UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA CÂMPUS DE JABOTICABAL FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS DEPARTAMENTO DE FITOSSANIDADE

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1 unesp UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA CÂMPUS DE JABOTICABAL FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS DEPARTAMENTO DE FITOSSANIDADE DISCIPLINA ECOTOXICOLOGIA 6a. Aula Ensaios de avaliação de toxicidade aguda para organismos bioindicadores terrestres de contaminação ambiental (minhocas) Doutoranda Ana Carla Coleone de Carvalho - Assistente de Suporte Acadêmico II Dr. Joaquim Gonçalves Machado Neto - Prof. Responsável

2 6A. AULA ECOTOXICOLOGIA 1 - Introdução ecotoxicologia 2 - Bioindicadores terrestres: minhocas 3 - Toxicologia regulamentadora (Registro) 4 Testes toxicidade - minhocas 5 - Exemplos

3 Termo Ecotoxicologia criado em 1969 pelo Dr. Rene Truhaut; Ecotoxicologia: estudo dos efeitos adversos de substâncias químicas com o objetivo de proteger espécies naturais e populações (TRUHAUT, 1977). Ensaios ecotoxicológicos: testes que utilizam diferentes tipos de organismos vivos representativos no ambiente para analisar os efeitos que substâncias podem ter sobre eles (RUBINGER, 2009).

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5 ENSAIOS ECOTOXICOLÓGICOS ou BIOENSAIOS: São realizados para detectar a toxicidade de efluentes, determinar o grau, ou o efeito biológico, de novos produtos químicos (ex.: produtos farmacêuticos, etc.) - a cada dia mais lançados no meio ambiente, o que podem causar nos indivíduos, nas comunidades e populações, para se evitar as crises epidemiológicas e afins.

6 ENSAIOS ECOTOXICOLÓGICOS: São realizados por métodos de comparação entre uma substância "genérica" já conhecida e a nova substância desconhecida, para identificar os efeitos que as mesmas causam quando inseridas no meio de cultura de células vivas. Na atualidade, substâncias químicas desconhecidas são produzidas de forma intencional ou como subprodutos de determinadas atividades produtivas e necessitam de análise.

7 OS ESTUDOS SÃO DIVIDIDOS EM AGUDOS E CRÔNICOS. Agudos: São "estudos experimentais feitos com organismosteste que determinam se um efeito adverso observado ocorre em um curto período de tempo (em geral até 14 dias) após administração de uma única dose da substância testada ou após múltiplas dosagem administradas em até 24 horas.

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13 OS ESTUDOS SÃO DIVIDIDOS EM AGUDOS E CRÔNICOS. Crônicos: Os organismos-teste são observados durante uma grande parte do tempo de vida, quando acontece a exposição ao agente-teste; os efeitos crônicos persistem por um longo período de tempo, e podem ser evidentes imediatamente após a exposição ou não.

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15 IMPORTÂNCIA *OS ENSAIOS ECOTOXICOLÓGICOS PODEM SER UTILIZADOS PARA: Determinar a toxicidade de agentes químicos, efluentes líquidos; CL/CE 50 Estabelecer critérios e padrões de qualidade das águas; Estabelecer limites máximos de lançamento de efluentes líquidos em corpos hídricos (ARAGÃO e ARAÚJO, 2006).

16 IMPORTÂNCIA *OS ENSAIOS ECOTOXICOLÓGICOS PODEM SER UTILIZADOS PARA: Determinar a toxicidade de agentes químicos, efluentes líquidos; CL/CE 50 Estabelecer critérios e padrões de qualidade das águas; Estabelecer limites máximos de lançamento de efluentes líquidos em corpos hídricos (ARAGÃO e ARAÚJO, 2006).

17 IMPORTÂNCIA *OS ENSAIOS ECOTOXICOLÓGICOS PODEM SER UTILIZADOS PARA: Determinar a toxicidade de agentes químicos, efluentes líquidos; CL/CE 50 Estabelecer critérios e padrões de qualidade das águas; Estabelecer limites máximos de lançamento de efluentes líquidos em corpos hídricos (ARAGÃO e ARAÚJO, 2006).

18 IMPORTÂNCIA Avaliar a necessidade de tratamento de efluentes líquidos quanto as exigências de controle ambiental; Avaliar a qualidade das águas (complementam a análise físicoquímica dos laboratórios); Avaliar a sensibilidade relativa de organismos aquáticos; Estimar os impactos provocados em acidentes ambientais (ARAGÃO e ARAÚJO, 2006).

19 Fatores que influenciam Ensaios Ecotoxicológicos Idade, tamanho e estado nutricional dos organismos. Aspectos abióticos: ph, temperatura, oxigênio dissolvido, dureza da água, etc. Duração do Ensaio Sistema de exposição dos organismos (estáticos, semi estáticos, de fluxo continuo). Amostragem simples ou composta.

20 Fatores que influenciam Ensaios Ecotoxicológicos Idade, tamanho e estado nutricional dos organismos. Aspectos abióticos: ph, temperatura, oxigênio dissolvido, dureza da água, etc. Duração do Ensaio Sistema de exposição dos organismos (estáticos, semi estáticos, de fluxo continuo). Amostragem simples ou composta.

21 Fatores que influenciam Ensaios Ecotoxicológicos Idade, tamanho e estado nutricional dos organismos. Aspectos abióticos: ph, temperatura, oxigênio dissolvido, dureza da água, etc. Duração do Ensaio Sistema de exposição dos organismos (estáticos, semi estáticos, de fluxo continuo). Amostragem simples ou composta.

22 Fatores que influenciam Ensaios Ecotoxicológicos Idade, tamanho e estado nutricional dos organismos. Aspectos abióticos: ph, temperatura, oxigênio dissolvido, dureza da água, etc. Duração do Ensaio Sistema de exposição dos organismos (estáticos, semi estáticos, de fluxo continuo). Amostragem simples ou composta.

23 A suscetibilidade está ligada ao aparato metabólico de cada espécie, mas depende: Comportamento, alimentação, modo de vida, fases de desenvolvimento, etc.

24 IMPORTÂNCIA DAS MINHOCAS PARA O SOLO E VEGETAIS RESTOS ORGÂNICOS NO SOLO (ANIMAIS E VEGETAIS) 40% a 90% da biomassa de macrofauna da maioria dos ecossistemas tropicais (Fragoso et al. 1999) GALERIAS FEZES DETRITÍVORAS - MORTOS Penetração de ar no solo Penetração e retenção de água no solo < Erosão do solo Homogenização do solo Nutrientes Microrg. úteis VEGETAIS

25 POPULAÇÃO DE MINHOCAS NOS SOLOS DE BOA PASTAGEM (MEINICKE, 1993) - ADULTAS 800/m 2, Peso = 400 g/m 2 - JOVENS /m 2, Peso = 26 g/m 2 FATORES LIMITANTES DO CRESCIMENTO DAS MINHOCAS - Umidade - Matéria Orgânica em decomposição

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29 TOXICOLOGIA REGULAMENTADORA (Registro ) Responsável pelas decisões sobre um produto químico Se oferece ou não riscos ao ser comercializado dentro de fins específicos Baseada em dados obtidos em testes realizados pela toxicologia descritiva Praticada por agências regulamentadoras nacionais e internacionais Remédios, cosméticos, aditivos em alimentos, agrotóxicos, Normas sobre o total permitido no ambiente, nas águas, no solo

30 Portaria Normativa N. 84 (15/10/96) IBAMA Art. 4. Para efeito de classificação quanto ao Potencial de Periculosidade Ambiental (PPA de agrotóxicos), seus componentes e afins o interessado deverá apresentar a documentação completa conforme estabelecida nos anexos I, III, IV, V e X ANEXO IV PARTE C CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS PARTE D TOXICIDADE PARA ORGANISMOS NÃO-ALVO PARTE E COMPORTAMENTO NO SOLO PARTE F TOXICIDADE PARA ANIMAIS SUPERIORES PARTE G POTENCIAL GENOTÓXICO, EMBRIOFETOTÓXICO E CARCINOGÊNICO

31 IBAMA (1987) - PARTE D TOXICIDADE PARA ORGANISMOS NÃO-ALVO D.1 Microrganismos. D.2 Algas. D.3 Organismos do solo (minhocas) D.4 Abelhas. D.5 Microcrustáceos. D.5.1 Agudo. D.5.2 Crônico D.6 -- Peixes. D.6.1 Agudo. D.6.2 Crônico. D.7 Bioconcentração em peixes. D.8 Aves. D.8.1 Dose única. D.8.2 Dieta. D.8.3 Reprodução. D.9 Plantas. D.9.1 Fitotoxicidade para plantas não-alvo

