HPV Leitura no sequenciador 26

27 Portugal Dados ROR sul Topografia Taxa bruta Taxa padrao europa Taxa padrao mundial amigdala 0,72 0,67 0,50 Lingua 2,78 2,35 1,72 Língua dos anos Amígdala dos anos Taxa de incidência - região sul de Portugal Editado por registo oncológico regional sul (ROR-sul) 27

28 Portugal Dados ROR sul homens Topografia Taxa bruta Taxa padrão Europa Amigdala (C09) Taxa padrão mundial Taxa bruta mulheres Taxa padrão Europa Taxa padrão mundial 1,06 1,05 0,00 0,04 0,04 0,03 Lingua 4,54 4,09 3,02 1,14 0,83 0,57 Taxa de incidência - região sul de Portugal Editado por registo oncológico regional sul (ROR-sul) 28

29 Casuística do IPOLFG 2,6% 0,5% LINGUA 12,7% GENGIVA MANDIBULA 16,1% 54,4% MUCOSA JUGAL PAVIMENTO INESPECIFICOS 4,7% 2,6% 6,3% AMIGDALA OROFARINGE 29

30 HPV prevalence 30

31 Patients chart flow 78 patients Lesion in oropharynx consumption habits (+) n=62 consumption habits (-) n=12 Without information regarding consumption habits n=4 28 HPV (+) 31 HPV (-) 6 HPV (+) 6 HPV (-) 2 HPV (+) 2 HPV (-) 28 OPSCC(+) 20 OPSCC(+) 11 OPSCC(-) 5 OPSCC(+) 1 OPSCC(-) 2 OPSCC(+) 4 OPSCC(-) 2 OPSCC (-) 1 OPSCC (+) 1 OPSCC (-) High HPV prevalence in presence of tobacco and alcohol consumption habits 31

32 Conclusões: Importância dos diferente factores de risco na historia clínica do paciente: Detecção do HPV: identificação de genótipos de alto risco Hábitos de consumo: frequência e quantidade Abordagem terapêutica diferente: Status do HPV e hábitos de consumo (ensaios clínicos) A prevalência do HPV nos tumores da Cabeça e Pescoço é semelhante as restantes publicações (47% na região da Orofaringe) 32

33 A infecção por HPV é um factor de risco para o desenvolvimento do carcinoma da orofaringe, mas a sua história natural é ainda pouco conhecida. Com este estudo pretendemos determinar qual a relevância do HPV na nossa população: 79.5% com hábitos de consumo 45% com HPV positivo 33

34 Agradecimentos A equipa laboratório de virologia 34