DEPARTAMENTO DE ZOOLOGIA FACULDADE DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA UNIVERSIDADE DE COIMBRA FISIOLOGIA ANIMAL GERAÇÃO DE POTENCIAIS ELÉCTRICOS DE MEMBRANA

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1 DEPARTAMENTO DE ZOOLOGIA FACULDADE DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA UNIVERSIDADE DE COIMBRA FISIOLOGIA ANIMAL AULA 1 GERAÇÃO DE POTENCIAIS ELÉCTRICOS DE MEMBRANA ARMANDO CRISTÓVÃO, PAULO SANTOS

2 Experiências a realizar Parte A. Utilização da câmara de Ussing 1. Potenciais eléctricos de membrana gerados por gradientes de K Desenvolvimento do equilíbrio electroquímico 3. Geração de potenciais eléctricos por gradientes iónicos de Na + e de K + existentes na célula. Parte B. Simulação com o programa de computador Goldman 2

3 PARTE A Geração de Potenciais Eléctricos de Membrana na Câmara de Ussing O desenvolvimento do potencial eléctrico de repouso da célula nervosa pode ser estudado com o modelo da câmara de Ussing que é constituída por dois compartimentos separados por uma membrana selectivamente permeável (Fig.1). Na aula prática irão ser determinados os potenciais através duma membrana selectivamente permeável a catiões que separa duas soluções iónicas de concentrações diferentes. Para medir os potenciais desenvolvidos, irão ser utilizados eléctrodos de AgCl ligados a um galvanómetro (Fig.1). Os potenciais obtidos experimentalmente irão ser comparados com os valores calculados com a equação de Nernst. Figura 1 - Sistema para determinação de potenciais de membrana constituído pela câmara de Ussing 1, eléctrodos de AgCl 2 e galvanómetro 3. 3

4 Experiência 1 Potenciais eléctricos de membrana gerados por gradientes de K + Procedimento experimental Determine os potenciais eléctricos gerados através da membrana da câmara de Ussing nas condições da Tabela I 1.1. Prepare as soluções de KCl de que necessita por diluição da solução 1 M de KCl Adicione, com uma proveta, 100 ml de cada uma das soluções indicadas na Tabela I às câmaras de Ussing Introduza os eléctrodos nas câmaras e ligue o eléctrodo da câmara A à posição ELEKTRODE, e o eléctrodo da câmara B à posição BEZUGSELEKTRODE Leia no galvanómetro o valor do potencial (seleccione a escala de 140 mv). Tenha atenção à polaridade desta escala Repita a leitura ao fim de um minuto e anote os valores na Tabela I. Tabela I KCl (M) Medido Potencial eléctrico (mv) Teórico Câmara A Câmara B 0 min 1 min Concentração Actividade 0,01 0,01 0,01 0,001 0,1 0,001 0,1 0,01 Cálculo do potencial eléctrico 1.6. Calcule com a equação de Nernst os potenciais eléctricos esperados nas condições da Tabela I. Considere que a câmara A corresponde ao meio intracelular e a câmara B ao meio extracelular. Equação de Nernst : E K = RT zf ln [K+ ext. [K + int. R é a constante dos gases perfeitos (1,987 cal/ºk.mol ), T é a temperatura na escala de Kelvin (0 ºC = 273 ºK), z é a valência do ião, e F é a constante de Faraday (23060 cal/v.mol). 4

5 1.7. Provavelmente os valores dos potenciais que calculou são significativamente diferentes dos valores determinados experimentalmente. Note que na equação de Nernst deve utilizar actividades e não concentrações. Torne os seus cálculos mais exactos sabendo que a actividade é igual à concentração do ião vezes o coeficiente de actividade. Utilize os valores dos coeficientes de actividade da Tabela II para corrigir os seus cálculos na Tabela I. Tabela II Coeficientes de actividade de soluções de KCl e de NaCl 0,001 M 0,01 M 0,1 M KCl 0,965 0,902 0,771 NaCl 0,966 0,906 0, Que factores são necessários para que haja desenvolvimento do potencial eléctrico através da membrana? Que factor determinou a grandeza do potencial eléctrico? Experiência 2 Desenvolvimento do equilíbrio electroquímico Procedimento experimental 2.1. Adicione 100 ml de KCl 0,15 M à câmara A e 100 ml de H2O à câmara B 2.2. Coloque os eléctrodos nas câmaras e ligue o galvanómetro na escala de 140 mv Registe na Tabela III os potenciais obtidos nos tempos indicados. Tabela III Tempo (min) Potencial eléctrico (mv) 5

6 2.4. Explique as alterações do potencial eléctrico ao longo do tempo. Acha que o mesmo aconteceria na mambrana celular? Porquê? Experiência 3 Geração de potenciais eléctricos por gradientes iónicos de Na + e de K + existentes na célula 3.1. Planeie experiências para determinar os potenciais de equilíbrio devidos aos gradientes de K + e de Na + existentes numa célula nervosa. Considere que a câmara A corresponde ao meio intracelular e a câmara B ao meio extracelular. Complete a Tabela IV com os valores obtidos Calcule os potenciais esperados com a equação de Nernst. K + Na + Tabela IV Câmara A Câmara B Potencial eléctrico (mv) (intracelular) (extracelular) Medido Teórico 3.3. Relacione os valores dos potenciais obtidos experimentalmente com os valores do potencial de membrana da célula nervosa durante repouso e no pico do potencial de acção. Que conclusões pode tirar acerca da permeabilidade da membrana durante repouso e durante o potencial de acção? 6

7 PARTE B Simulação do desenvolvimento do potencial eléctrico de membrana com o programa de computador Goldman O potencial eléctrico de membrana de um neurónio pode ser determinado com a equação de Goldman que considera as contribuições de todos os iões a que a membrana é permeável. Equação de Goldman: V m = RT zf PK [ K ln P [ K K + ext. + int. + P + P Na Na [ Na [ Na + + ext. int. + PCl[ Cl + P [ Cl Cl int. ext. O programa "Goldman" permite determinar os potenciais de equilíbrio dos iões Na +, K + e Cl -, e o potencial de membrana quando se varia a concentração ou a permeabilidade da membrana àqueles iões. Experiência Determine os potenciais eléctricos da membrana do axónio gigante da lula nas várias condições indicadas na Tabela I. (Note os valores das concentrações intra- e extracelulares de Na + e K + no caso dum animal marinho). Tabela I K + Na + [intra [extra g/g(k) [intra [extra g/g(k) , , , , , ,01 Vm (mv) 1.2. Relacione as alterações do potencial de membrana verificadas com as alterações das concentrações de Na + e de K +. 7

8 1.3. Calcule, utilizando a equação apropriada, o potencial de membrana que se esperaria com os parâmetros indicados na experiência 1 da Tabela I. Experiência Determine os potenciais eléctricos da membrana do axónio de um mamífero terrestre, obtidos com as várias condições indicadas na Tabela II. (Nota: Altere a concentração intracelular de Cl - para 4 mm, e a extracelular para 103 mm, e o quociente g/g(k) para 0,0). Tabela II K + Na + [intra [extra g/g(k) [intra [extra g/g(k) , , , , , ,03 Vm (mv) 2.2. Calcule, utilizando a equação apropriada, o potencial de membrana teórico que se esperaria com os parâmetros indicados na experiência 1 da Tabela II. (Nota: Tenha em atenção a temperatura do animal) Um dos métodos utilizado para estimular neurónios em cultura é aplicar uma solução contendo 50 mm de KCl. Tendo em atenção os resultados obtidos, explique como essa solução estimula as células. 8