PRODUÇÃO DE LIPASES FÚNGICAS POR FERMENTAÇÃO NO ESTADO SÓLIDO COM APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS

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1 PRODUÇÃO DE LIPASES FÚNGICAS POR FERMENTAