Bioenergética e Biomembranas TRABALHO PRÁTICO Nº 3. Bioenergética Mitocondrial

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1 Bioenergética e Biomembranas TRABALHO PRÁTICO Nº 3 Bioenergética Mitocondrial Departamento de Bioquímica F C T U C 2007/2008

2 I. INTRODUÇÃO A respiração aeróbica é o processo mais comum para a obtenção de grandes quantidades de energia por parte dos organismos eucarióticos. Nessa actividade metabólica, substratos respiratórios são oxidados e a sua energia armazenada na forma de ATP. Na respiração aeróbica o aceitador final de electrões é o oxigénio molecular, que é reduzido a água. Deste modo, a medição da variação da concentração de O 2 num meio aquoso contendo células ou organitos permite avaliar a actividade respiratória dessa preparação. Assim, quanto maior for a actividade respiratória, maior será o consumo de O 2 por parte da preparação, e a concentração do gás em solução diminui. O estudo da fosforilação oxidativa mitocondrial (processo pelo qual a energia libertada das reacções redox da cadeia respiratória é utilizada na síntese de ATP) constitui um dos temas centrais da Bioenergética. Durante a fosforilação oxidativa, electrões de alta energia provenientes de outros processos (glicólise, ciclo de Krebs) percorrem a cadeia respiratória (localizada na membrana interna da mitocôndria) segundo um gradiente de potenciais redox até ao aceitador final (oxigénio). O transporte de electrões está acoplado a um movimento vectorial de H +, da matriz para o espaço intermembranar mitocondrial, promovendo a criação de um gradiente electroquímico que é utilizado na fosforilação de ADP a ATP (teoria quimiosmótica de Mitchell). A cadeia respiratória mitocondrial consiste em cerca de 50 polipeptídeos distintos, a maioria componentes integrais da membrana interna. A cadeia pode considerar-se funcionalmente linear mas consiste, de facto, de quatro complexos macromoleculares independentes. A organização segmentada da cadeia foi deduzida pelo estudo da acção de vários tipos de substratos respiratórios e inibidores. O objectivo deste trabalho consiste em estudar a bioenergética mitocondrial recorrendo a medições de consumo de oxigénio (TP3a) e de variações de potencial eléctrico (TP3b). Preparação Biológica Neste trabalho utilizar-se-ão suspensões mitocondriais, obtidas a partir de tubérculo de batata (ver p. 6) 1

3 MEDIÇÕES DE CONSUMO DE OXIGÉNIO Montagem experimental O arranjo experimental para a medição do consumo de oxigénio consiste numa câmara de reacção fechada, com agitação magnética, na qual se introduz o eléctrodo de Clark. O eléctrodo de Clark é polarizado a -0.7 V e a corrente resultante da redução de oxigénio, após conversão em voltagem, é monitorizada em um registador de papel Procedimentos experimentais Calibração Colocar água desmineralizada na câmara de reacção e, sem tapar, agitar durante cerca de 2 min. Rodar o botão de ganho da unidade de controlo até zero (sentido contrário aos ponteiros do relógio) Posicionar, com o botão zero, a caneta do registador a zero Rodar o botão de ganho da unidade de controlo até a caneta do registador atingir a posição 90% Não alterar a posição do botão de ganho da unidade de controlo ou do botão de zero do registador durante as experiências Estudo da acção de diferentes substratos Colocar 1.5 ml de meio de reacção na câmara Adicionar mg de proteína à câmara e fechá-la Uma vez o sinal estabilizado, adicionar o substrato respiratório (*) Após obtenção de ~2 min de declive constante (estado respiratório II), adicionar 0.3 µmoles de ADP Esperar o tempo suficiente para a obtenção de dois declives distintos (estados respiratórios III e IV) Parar o registo Repetir este procedimento com os restantes substratos (*) Substratos a serem ensaiados (e suas concentrações finais): succinato (15 mm); glutamato/malato (7.5 mm); ascorbato/tmpd (10 mm) Calcule o índice de controlo respiratório e a índice P/O para os diferentes substratos 2

