CÂMPUS DE JABOTICABAL FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS DEPARTAMENTO DE FITOSSANIDADE ECOTOXICOLOGIA

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1 unesp UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA CÂMPUS DE JABOTICABAL FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS DEPARTAMENTO DE FITOSSANIDADE ECOTOXICOLOGIA 13a. Aula Ecotoxicologia Aquática: Teste de Ecotoxicidade para peixes Dr. Joaquim Gonçalves Machado Neto - Maio/2018

2 13a. Aula Ecotoxicologia Aquática / Teste de Ecotoxicidade para peixes 1 Introdução 2 - Testes de avaliação da toxicidade aguda e crônica e de bioconcentração de agrotóxicos com peixes. PRÁTICA: Resultados do ensaio da aula prática de toxicidade aguda de agrotóxicos para peixes.

3 Portaria Normativa N. 84 (15/10/96) IBAMA. Anexo IV - PARTE D TOXICIDADE PARA ORGANISMOS NÃO-ALVO D.1 Microorganismos. D.2 Algas. D.3 Organismos do solo (minhocas) D.4 Abelhas. D.5 Microcrustáceos. D.5.1 Agudo. D.5.2 Crônico D.6 -- Peixes. D.6.1 Agudo. D.6.2 Crônico. D.7 Bioconcentração em peixes. D.8 Aves. D.8.1 Dose única. D.8.2 Dieta. D.8.3 Reprodução. D.9 Plantas. D.9.1 Fitotoxicidade para plantas não-alvo

4 NORMAS DA ABNT PARA PEIXES ABNT NBR 12716:1993 Água - Ensaio de toxicidade aguda com peixes - Parte III - Sistema de fluxo contínuo - Método de ensaio. ABNT NBR 15088: Ecotoxicologia aquática - Toxicidade aguda - Método de ensaio com peixes (Cyprinidae), que revisa a norma ABNT NBR 15088:2011 ABNT NBR 15499: Ecotoxicologia aquática - Toxicidade crônica de curta duração - Método de ensaio com peixes. Emenda 1, de , em conjunto com a ABNT NBR 15499:2015, equivale à ABNT NBR 15499:2016.

5 TOXICIDADE AGUDA PARA PEIXES Número do teste no manual do IBAMA: D.3.1. OBJETIVO: Avaliar a toxicidade aguda para espécies de peixes. FUNDAMENTO: Exposição de peixes a várias concentrações em sistema de fluxo contínuo por 96 h. Determina-se a Concentração Letal Inicial Média - CL(I)50 96h. ACLIMATAÇAO

6 TOXICIDADE AGUDA PARA PEIXES Número do teste no manual do IBAMA: D.3.1. CONCENTRAÇÃO LETAL INICIAL MÉDIA - CL(I)50-96 h: Concentração nominal do agente químico que causa efeito agudo (letalidade) a 50% dos organismos-teste em 96 h de exposição. TESTE PRELIMINAR: Determinar o intervalo de dosagem letal (0 e 100%). ESPÉCIES : Danio rerio (Cyprinidae) - paulistinha Poecilia reticulata (Poeciliidade) guarú

7 TOXICIDADE AGUDA PARA PEIXES Número do teste no manual do IBAMA: D.3.1. CONDIÇÕES DO TESTE: Água mole, Método estático, semiestático e de fluxo contínuo. 1 g de peixe / L, fotoperíodo de 11 h de luz, temperatura de 23 1ºC. SUBSTÂNCIA DE REFERÊNCIA: K 2 Cr 2 O 7, testes mensais, CL (I)50 24h = 2 x desvio padrão. AVALIAÇÃO: Diária, observando-se o comportamento, deformações e mortalidade, até 96 h.

8 TOXICIDADE AGUDA PARA PEIXES Número do teste no manual do IBAMA: D.3.1. CONTROLE DE QUALIDADE: Organismos-teste: Lotes diferentes fazer teste de toxicidade aguda com 24 h, com uma substância de referência. Culturas de laboratório por longos períodos: fazer teste de toxicidade aguda 24 h pelo menos uma vez por mês. CL(I)50 24h = ± 2 D.P. (Desvio Padrão) em relação aos valores médios anteriores.

9 TOXICIDADE AGUDA PARA PEIXES Número do teste no manual do IBAMA: D.3.1. CONTROLE DE QUALIDADE: Culturas de laboratório por longos períodos: fazer teste de toxicidade aguda 24 h pelo menos uma vez por mês. CL(I)50 24h = ± 2 D.P. em relação aos valores médios anteriores. Poecilia reticulata - K 2 Cr 2 O 7 Concentração (mg.l -1 ) Testes CL 50 Média

10 TOXICIDADE AGUDA PARA PEIXES Número do teste no manual do IBAMA: D.3.1. CONTROLE DE QUALIDADE: Do Organismo-teste: A letalidade e ou proporção de peixes com comportamento anormal no lote < 5% em 48 h antes do teste. Do teste: - O 2 dissolvido 40% do valor da saturação H Letalidade e ou comportamento anormal no controle < 10%.

11 Aquário de aclimatação de peixes em sala climatizada e substrato para testes de toxicidade de agrotóxicos.

12 Teste de toxicidade aguda de agrotóxicos para peixes em sala climatizada.

13 Teste de toxicidade aguda de agrotóxicos para peixes em sala climatizada.

14 100 Tilápia vermelha 100 Guaru 50 y = 0,4212x - 4,5714 mortalidade (%) 50 y = 225,65x + 27,826 R 2 = 0,9813 R 2 = 0,9361 CL50 = 129,21 mg/l CL50 = 0,1 mg/l ,05 0,1 0,15 concentrações (mg de oxicoreto de cobre/l) concentrações (mg de oxicloreto de cobre/l) Curvas de regressão linear entre concentrações de oxicloreto de cobre e porcentagem de mortalidade de tilapia vermelha e guaru, em água mole (Boock, 1998).

15 y = -8,5172x ,6 R 2 = 0,9427 Tilápia vermelha ,1 0,2 0,3 0,4 concentrações (mg de cobre/l) bioconcentração (ug/g) Guaru y = 19,544x + 0,2342 R 2 = 0,9973 concentrações (mg de cobre/l) Valores de cobre acumulado ( g/g) em tilápia vermelha e guaru durante o teste definitivo de toxicidade aguda de oxicloreto de cobre em 96 hs em águas mole (Boock, 1998).

16 100 Mortalidade (%) 50 H 2 O mole y = 43,89 + 4,05x R 2 = 0,3988 CL (l) 50-96h = 1,43 ppm H 2 O represa y = - 22, ,21x R 2 = 0,8443 CL (l) 50-96h = 3,31 ppm Concentrações (mg/l) Curvas de regressão linear entre concentrações de parathion methyl e porcentagem de mortalidade de guarú, em águas mole reconstituída e de represa. (Ferreira, 1998).

17 AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA CRITÉRIO PARA A CLASSIFICAÇÃO DA PERICULOSIDADE DOS AGROTÓXICOS PARA PEIXES (GUIMARÃES, 1996). CLASSE I - CL 50-96h < 0,1 ppm; CLASSE II - CL 50-96h > 0,1 a 10 ppm; CLASSE III - CL 50-96h > 10,0 a 100 ppm; CLASSE IV - CL 50-96h > 100 ppm. Obs: Esta classificação pode ser aplicada para periculosidade avaliada tanto em substrato neutro (água reconstituída) ou água natural utilizada na criação de peixes.