32 Portaria Normativa N. 84 (15/10/96) IBAMA Art. 3. A classificação quanto ao Potencial de Periculosidade Ambiental (PPA) baseia-se nos parâmetros biocumulação, persistência, transporte, toxicidade a diversos organismos, POTENCIAL MUTAGÊNICO, TERATOGÊNICO, CARCINOGÊNICO, obedecendo a seguinte graduação: Classe I Produto altamente perigoso Classe II Produto Muito perigoso Classe III Produto Perigoso Classe IV Produto Pouco Perigoso

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34 TESTES PARA AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA DE AGROTÓXICOS PARA MINHOCAS 1- TESTE POR CONTATO EM PAPEL DE FILTRO (OECD, Protocolo nº 207) 2- TESTE DO SOLO ARTIFICIAL (OECD, Protocolo nº 207) 3- TESTE DO ARTISOL (EDWARDS, 1984) (IBAMA, 1987) 4- TESTE COM A UTILIZAÇÃO DE SOLOS (ABNT NBR 15537: )

35 1. TESTE POR CONTATO EM PAPEL DE FILTRO SUBSTRATO TESTE: Papel de filtro qualitativo padrão (WHATMAN nº 180. PESO = 85 mg/m 2 ) SOLUÇÃO: Água deionizada, concentrações crescentes (mg/cm 2 ), colocar com pipeta sobre o papel. SUBSTRATO CONTROLE: Papel + água deionizada. RECIPIENTE: Frasco de vidro: 8,0 1 cm de altura e de 3 0,5 cm CONDIÇÕES Sala climatizada (20 2 C), ESCURO AVALIAÇÃO DA MORTALIDADE: 48 h de exposição ESPÉCIE Eisenia foetida RESULTADOS: % Mortalidade CL 50 (mg/cm 2 ). SUBSTÂNCIA DE REFERÊNCIA: Cloroacetamida

36 2 - TESTE DO SOLO ARTIFICIAL SUBSTRATO TESTE: Substrato básico (10% de turfa (ph 6,0), finamente moída; 20% de caolinita; 69% de areia de quartzo industrial, com + de 50% de part. de 0,05-0,2 mm ; e 1% CaCO 3 pulverizado) UMIDADE: Água deionizada (25-42% peso. sub. básico) CONDIÇÕES - Sala Climatizada (20 2 C), CLARO. ANIMAIS Adulto e com Clitélo. Peso = mg/indivíduo Aclimatados por 24 h no substrato básico TESTE DEFINITIVO: 5 Concentrações. 10 animais /recipiente AVALIAÇÃO: 14 dias de exposição SUBSTÂNCIA REFERÊNCIA: Cloroacetamida. RESULTADOS: % mortalidade - CL 50 (mg/kg) VANTAGEM Resultados são usados para se estabelecer as dosagens no teste de avaliação de toxicidade crônica

37 3. TESTE DO ARTISOL (EDWARDS, 1984) FUNDAMENTO: Exposição de minhocas adultas por 14 dias, em substrato ARTISOL SUBSTRATO ARTISOL: g de bolas de vidro com 1-1,5 cm ; 90 g de sílica amorfa - sílica gel em pó, impalpável; 215 ml de água destilada com a concentração da substância dissolvida. Misturar tudo em um cristalizador de vidro. Colocar 10 Animais adultos, com clitélo, manter por 14 dias em sala climatizada, 20 2 C, ESCURO. AVALIAÇÃO: CL(I)50, 14 dias Conc. Letal Inicial Média. CONTROLE DE QUALIDADE: a. < 10% de Mortalidade na testemunha b. CL(I)50, 14 dias para a CLOROACETAMIDA deve estar entre: 35 a 160 mg/kg de sílica.

38 4 - TESTE SOLO NATURAL OU ARTIFICIAL SUBSTRATO TESTE ARTIFICIAL: Pó da fibra de casca de coco (10%), caulim (20%) e areia industrial peneirada (70%) UMIDADE: 40-60% da capacidade máxima de retenção de água CONDIÇÕES - Sala Climatizada (25 2 C), fotoperíodo de 12h. ANIMAIS Adulto e com Clitelo. Peso = mg/indivíduo Aclimatados por 24 h no substrato básico TESTE DEFINITIVO: 5 Concentrações. 10 animais /recipiente AVALIAÇÃO: 14 dias de exposição SUBSTÂNCIA REFERÊNCIA: Cloroacetamida. RESULTADOS: % mortalidade - CL 50 (mg/kg)