4 Estudo da sequência de acção de diferentes substratos Colocar 1.5 ml de meio de reacção na câmara Adicionar mg de proteína à câmara e fechá-la Uma vez o sinal estabilizado, adicionar o substrato glutamato/malato (*) Após obtenção de ~2 min de declive constante, adicionar rotenona (3 µl) Após obtenção de ~2 min de declive constante, adicionar succinato (*) Após obtenção de ~2 min de declive constante, adicionar antimicina (3 µl) Após obtenção de ~2 min de declive constante, adicionar ascorbato/tmpd (*) Após obtenção de ~2 min de declive constante, adicionar cianeto (5 µl) Após obtenção de ~2 min de declive constante, parar o registo (*) concentrações finais dos substratos: glutamato/malato (7.5 mm); succinato (15 mm); ascorbato/tmpd (10 mm) Estudo da acção de desacopladores respiratórios Colocar 1.5 ml de meio de reacção na câmara Adicionar mg de proteína à câmara e fechá-la Uma vez o sinal estabilizado, adicionar succinato (15 mm) Após obtenção de ~2 min de declive constante, adicionar o desacoplador (3 µl) (*) Após obtenção de ~2 min de declive constante, parar o registo (*) desacopladores disponíveis: FCCP, CCCP e valinomicina Estudo da acção de inibidores da ATP sintase Colocar 1.5 ml de meio de reacção na câmara Adicionar mg de proteína à câmara e fechá-la Uma vez o sinal estabilizado, adicionar succinato (15 mm) Após obtenção de ~2 min de declive constante, adicionar ADP (0.3 µmoles) Após a obtenção de dois declives distintos, adicionar oligomicina (3 µl) Após ~2 min, adicionar ADP (0.3 µmoles) Após ~2 min, parar o registo 3

5 MEDIÇÕES DE POTENCIAL ELÉCTRICO Montagem experimental O arranjo experimental para a medição do potencial eléctrico consiste numa câmara de reacção, com agitação magnética, na qual se introduzem dois eléctrodos: um eléctrodo de calomelanos (eléctrodo de referência) e um eléctrodo selectivo a TPP +. Estes eléctrodos encontram-se ligados a um electrómetro de alta impedância (neste caso, um aparelho tipicamente utilizado para medir ph), que determina continuamente a diferença de potencial entre eles, que é monitorizada num registador de papel (vide TP8 para uma descrição mais pormenorizada). Procedimentos experimentais Estudo da sequência de acção de diferentes substratos Colocar 2.0 ml de meio de reacção na câmara Adicionar TPP + (concentração final: 1 µm) Adicionar mg de proteína Após obtenção de um sinal estável, adicionar glutamato/malato (*) Após obtenção de um sinal estável, adicionar rotenona (3 µl) Após obtenção de um sinal estável, adicionar succinato (*) Após obtenção de um sinal estável, adicionar antimicina (3 µl) Após obtenção de um sinal estável, adicionar ascorbato/tmpd (*) Após obtenção de um sinal estável, adicionar cianeto (5 µl) Após obtenção de um sinal estável, parar o registo (*) concentrações finais dos substratos: glutamato/malato (7.5 mm); succinato (15 mm); ascorbato/tmpd (10 mm) 4

6 Estudo da acção de desacopladores respiratórios Colocar 2.0 ml de meio de reacção na câmara Adicionar TPP + (concentração final: 1 µm) Adicionar mg de proteína Após obtenção de um sinal estável, adicionar succinato (concentração final: 15 mm) Após obtenção de um sinal estável, adicionar desacoplador (3 µl) (*) Após obtenção de um sinal estável, parar o registo (*) desacopladores disponíveis: FCCP, CCCP e valinomicina Estudo da acção de inibidores da ATP sintase Colocar 2.0 ml de meio de reacção na câmara Adicionar TPP + (concentração final: 1 µm) Adicionar mg de proteína Após obtenção de um sinal estável, adicionar succinato (concentração final: 15 mm) Após obtenção de um sinal estável, adicionar ADP (0.5 mmoles) Após 1 minuto em presença de ADP, adicionar oligomicina (3 µl) Após obtenção de um sinal estável, parar o registo 5