18 AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA CRITÉRIO PARA A CLASSIFICAÇÃO DA PERICULOSIDADE DOS AGROTÓXICOS PARA PEIXES (GUIMARÃES, 1996). GUARÚ: Parathion-methyl: CL 50-96h Água mole = 1,43 ppm Água de represa = 3,31 ppm Trichlorfon: CL 50-96h Água mole = 4,98 ppm Água de represa = 7,36 ppm Todos os valores são classificados na Classe II CLASSE II - CL 50-96h > 0,1 a 10 ppm;

19 Toxicidade aguda diferencial do parathion methyl para espécies aquáticas. ESPÉCIE EXP (h) CL 50 (mg/l) Referência Brachydanio rerio 96 2,26 WIJK & KRAAIJ (1994) Channa orientalis 72 4,88 SHEREKAR & KULKARNI (1989) Daphnia magna 24 0,009 KUNGOLOS et al. (1999) Daphnia magna 48 0,002 KUNGOLOS et al. (1999) Fathead minnow 96 8,90 POST (1987) Heteropneustes fossilis 96 10,00 JAMES & SAMPATH (1994) Largemouth bass 96 5,22 POST (1987) Neomysis mercedis 96 0,20 BRANDT et al. (1993) Rainbow trout 96 2,70 TOMILIN (1995) Rainbow trout 96 2,75 POST (1987) Selenastrum sp 48 0,047 KUNGOLOS et al. (1999) Tubifex tubifex 96 0,60 SUSEELA et al. (1994) Vibrio fischeri 48 2,20 KUNGOLOS et al. (1999)

20 Concentrações ambientais estimadas (CAEs) na profundidade de 15 cm em diluições de 100%, 50%, 25%, 12,5%; 6,25% e 3,125% das maiores e menores doses dos inseticidas parathion-methyl e trichlorfon e riscos da contaminação ambiental para GUARU, água de represa (FERREIRA, 1998). Produto Dosagens Dosagens Porcentagem CAE Risco Ambiental L p.c.*/ha kg i.a.**/ha da dose mg/l 0,25 0,15 100,00 (%) 0,100 Moderado 0,25 0,15 50,00 0,050 Moderado 0,25 0,15 25,00 0,025 Baixo Parathion methil 0,25 0,15 12,50 0,0125 Baixo 0,25 0,15 6,25 0,00624 Baixo 0,25 0,15 3,13 0,00312 Baixo 1,00 0,60 100,00 0,4 Risco potencial 1,00 0,60 50,00 0,2 Moderado 1,00 0,60 25,00 0,1 Moderado 1,00 0,60 12,50 0,05 Moderado 1,00 0,60 6,25 0,025 Baixo 1,00 0,60 3,13 0,0125 Baixo Trichlorfon 0,42 0,21 100,00 0,14 Moderado 0,42 0,21 50,00 0,07 Baixo 0,42 0,21 25,00 0,035 Baixo 0,42 0,21 12,50 0,0175 Baixo 0,42 0,21 6,25 0,00875 Baixo 0,42 0,21 3,13 0,00438 Baixo 2,40 0,21 100,00 0,8 Risco potencial 2,40 1,20 50,00 0,4 Moderado 2,40 1,20 25,00 0,2 Moderado 2,40 1,20 12,50 0,10 Moderado 2,40 1,20 6,25 0,05 Baixo 2,40 1,20 3,13 0,025 Baixo * litros de produto comercial ** quilos de ingrediente ativo

