MF-456.R-0 - MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DO EFEITO AGUDO LETAL CAUSADO POR EFLUENTES LÍQUIDOS EM PEIXES DA ESPÉCIE BRACHYDANIO RERIO - MÉTODO ESTÁTICO.

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1 MF-456.R-0 - MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DO EFEITO AGUDO LETAL CAUSADO POR EFLUENTES LÍQUIDOS EM PEIXES DA ESPÉCIE BRACHYDANIO RERIO - MÉTODO ESTÁTICO. Notas: Aprovado pela Deliberação CECA nº 3 077, de 25 de janeiro de 1994, publicada no DOERJ de 25/01/94 1 OBJETIVO Estabelecer o método de determinação do efeito agudo letal causado por efluentes líquidos industriais em peixes da espécie Brachydanio rerio. 2 DOCUMENTOS DE REFERÊNCIA Documentos aprovados pela Comissão Estadual de Controle Ambiental - CECA e publicados no Diário Oficial do Estado do Rio Janeiro: - NT Critérios e Padrões para Lançamento de Efluentes Líquidos; - NT Critérios e Padrões para Controle da Toxidade em Efluentes Líquidos Industriais; - JN Justificativa Técnica da NT-213.R-4 - Critérios e Padrões para Controle da Toxidade em Efluentes Líquidos Industriais; - MF Método de Coleta de Amostras de Efluentes Líquidos Industriais; - MF Método de Determinação do Efeito Agudo Letal Causado por Agentes Tóxicos em Peixes da Espécie Brachydanio rerio - Método Estático; - DZ Diretriz do Programa de Autocontrole de Efluentes Líquidos - PROCON ÁGUA. 3 DEFINIÇÕES Para efeito deste documento são consideradas as definições. 3.1 Toxicidade - capacidade de um efluente líquido provocar um efeito observável em um organismo aquático vivo. 3.2 Toxicidade Aguda - toxicidade em que os efeitos nos organismos testes são observados em curto período de tempo, de no máximo, 96 horas. 3.3 Teste de Toxicidade - teste padronizado no qual organismos aquáticos vivos são utilizados para detectar a toxicidade de um efluente líquido.

2 3.4 Concentração Letal Média - CL50 - concentração nominal do efluente líquido que causa efeito letal em 50% dos peixes, durante o período do teste. 3.5 Concentração de Efeito Não Observado - CENO - maior concentração de um efluente líquido que não causa efeito letal nos peixes, no período de teste; e é expressa em porcentagem de efluente líquido na solução-teste. 3.6 Número de Unidade de Toxicidade ou fator de Diluição-UT - definido pela fórmula: UT = 100/CENO 3.7 UTP - número de unidades de toxidade, tendo como referência os testes em peixes. 4 PRINCÍPIO DO MÉTODO A sensibilidade de organismo aos efeitos dos agentes tóxicos pode variar consideravelmente de uma espécie para outra, devido à diferenças em seus metabolismo e à natureza de seus "habitats". Os peixes são utilizados como indicadores desses efeitos há mais de um século. Entretanto, as espécies de peixes a serem utilizadas devem atender a determinados critérios, a saber: - relativamente sensíveis à substâncias tóxicas; - de tamanho adequado para teste; - bastante conhecidas e estudadas biologicamente; - de fácil manutenção em laboratório, incluindo: resistência ao transporte, baixa susceptibilidade a doenças e possibilidade de reprodução em laboratório; - facilmente adquiridos no comércio e disponíveis em abundância durante todo o ano; Baseado nessas características o método determina o efeito letal causado por efluentes líquidos industriais em peixes da espécie Brachydanio rerio. 5 RESUMO DA TÉCNICA O método consiste na exposição de indivíduos jovens da espécie Brachydanio rerio à várias concentrações de efluentes líquidos, sem renovação das soluções, por um período contínuo de 48 horas, sob condições controladas de temperatura, OD e fotoexposição. Tal procedimento permite determinar a maior concentração do efluente que não causa efeito letal aos organismo testados (CENO). O efeito tóxico é expresso em Número de Unidades de Toxicidade ou Fator de Diluição do Efluente (UT). 6 APLICABILIDADE Este método se aplica a efluentes líquidos industriais. Não é aplicável a efluentes com salinidade superior a 5g/Kg.