7 I. Material, Reagentes e soluções Extractor eléctrico de sumos Centrífuga refrigerada Espectrofotómetro Micropipetas automáticas digitais Pincel Funil de vidro Aparelho de ph Agitador magnético e magnete Balança Gaze hidrófila Tubos de centrífuga de 50 e 250 ml Reagente de Biureto SDS 10 % BSA 0.4% Meio de isolamento mitocondrial: sacarose 0.25 M; HEPES 10 mm; EDTA 1 mm; cisteína 4 mm; BSA (albumina sérica bovina) 0.1%, ph 7.4 Meio de lavagem mitocondrial: sacarose 0.25 M; HEPES 10 mm; EDTA 1 mm; BSA 0,1%, ph 7.2 II. Procedimentos experimentais Isolamento de fracções mitocondriais de Batata Manter todas as soluções/suspensões e materiais de vidro a 4º C Lavar e descascar ~250 g de batatas Centrifugar a g durante 20 min (usar outro tubo com água para equilibrar o rotor) Desprezar o sobrenadante e ressupender o sedimento em ~0.5 ml de meio de lavagem, com um pincel Transferir a suspensão para um tubo eppendorf de 1.5 ml Determinar a concentração de proteína (método do biureto). 6

8 I. INTRODUÇÃO O potencial de membrana é a diferença de potencial eléctrico que se estabelece através da membrana celular entre os compartimentos intra e extracelular. O potencial de membrana resulta da existência de uma distribuição assimétrica de espécies iónicas permeáveis entre os compartimentos intra e extracelular e é determinado tanto pelos respectivos potenciais de equilíbrio como pelas permeabilidades membranares das referidas espécies iónicas. Numa primeira aproximação, pode-se considerar que apenas os iões Na + e K + contribuem para o potencial de membrana das células em repouso. Nesta situação, o potencial de membrana pode ser determinado através da equação de Goldman-Hodgkin-Katz E m = RT F. ln [K+ ] o + α[na + ] o [K + ] i + α[na + ] I (1) onde E m representa o potencial de membrana (em volts), R é a constante dos gases perfeitos (8.314 J.mol -1.K -1 ), T é a temperatura (em graus Kelvin), F é a constante de Faraday (96485 C.mol -1 ), [K + ] e [Na + ] são as concentrações de K + e Na + (o-extracelular, i-intracelular), respectivamente, e α é a razão de permeabilidades membranares (P Na /P K ). O potencial de membrana pode ser medido por diferentes técnicas experimentais, sendo as técnicas electrofisiológicas aquelas que apresentam uma maior resolução temporal e que permitem a sua medição directa, uma vez que envolvem a introdução de um microeléctrodo na célula. No entanto, tais técnicas, não podem ser aplicadas a sistemas celulares de pequenas dimensões como os sinaptossomas. Torna-se, portanto, necessário recorrer a técnicas menos directas, as quais envolvem invariavelmente a utilização de sondas químicas. Neste contexto, tem sido possível determinar o potencial de membrana de diversas preparações celulares e subcelulares, utilizando sondas químicas detectáveis por fluorimetria, eléctrodos selectivos e radiometria. No presente trabalho, o potencial de membrana de suspensões de sinaptossomas será determinado através da medição da concentração extrassinaptossomal de uma sonda química sensível ao potencial de membrana, o ião tetrafenilfosfónio (TPP + - Fig. 1C), recorrendo a um eléctrodo selectivo para este composto. O TPP +, apesar de ser um catião monovalente, é lipossolúvel, devido ao facto de a sua carga positiva se encontrar deslocalizada por toda a molécula. Esta característica permite que o catião se difunda facilmente através das membranas celulares, distribuindo-se entre os compartimentos intra e extracelular de acordo com o potencial de membrana e funcionando assim como uma sonda para este. Quando uma suspensão celular é colocada em contacto com uma solução de TPP + durante algum tempo, a sua distribuição reflecte o potencial de membrana médio da população de células. A concentração de TPP + extracelular ([TPP + ] o ) encontra-se relacionada com a concentração de TPP + citossólica ([TPP + ] i ) de acordo com a equação de Nernst: E m = RT F. ln [TPP+ ] o [TPP + ] i (2) É assim possível calcular E m, desde que se conheçam os valores de [TPP + ] o e [TPP + ] i. O valor de [TPP + ] o pode ser obtido através da utilização de um eléctrodo selectivo para este 7