21 Concentrações ambientais estimadas (CAEs) na profundidade de 30 cm em diluições de 100%, 50%, 25%, 12,5%; 6,25% e 3,125% das maiores e menores doses dos inseticidas parathion-methyl e trichlorfon e riscos da contaminação ambiental para guaru, água de represa (FERREIRA, 1998). Produto Dosagens Dosagen Porcentagem CAE Risco L p.c.*/ha kg i.a.**/ha da dose mg/l Ambiental 0,25 0,15 100,00 (%) 0,05 Moderado 0,25 0,15 50,00 0,025 Baixo 0,25 0,15 25,00 0,0125 Baixo Parathion Methyl 0,25 0,15 12,50 0,00625 Baixo 0,25 0,15 6,25 0, Baixo 0,25 0,15 3,13 0,00156 Baixo 1,00 0,60 100,00 0,2 Moderado 1,00 0,60 50,00 0,1 Moderado 1,00 0,60 25,00 0,05 Moderado 1,00 0,60 12,50 0,025 Baixo 1,00 0,60 6,25 0,0125 Baixo 1,00 0,60 3,13 0,00625 Baixo Trichlorfon 0,42 0,21 100,00 0,07 Baixo 0,42 0,21 50,00 0,035 Baixo 0,42 0,21 25,00 0,075 Baixo 0,42 0,21 12,50 0,00875 Baixo 0,42 0,21 6,25 0, Baixo 0,42 0,21 3,13 0, Baixo 2,40 0,21 100,00 0,4 Moderado 2,40 1,20 50,00 0,2 Moderado 2,40 1,20 25,00 0,1 Moderado 2,40 1,20 12,50 0,05 Baixo 2,40 1,20 6,25 0,025 Baixo 2,40 1,20 3,13 0,025 Baixo litros de produto comercial por hectare ** quilos de ingrediente ativo por hectare

22 Concentrações ambientais estimadas (CAEs) na profundidade de 2,0 m nas alíquotas de 100%, 50%, 25%, 12,5%; 6,25% e 3,125% das maiores e menores doses dos inseticidas parathion-methyl e trichlorfon e riscos da contaminação ambiental para guaru, água de represa (FERREIRA, 1998). Produto Dosagens Dosagens Porcentagem CAE Risco Ambiental L p.c.*/ha kg i.a./ha da dose mg/l 0,25 0,15 100,00 (%) 0,0075 Baixo 0,25 0,15 50,00 0,00375 Baixo 0,25 0,15 25,00 0, Baixo 0,25 0,15 12,50 0, Baixo 0,25 0,15 6,25 0, Baixo 0,25 0,15 3,13 0, Baixo Parathion Methyl 1,00 0,60 100,00 0,03 Baixo 1,00 0,60 50,00 0,015 Baixo 1,00 0,60 25,00 0,0075 Baixo 1,00 0,60 12,50 0,00375 Baixo 1,00 0,60 6,25 0, Baixo 1,00 0,60 3,13 0, Baixo 0,42 0,21 100,00 0,0109 Baixo 0,42 0,21 50,00 0,00525 Baixo 0,42 0,21 25,00 0, Baixo 0,42 0,21 12,50 0, Baixo 0,42 0,21 6,25 0,00066 Baixo 0,42 0,21 3,13 0,00033 Baixo Trichlorfon 2,4 0,21 100,00 0,06 Baixo 2,4 1,2 50,00 0,03 Baixo 2,4 1,2 25,00 0,015 Baixo 2,4 1,2 12,50 0,0075 Baixo 2,4 1,2 6,25 0,00375 Baixo 2,4 1,20 3,13 0, Baixo * litros de produto comercial ** quilos de ingrediente ativo

23 TOXICIDADE CRÔNICA PARA PEIXES Número do teste no manual do IBAMA: D.3.2. OBJETIVO: Avaliar a toxicidade crônica de agentes químicos durante os estágios larvais de peixes. FUNDAMENTO: Exposição de larvas de peixes recém-eclodidas, em sistema de fluxocontínuo por 7 dias. Avalia-se os efeitos deletérios à sobrevivência e/ou crescimento (peso).

24 CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS: Fotoperíodo de 11 h de luz, 25 2ºC, fluxo contínuo, ou semi-estático (renovação da água em 24 h). AVALIAÇÕES: TOXICIDADE CRÔNICA PARA PEIXES Número do teste no manual do IBAMA: D.3.2. CONCENTRAÇÃO DE EFEITO NÃO OBSERVADO (CENO): É a maior concentração nominal do agente tóxico que não causa efeito deletério estatisticamente significativo na sobrevivência e reprodução em 7 dias de exposição.