3 7 INTERFERÊNCIAS Efluentes líquidos contendo substâncias voláteis e degradáveis dificultam a determinação de toxicidade. Nesses casos, recomenda-se adotar método com sistemas de fluxo contínuo ou renovação periódica (Ref e 15.6). Efluentes líquidos com alto teor de sólidos em suspensão, alto consumo de oxigênio dissolvido, ph menor que 5,0 e maior que 9,0, óleos, graxas e salinidade, provocam variações nos resultados, que serão incluídas na avaliação da toxicidade. 8 APARELHAGEM E MATERIAIS 8.1 Os aparelhos, vidrarias e materiais necessários são: - balança analítica com precisão de 0,1mg; - salinômetro/condutivímetro com sensibilidade de 0,1uS/cm; - medidor de oxigênio dissolvido; - medidor de ph; - compressores de diafragma para aeração; - balões volumétricos de 500 ml, 1000 ml e 2000 ml; - provetas de 50 ml, 100 ml, 500 ml e 2000 ml; - pipetas Pasteur - pipetas tipos Mohr de 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml; - béqueres de 50 ml, 100 ml, 500 ml, 1000 ml; - recipientes para teste : béqueres ou cubas de vidro neutro de 3000 a 4000 ml; - aquários de 50 l para aclimatação; - depósitos de água de material inerte (PVC, polipropileno, vidro neutro, fibra de vidro, etc.) de 50 l ou 100 ml; - Testes de aquariofilia - Mangueiras de material atóxico (silicone, "Tygon", etc). 8.2 Todo material que entre em contato com as amostras do efluente deve ser quimicamente inerte. 8.3 A vidraria antes de ser utilizada nos testes, deve ser lavada na seguinte seqüência: detergente, água de torneira, acetona pura, água de torneira, ácido nítrico a 5%, água de torneira e água destilada. 9 PRODUTOS QUÍMICOS, SOLUÇÕES E ÁGUA DE DILUIÇÃO 9.1 PRODUTOS QUÍMICOS a) Bicarbonato de Sódio (NaHCO 3 ) PA; b) Sulfato de Cálcio dihidratado (CaSO 4.2H 2 O) PA; c) Sulfato de Magnésio Heptahidratado (MgSO 4.7H 2 O) PA; d) Cloreto de Potássio (KCl) PA; e) Dicromato de Potássio (K2Cr 2 O 7 ) PA; f) Acetona PA; g) Ácidos Nítrico PA;

4 9.2 SOLUÇÕES a) Solução de ácido clorídrico, 1N; b) Solução de Hidróxido de sódio, 1N; c) Solução de ácido nítrico a 5%; 9.3 ÁGUA PARA DILUIÇÃO DO EFLUENTE LÍQUIDO A diluição do efluente líquido pode ser feita com água potável ou com água reconstituída. A água de diluição tem que permitir que os peixes, a serem utilizados nos testes possam nela sobreviver no período de aclimatação sem mostrarem sinais de estresse, tais como : descoloração, falta de apetite ou outras mudanças de comportamento. a) Água potável A água potável para ser usada como água de diluição deve ter as seguintes características: - isenta de cloro; - valores de dureza e alcalinidade dentro das faixas de 20mg/l a 48mg/l em CaCO 3 e, 8mg/l a 35mg/l em CaCO 3, respectivamente, para que haja compatibilidade entre os testes; - qualidade constante, isto é, as medidas de dureza e alcalinidade não devem ultrapassar 10% das médias mensais e a faixa de variação de ph, deve ser inferior a 0,4; - concentração de oxigênio dissolvido numa faixa de 90% a 100% da saturação, obtida através de pré-aeração; b) Água reconstituída No preparo da água reconstituída deve-se utilizar água deionizada ou destilada com condutividade inferior à 5uS/cm. Para cada litro de água reconstituída dissolver 48,0mg de bicarbonato de sódio; 30,0mg de sulfato de cálcio; 61,5mg de sulfato de magnésio e 2,0mg de cloreto de potássio. Aerar, no mínimo, por 24 horas obtendo-se os seguintes valores de parâmetro: ph de 7,2 a 7,6; dureza de 40 a 48mg/l CaCO 3 ; alcalinidade de 30 a 35mg/l CaCO 3 e OD entre 90% e 100% de saturação. Se necessário, corrigir as concentrações de ph, dureza e alcalinidade. 10 AMOSTRA DO EFLUENTE LÍQUIDO 10.1 A amostra do diluente líquido deve ser mantida à temperatura em torno de 4ºC para sua utilização em, no máximo, 48 horas ou a temperatura menor ou igual a 12ºC por um período máximo de 7 dias, após o qual a amostra perde a validade O volume de amostra necessário dependerá da toxicidade do efluente líquido e da necessidade de repetição do teste. São coletados normalmente 5 litros de amostra.