39 4 - TESTE SOLO NATURAL OU ARTIFICIAL SUBSTRATO TESTE ARTIFICIAL: Pó da fibra de casca de coco (10%), caulim (20%) e areia industrial peneirada (70%) UMIDADE: 40-60% da capacidade máxima de retenção de água CONDIÇÕES - Sala Climatizada (25 2 C), fotoperíodo de 12h. ANIMAIS Adulto e com Clitelo. Peso = mg/indivíduo Aclimatados por 24 h no substrato básico TESTE DEFINITIVO: 5 Concentrações. 10 animais /recipiente AVALIAÇÃO: 14 dias de exposição SUBSTÂNCIA REFERÊNCIA: Cloroacetamida. RESULTADOS: % mortalidade - CL 50 (mg/kg)

40 D.3.1. Toxicidade Aguda para Minhocas - Eisenia foetida

41 ICHINOSE, 1992) Cloroacetamida CL (I)50 = 110,06 mg/kg Controle de Qualidade IBAMA (Sílica) 35 < CL (I)50 < 160 mg/kg RELAÇÃO ENTRE CONCENTRAÇÃO DE CLOROACETAMIDA E RESPOSTA DAS MINHOCAS EM SUBSTRATO ARTISOL CL (I) 50 (mg/kg) Intervalo de confiança (mg/kg) 110,06 95,48-126,95

42 ICHINOSE, 1992) Cloroacetamida CL (I)50 = 110,06 mg/kg Controle de Qualidade IBAMA (Sílica) 35 < CL (I)50 < 160 mg/kg COLEONE, 2014 RELAÇÃO ENTRE CONCENTRAÇÃO DE CLOROACETAMIDA E RESPOSTA DAS MINHOCAS EM SUBSTRATO ARTISOL CL (I) 50 (mg/kg) Intervalo de confiança (mg/kg) 110,06 95,48-126,95

43 ICHINOSE, 1992) Benomil Substrato CL (I) 50 Int. Confiança Artisol 8,06 c 4,60 14,57 Areia 0,58 d 0,31 1,21 Latossolo Ver. Escuro 13,06 b 9,26 18,54 Latossolo Roxo 10,82 bc 6,42 18,67 Litossol 45,40 a 26,73 78,77

44 ICHINOSE, 1992) Parathion methyl Substrato CL (I) 50 Int. Confiança Artisol 73,61 b 52,15 109,65 Areia 8,81 d 7,10 10,94 Latossolo Ver. Escuro 86,69 b 64,14 117,79 Latossolo Roxo 53,59 c 40, ,51 Litossol 191,73 a 132,25 269,73

45 ICHINOSE, 1992) Paraquat Substrato CL (I) 50 Int. Confiança Artisol 929,47 b 779, ,88 Areia 207,44 d 157,06 274,11 Latossolo Ver. Escuro 783,43 c 658,12 934,54 Latossolo Roxo 752,65 c 631,27 899,35 Litossol 1.458,80 a 1.316, ,26

46 (COLEONE, 2014)

47 Teste de Fuga comportamental (Bush et al., 2010) ISO (2007) NBR ISO (ABNT, 2011) - 10 organismos; - 20 ± 4 ºC; g; - 48 h - A amostra é considerada tóxica: mais de 80% do total de organismos expostos na amostra do solo controle.

48 Teste de Fuga comportamental (Bush et al., 2010) ISO (2007) NBR ISO (ABNT, 2011) - 10 organismos; - 20 ± 4 ºC; g; - 48 h - A amostra é considerada tóxica: mais de 80% do total de organismos expostos na amostra do solo controle.

49 Teste de Fuga comportamental (Bush et al., 2010) ISO (2007) NBR ISO (ABNT, 2011) - 10 organismos; - 20 ± 4 ºC; Machado (2016) - Os organismos da espécie Eisenia andrei g; demonstraram sensibilidade ao agrotóxico glifosato, - 48 h evidenciando sua capacidade de detectar e evitar esta - A amostra é considerada tóxica: mais de 80% do total de organismos expostos na amostra do solo controle. substância química quando presente no solo, deste modo podem ser utilizadas para auxiliar no monitoramento ambiental de áreas contaminadas.