25 TOXICIDADE CRÔNICA PARA PEIXES Número do teste no manual do IBAMA: D.3.2. CONCENTRAÇÃO DE EFEITO OBSERVADO (CEO): É a menor concentração nominal do agente tóxico que causa efeito deletério estatisticamente significativo na sobrevivência e reprodução em 7 dias de exposição. VALOR CRÔNICO (VC): Média geométrica dos valores CENO e CEO. CONCENTRAÇÃO EFETIVA (CE50) : Concentração nominal do produto que causa efeito deletério a 50% dos organismos-testes em um tempo de exposição.

26 TOXICIDADE CRÔNICA PARA PEIXES Número do teste no manual do IBAMA: D.3.1. CONTROLE DE QUALIDADE: Organismos-teste: Lotes diferentes fazer teste de toxicidade aguda com 24 h, com uma substância de referência. Culturas de laboratório por longos períodos: fazer teste de toxicidade aguda 24 h pelo menos uma vez por mês. CL(I)50 24h = ± 2 D.P. em relação aos valores médios anteriores.

27 TOXICIDADE CRÔNICA PARA PEIXES Número do teste no manual do IBAMA: D.3.1. CONTROLE DE QUALIDADE: Do Organismo-teste: A letalidade e ou proporção de peixes com comportamento anormal no lote < 5% em 48 h antes do teste. Do teste: - O 2 dissolvido 40% do valor da saturação H Letalidade e ou comportamento anormal no controle < 20%.

28 BIOCONCENTRAÇÃO EM PEIXES Número do teste no manual do IBAMA: D.3.3. OBJETIVO: Avaliar o grau de bioconcentração de agentes químicos em peixes. FUNDAMENTO: Exposição de espécies de peixes autóctones durante um certo período de tempo. O sistema de exposição pode ser estático (substâncias solúveis), semi-estático (Solubilidade < 200 mg/l) ou de fluxo contínuo (Solubilidade < 1 mg/l).

29 CONDIÇÕES DO TESTE: Alimentação normal com ração seca, 1 g de peixe / L, fotoperíodo de 11 h de luz natural, temperatura ( 25 2ºC). AVALIAÇÃO: A intervalos regulares amostras de água e de peixes são coletados para acompanhar a assimilação da substância até a sua acumulação máxima, que é atingida no estado de equilíbrio. Após esta fase, os peixes são transferidos para água limpa, para avaliação do grau de depuração da substância bioacumulada. A partir destes dados é calculado o fator de bioconcentração e as concentrações de assimilação e depuração.

30 BIOCONCENTRAÇÃO EM PEIXES Número do teste no manual do IBAMA: D.3.3. BIOCONCENTRAÇÃO: Aumento da concentração da substância no organismo vivo em relação à concentração na água. ASSIMILAÇÃO: Processo de absorção da substância pelo organismo teste. DEPURAÇÃO: Processo de eliminação da substância do organismo teste para o meio.

31 BIOCONCENTRAÇÃO EM PEIXES Número do teste no manual do IBAMA: D.3.3. FATOR DE BIOCONCENTRAÇÃO (FB c ) Razão entre a concentração da substância no organismo (Cp) e a concentração na água (Ca). ESTADO DE EQUILÍBRIO: Condição em que a concentração no organismo é constante em relação ao tempo exposição. CONTROLE DE QUALIDADE: Menos de 10% de mortalidade na testemunha; Variação de 1 ºC na temperatura; Oxigênio dissolvido na água pelo menos 3 mg/ L.

32 BIOCONCENTRAÇÃO EM PEIXES Número do teste no manual do IBAMA: D.3.1. CONTROLE DE QUALIDADE: Organismos-teste: Lotes diferentes fazer teste de toxicidade aguda com 24 h, com uma substância de referência. Culturas de laboratório por longos períodos: fazer teste de toxicidade aguda 24 h pelo menos uma vez por mês. CL(I)50 24h= ± 2 D.P. / aos valores médios anteriores.