5 10.3 Os frascos utilizados para coleta de amostra devem ser de material quimicamente inerte É necessário que alguns parâmetros e características do efluente sejam determinados e observados no momento da coleta, tais como: ph, temperatura, oxigênio dissolvido, salinidade, sólidos, cor, presença de óleo, vazão e outros. Anotar esses dados na Ficha de Coleta As mesmas determinações e observações feitas no momento da coleta devem ser repetidas em laboratório, a temperatura do teste, imediatamente antes do preparo das soluções-testes e anotadas na Ficha de Controle (Anexo 2). 11 ORGANISMO-TESTE Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan),Teleostei, Cyprinidae. Esta espécie é comumente conhecida como "Paulistinha" ou "Peixe Zebra". Outras espécies podem ser utilizadas no teste desde que atendam aos critérios descritos no item 4. Podem ser obtidos a partir do cultivo em laboratório (ref.15.4) ou adquiridos em pisciculturas ornamentais, que tenham condições de fornecer peixes com a qualidade adequada e na quantidade necessária. 12 PREPARO DOS PEIXES PARA O TESTE 12.1 Os peixes a serem usados no teste devem ser provenientes de um mesmo recipiente de estocagem. Para a manutenção dos peixes em estoque no laboratório, seguir as instruções contidas no Anexo Selecionar, entre os peixes em estoque, os indivíduos jovens da espécie com comprimento total de 30 mm + 5 mm e peso de 0,3 g + 0,1g. Os peixes selecionados não devem apresentar sintomas de doenças ou má formação visíveis e o lote deve ser mais homogêneo possível No caso de utilizar água potável para estocagem de peixes e água reconstituída para diluição do efluente, os peixes devem ser aclimatados de 24 a 48 horas na água reconstituída, antes do teste Suspender a alimentação nas 24 horas que precedem o teste AFERIÇÃO DAS CONDIÇÕES DOS PEIXES Cada lote de peixes devem ser previamente avaliado, de modo a aferir suas condições para utilização no teste. Para isso é efetuado um teste preliminar utilizando uma substância de referência. Dentre as substâncias indicadas, o dicromato de potássio apresenta a vantagem de ser, de fácil manipulação; não biodegradável, não volátil; altamente solúvel em água e disponível em alto grau de pureza. No teste os peixes são expostos à várias concentrações de dicromato por 96 horas e, para que o lote seja aprovado CL50 deve estar entre 70 e 140mg/l, após esse tempo.

6 Para desenvolvimento do teste de sensibilidade seguir os procedimentos descritos no capítulo 13 do método MF-455.R PROCEDIMENTOS 13.1 LOCAL DE TESTE O local de teste deve ser independente dos locais de lavagem de material e estocagem de peixes, isento de gases tóxicos, poeiras e vibrações, com temperatura controlada para manter as soluções-teste na faixa de 24ºC + 1ºC e fotoperíodo de 12 a 16 horas de luz PREPARO DAS SOLUÇÕES-TESTES As soluções-testes devem ser preparadas em local apropriado à temperatura de 24 ºC + 1 ºC. Para diluição das amostras deve ser usada água potável ou água reconstituída, preparadas conforme instruções constantes do item Medir o ph, o OD, a temperatura e a condutividade ou salinidade do efluente e anotar na Ficha de Controle (Anexo 2). Outras determinações e observações efetuadas por ocasião da coleta devem ser também repetidas e anotadas Preparar 2000 ml de cada solução-teste, em recipientes de 3000 a 4000 ml, diluindo a amostra de acordo com a série geométrica apresentada na Tabela: SÉRIE DE DILUIÇÕES PARA TESTES COM EFLUENTES LÍQUIDOS Partes da Água de Diluição Partes de Efluentes Líquidos Fator de Diluição (UT) , , , , , , , ,78 Concentração (%) O número de soluções-testes e a faixa de concentração a ser utilizadas dependerá da toxicidade do efluente. São normalmente utilizada de 4 a 6 soluções com concentrações entre 100% e 3,12% Medir o ph, o OD, a temperatura e a condutividade ou salinidade de cada solução-teste e da água de diluição que será usada como controle e anotar na Ficha de Controle (Anexo 2).