50 AVALIAÇÃO DE RISCOS RELATIVOS AOS EFEITOS DE AGROTÓXICOS SOBRE MINHOCAS (KOKTA & ROTHERT, 1992) TOXICIDADE AGUDA CL 50 RELAÇÃO CL 50 : CAE Con. Ambiental Estimada CAE CL 50 < 10 x CAE CL 50 > 100 x CAE 80 < 10 x 10 Testes subletais Testes de campo 10 x CAE < CL 50 < 100 x CAE 10 x 10 < 500 < 100 x 10 Estudos de efeitos sobre o peso, etc > 100 x 10 Provavelmente baixo Risco

51 AVALIAÇÃO DE RISCOS RELATIVOS AOS EFEITOS DE AGROTÓXICOS SOBRE MINHOCAS (KOKTA & ROTHERT, 1992) TOXICIDADE AGUDA CL 50 RELAÇÃO CL 50 : CAE Con. Ambiental Estimada CAE CL 50 < 10 x CAE CL 50 > 100 x CAE 80 < 10 x 10 Testes subletais Testes de campo 10 x CAE < CL 50 < 100 x CAE 10 x 10 < 500 < 100 x 10 Estudos de efeitos sobre o peso, etc > 100 x 10 Provavelmente baixo Risco

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54 Tratamento com água todos os gravetos de macieira foram movimentados e uma grande parte carregada, total ou parcialmente, para dentro do solo. Tratamento com 0,27% de ethilparathion redução na atividade das minhocas: apenas 4 gravetos foram movimentdos e 2 carregados para dentro do solo. Tratamento com 0,005% de benomyl redução na atividade das minhocas: só 1 graveto foi carregado para dentro do solo e muitos não movimentados. Tratamento com 0,025% de benomyl redução drástica na atividade das minhocas. Maior efeito que o ethilparathion em concentração semelhante. Tratamento sem minhocas testemunha com apenas o solo e os gravetos de folhas de macieira. Efeito de agrotóxicos sobre minhocas, com base na eficiência em remover gravetos da nervura central de folhas de macieira com 12 horas de exposição no solo.

55 TESTES DE TOXICIDADE CRÔNICA SOLO: ARTIFICIAL / ARTISOL / CAMPO CONCENTRAÇÕES SUBLETAIS Avaliação de efeitos sobre: - Crescimento (massa) - Reprodução - produção de jovens - Produção de casulos - Comportamento - Fisiologia, Morfologia ISO (INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION), 1998, ISO Soil quality Effects of polutants on earthworms (Eisenia fetida) Part 2: determination of effects on reproduction. Geneva, ISO.

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57 Amostra originada da garagem de ônibus: - 96% dos organismos fugiram da seção contaminada para a seção onde estava o solo controle - amostra é tóxica, apresentando sua função de habitat limitada. - A toxicidade foi confirmada pelos ensaios de letalidade e reprodução % mortalidade adultos; - Não houve reprodução. - Ensaio de comportamento: indicador rápido da toxicidade da amostra e pode ser aplicado como complementação da avaliação de áreas contaminadas.

58 Ação hormônios Baía Guanabara: - minhocas engordaram 30%. - Não se reproduzem. Sedimento da Foz do Rio Meriti: - Todas minhocas morreram. - Acumulo de material pesado.

59 PRÁTICA: Instalação de um teste de toxicidade de agrotóxicos para minhocas 1 - Pesar 1 kg de substrato: Areia / Solo Argiloso / Solo orgânico em sacos plásticos. 2 - Colocar caldas com agrotóxicos, volume suficiente para manter 80% de umidade areia e solo orgânico - solo argiloso - * tratamentos 3 - Misturar a calda com o substrato dentro do saco plástico 4 - Colocar 10 minhocas, previamente pesadas, na superfície do substrato 5 - Fechar a Boca do saco plástico com arame plastificado 6 - Furar a parte de cima do saco plástico com estilete, para trocas de ar.

60 PRÁTICA: Instalação de um teste de toxicidade de agrotóxicos para minhocas AVALIAÇÃO - 14 DIAS DE EXPOSÇÃO 1 - Abrir os sacos plásticos e despejar o substrato sobre uma folha de jornal 2 - Procurar e separar as minhocas vivas contar 3 - Pesar as minhocas vivas encontradas em cada saco plástico. 4 - Calcular a CL(I) 50 e a redução no peso médio dos animais.

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66 Tratamentos METHYL PARATHION (Folisuper ) AREIA 1 TESTEMUNHA 2 4 mg/kg substrato 3 8 mg/kg substrato 4 16 mg/kg substrato 5 32 mg/kg substrato 6 64 mg/kg substrato Tratamentos METHYL PARATHION (Folisuper ) ARGILOSO 7 - TESTEMUNHA 8 20 mg/kg substrato 9 40 mg/kg substrato mg/kg substrato mg/kg substrato mg/kg substrato Tratamentos METHYL PARATHION (Folisuper ) SOLO ORGÂNICO 13 - TESTEMUNHA mg/kg substrato mg/kg substrato mg/kg substrato mg/kg substrato mg/kg substrato