9 catião; a determinação da [TPP + ] i implica o conhecimento do volume citossólico e da quantidade de TPP + acumulada no citossol (quantidade de TPP + removida do meio extracelular, corrigida para a quantidade acumulada em outros compartimentos celulares, como sejam as mitocôndrias e as próprias membranas celulares). Assim, a aplicação da equação (2) não é directa e o cálculo de E m requer correcções apropriadas expressas na equação (3). E m + + RT ([ TPP ] [ TPP ] ).( V v) F ln 1 o,k o o + = + F.E mit [ TPP ]. V V.exp o s + + mit RT (3) R, T e F têm o seu significado usual, [TPP + ] o,k = concentração de TPP + no meio de potássio (após adição de sinaptossomas), [TPP + ] o = concentração de TPP + no meio de sódio ou colina (após adição de sinaptossomas), V o = volume de reacção inicial, v = volume de sinaptossomas adicionado, V s = volume citossólico sinaptossomal (correspondente a 3 µl/mg de proteína), V mit = volume do espaço intramitocondrial (correspondente a 80 nl/mg de proteína) e E mit = potencial de membrana mitocondrial (aprox V). O objectivo do presente trabalho é determinar as variações de potencial de membrana de sinaptossomas quando estes são estimulados por agentes despolarizantes. A despolarização de sinaptossomas será induzida por aumento da concentração de K + no meio externo ([K + ] o ), ou pela aplicação de veratridina ou 4-amino-piridina. Preparação Biológica Neste trabalho utilizar-se-ão suspensões mitocondriais, obtidas a partir de tubérculo de batata (ver p. Montagem Experimental O arranjo experimental consiste numa câmara de reacção, com agitação magnética, na qual se introduzem dois eléctrodos: um eléctrodo de calomelanos (eléctrodo de referência) e um eléctrodo selectivo a TPP + (figura 1A). Estes eléctrodos encontram-se ligados a um electrómetro de alta impedância (neste caso, um aparelho de medição de ph), o qual determina continuamente a diferença de potencial entre eles, que é visualizada num registador de papel. O eléctrodo selectivo a TPP + (figura 1B) consiste num tubo de PVC com uma membrana plástica colada na extremidade, que foi tornada selectivamente permeável a TPP + por incorporação de um trocador de TPP +, o ião tetrafenilborato. O interior do eléctrodo 8

10 contém uma solução de TPP + 10 mm, na qual se encontra mergulhado um filamento de prata, revestido de cloreto de prata. Após a preparação do eléctrodo e antes de ser utilizado pela primeira vez, este é colocado numa solução de TPP + 10 mm durante pelo menos 24 horas. Uma vez colocado em solução, gera-se uma diferença de potencial entre o eléctrodo selectivo a TPP + e o eléctrodo de referência que é proporcional ao logaritmo da concentração de TPP + da solução. É possível pois determinar esta última, após calibração apropriada do sinal eléctrico. A) ELECTRÓMETRO B) C) + REGISTADOR TUBO DE PVC P ELÉCTRODO DE REFERÊNCIA ELÉCTRODO DE Ag/AgCl SUSPENSÃO AGITADOR MAGNÉTICO BARRA MAGNÉTICA SOLUÇÃO DE REFERÊNCIA (TPPCl 10 mm) MEMBRANA Figura 1A) Diagrama do sistema utilizado para a medição do potencial de membrana B) Eléctrodo 9