7 13.3 DESENVOLVIMENTO DO TESTE Transferir, utilizando redes macias de aquariofilia, 5 (cinco) peixes para cada recipiente, contendo a solução-teste e para o recipiente de controle, contendo 2000 ml da água de diluição Manter os peixes nos recipientes, sem alimentação, durante o período de 48 horas, observando: a) as condições das soluções-testes: - temperatura na faixa de 24ºC + 1ºC; - nível mínimo de OD em 60% da saturação. Se necessário, aerar, utilizando pipetas Pasteur e compresssor de diafragma; b) o fotoperíodo de 12 a 16 horas de luz Medir, a cada 24 horas, o ph, o OD, a temperatura e a condutividade de cada solução-teste e do controle anotando esses números na Ficha de Controle. Anotar também o número de peixes mortos em cada solução-teste Retirar os peixes mortos, observados no decorrer do teste. Um peixe é considerado morto quando não esboça mais nenhum movimento, mesmo quando tocado O teste deve ser realizado sem ajuste de ph. Se houve mudanças significativas de ph no decorrer do teste, este deve ser repetido com o ph corrigido. Neste caso, ajustar o ph da solução-estoque para o mesmo valor do ph da água de diluição, usando soluções de ácido clorídrico ou hidróxido de sódio (itens 9.2 "a" e "b"). O ajuste do ph só deve ser feito se não causar alterações na concentração do agente tóxico nas soluções, provocadas por diluição, reações, precipitação e decomposição. Recomenda-se que sejam realizados dois testes em paralelo, um com ph corrigido e outro com ph sem corrigir No caso de amostras com alto consumo de OD devem ser realizados dois testes em paralelo: um aerado e outro não gerado. OBSERVAÇÃO: Os peixes que sobreviverem ao teste não podem ser usados em outros ensaios. 14 RESULTADOS 14.1 DETERMINAÇÃO DA CENO E UTp A CENO é determinada a partir dos dados de mortes observados nos testes e a UT p, pelo fator de diluição correspondentes, em número inteiro. Ex.: CENO = 6,25% UTp = 16

8 14.2 VALIDADE DOS RESULTADOS O testes será considerado válido se não ocorrer nenhuma morte ou anormalidade nos peixes do controle RELATÓRIO No relatório do teste deverão constar as informações : a) método utilizado; b) identificação da amostra; c) data da realização do teste; d) dados Biológicos e físico-químicos relativos ao teste; e) resultados expressos em CENO e UTp; f) qualquer comportamento anormal dos peixes nas condições do teste; g) modificações introduzidas no método e eventuais ocorrência durante a realização do teste. 15 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 15.1 ASSIM - AMERICAN SOCIETY FOR TESTIN MATERIALS. Proposed standards pratice for conductino acute toxicity test wiht fishes, macroinvertebrates and amphibians. Philadelphia, PA, 1979 (Draft ) 15.2 Standard guide for conducting acute toxicity tests on aqueous effluents with fishes, macroinvertebrates, and amphibians. ANN. Book of ASTM Standards. Philadelphia, PA, 11(4) , DIN. DEUTSCHES INSTITUT FOR NORMUNG. Bestimung der akuten fischgiftigkeit von abwassern. Berlim, v. (DIN L.31) 15.4 ISO INTERNATIONAL STANDARD ORGANIZATION. Qualité de l'eau. Determination de la toxicité aigue létale de substances vis-àvis d'un poisson d'eau douce Brachylanio rerio ( Hamilton-Buchanan) Teleostei, Cyprinidade - Partie 1 : Méthode Statique. Genebra (ISO/DIS 7346/1) Partie 2: Méthode Semi-statique (ISO/DIS 7346/2) Partie 3: Méthode avec renouvellement continu (ISO/dis 7346/3) W.Q.J WATER QUALITY INSTITUTE. The EEC-ring-test on determination of acute toxicity to Zebra-Fish (Brachydanio rerio and Daphnia (Daphnia Magna). Denmark, 1979 ( ).