33 BIOCONCENTRAÇÃO EM PEIXES Número do teste no manual do IBAMA: D.3.1. CONTROLE DE QUALIDADE: Do Organismo-teste: A letalidade e ou proporção de peixes com comporta-mento anormal no lote < 5% em 48 h antes do teste. Do teste: - O 2 dissolvido 40% do valor da saturação H Letalidade e ou comportamento anormal no controle < 10%.

34 bioconcentração ( g/g) 500 BIOCONCENTRAÇÃO EM PEIXES 400 acumulação depuração ,0769 mg/l de cobre 0,0200 mg/l de cobre ( CL50-96h : 1000 ) tempo (dias) Bioconcentração e depuração do cátion Cu +2 em TILÁPIA VERMELHA, descontado os valores da testemunha (BOOCK, 1999).

35 BIOCONCENTRAÇÃO EM PEIXES Número do teste no manual do IBAMA: D.3.3. ( CL50-96h : 100 ) Bioconcentração e depuração do cátion Cu +2 valores da testemunha (BOOCK, 1999). em GUARÚ, descontado os

36 PRÁTICA - - Instalação de teste de toxicidade aguda de agrotóxicos para GUARÚ. Tratamentos Conc. (mg i.a./l H 2 0) mlde calda/repet. 1. Testemunha Paration metílico 2, Paration metílico 5, Paration metílico 7, Paration metílico 10, Paration metílico 12, Oxicloreto Cobre 0,02 0,08 8. Oxicloreto Cobre 0,05 0,20 9. Oxicloreto Cobre 0,10 0, Oxicloreto Cobre 0,15 0, Oxicloreto Cobre 0,20 0,80 Solução Oxicloreto de cobre = 1 mg/l Solução Parathion = 1 mg/l Vidros com 4 L de água e 5 peixes guarú (Poecilia reticulata)

37 PRÁTICA - % de mortalidade dos peixes no teste de toxicidade aguda de agrotóxicos para GUARU. Dias de exposição Nº total % de TRATAMENTOS 1º - 2º - 3º - 4º - peixes Mortali- 6a-feira Sábado Domingo 2ª- feira mortos dade 1 - Controle 2 -= Parathion methyl 3 -= Parathion methyl 4 -= Parathion methyl 5 -= Parathion methyl 6 -= Parathion methyl 7 - Oxicloreto de cobre 8 - Oxicloreto de cobre 9 - Oxicloreto de cobre 10 - Oxicloreto de cobre 11 - Oxicloreto de cobre

38 PRÁTICA - % de mortalidade dos peixes no teste de toxicidade aguda de agrotóxicos para GUARU. TRATAMENTOS Concentra Nº Peixes % ções Mortos Mortalid. 1 - Controle 0,00 0,0 0,0 2 - Parathion methyl 2,50 5,0 33,3 3 - Parathion methyl 5,00 11,0 73,3 4 - Parathion methyl 7,50 14,0 93,3 5 - Parathion methyl 10,00 15,0 100,0 6 - Parathion methyl 12,50 15,0 100,0 7 - Oxicloreto de cobre 0,02 2,0 13,3 8 - Oxicloreto de cobre 0,05 1,0 6,7 9 - Oxicloreto de cobre 0,10 4,0 26, Oxicloreto de cobre 0,15 6,0 40, Oxicloreto de cobre 0,20 6,0 40,0 CL 50 parathion= 5,69 mg/l (LS=6,67/LI=4,85) Oxicloreto cobre = CL50 não calculável

39 PRÁTICA - % de mortalidade dos peixes no teste de toxicidade aguda de agrotóxicos para GUARU Parathion methyl

40 % de Mortalidade PRÁTICA - % de mortalidade dos peixes no teste de toxicidade aguda de agrotóxicos para GUARU Parathion methyl h 48h 72h 96h Total após 96h Linear (Total após 96h) y = 8,2286x + 15,238 R² = 0,8679 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,010,511,011,512,012,5 Concentração (mg/l) CL 50 parathion= 5,69 mg/l (LS=6,67/LI=4,85)