9 ANEXO 1 MANUTENÇÃO DE ESTOQUE DE PEIXES 1 ESPÉCIE Brachyganio rerio (Paulistinha). 2 CONSIDERAÇÕES GERAIS 2.1 Os peixes cultivados em laboratório ou adquiridos no comércio devem ser mantidos em recipientes apropriados, tais como: aquários, caixas d'água revestidas com resina epoxi e caixas de PVC. O volume dos recipientes dependerá do número de testes programados, obedecendo a uma densidade máxima de 3 peixes por litro ou 1 g de peixe por litro. 2.2 É recomendável que a água para estoque e aclimatação dos peixes seja a mesma a ser utilizada nos testes, obedecendo aos requisitos constantes do item 9.3, descritos anteriormente neste método. 2.3 O fluxo de água recomendado nos recipientes deve ser, no mínimo, de uma vez o volume dos mesmos, por dia. Pode-se utilizar circulação de água em círculo fechado, com filtração e renovação periódica quando se notar alterações significativas na sua composição físico-química. A concentração de OD deve ser de, no mínimo, 60% da saturação. Usar aeração, se necessário. 2.4 O local de estocagem dos peixes deve possuir um sistema para manutenção da temperatura das caixas na faixa de 24 ºC + 1 ºC, ser isento de gases tóxicos, vibrações e ter dispositivos (Timer) para manter o fotoperíodo de 12 a 16 horas de luz. 2.5 Os peixes devem ser alimentados 2 vezes ao dia com ração de boa qualidade utilizada em aquariofilia e, se possível, complementar com alimentos vivos (Artemia salina, Daphnia sp, etc.). Os peixes a serem utilizados não devem ser alimentados nas 24 horas que precedem os testes. 2.6 Manter os recipientes de estoque em condições de higiene adequados, sifonando restos de ração e dejetos dos peixes, mantendo a água sem turbidez, sempre cristalina. Formação de algas nas laterais e no fundo não causa problemas. 2.7 No caso de descarte de lotes de peixes, por qualquer motivo, os recipientes devem ser limpos e desinfetados da seguinte maneira. a) lavar bem o recipiente com água corrente e escova para desprender o material aderido e retirar todo o resíduo ; b) passar, por toda a superfície interna do recipiente, um pano limpo embebido em solução de hipoclorito de sódio contendo 100ppm de cloro livre e aguardar 1 hora;

10 c) lavar novamente com água corrente até que a mesma não apresente qualquer residual de cloro. 2.8 Observar bem os peixes durante o período de aclimatação (duas semanas). Os peixes não devem apresentar sintomas de doenças ou qualquer comportamento anormal e o número de mortes não deve exceder a 10%. Observando-se mortalidade acima de 10% ou anormalidade significativa, o lote deve ser descartado. São sintomas anormais mais comuns: natação errática, falta de apetite, pontos brancos, emagrecimento, fungos tipo flocos de algodão, pigmentação anormal, perda de muco. Essas considerações servem também para todo o período em que os peixes são mantidos em estoque para testes. Peixes adquiridos em boa empresa de piscicultura ou bem cultivados em laboratório e mantidos nas condições recomendáveis, geralmente não dão problemas. 3 PROGRAMAÇÃO DE ESTOQUE Dias _ _ Legenda : l n - Entrada de lotes novos l n - Descarte de lote correspondente (se sobrar) - Aclimatação dos lotes correspondentes. O prazo máximo recomendado para manutenção dos peixes em estoque é de 2 meses, após esse período, usar os peixes do lote seguinte.

11 4 SUGESTÕES PARA MANUTENÇÃO DE ESTOQUE 4.1 CIRCUITOS DE ÁGUA a) Aberto b) Fechado REDE Filtro de areia Filtro com elementos 5u Filtro de carvão ativado Recipiente de Estoque ESGOTO REDE Filtro de areia Filtro com elementos 5u Filtro de carvão ativado Recipiente de Estoque 4.2 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Para seleção e projeto dos equipamentos deve-se levar em conta a quantidade de peixes a ser estocada e a vazão de água necessária. 4.3 FILTRO DE AREIA Pode ser construído em PVC com sistema de retro-lavagem ou adquirido no comércio 4.4 Filtro tipo CUNO com elementos à base de celulose e porosidade de 5u. Podem ser instalados 2 ou mais filtros em paralelo, dependendo da vazão. 4.5 Filtro de carvão ativado Pode ser construído em PVC, com sistema de retro-lavagem ou adquirido no comércio. 4.6 Bomba de aquário ou compressor de diafragma. Compressores que utilizam óleos não podem ser usados. 4.7 Caixa d'água com capacidade de 200 ou 500 litros, revertida internamente com resina epoxi. Exemplo na Figura 1.

12 OBS - PODEM SER INSTALADAS DUAS OU MAIS, EM SÉRIE FIGURA 1 - CAIXAS D'ÁGUA PARA ESTOQUE DE PEIXES.

13 ANEXO 2 (ANVERSO)

14 ANEXO 2 (VERSO)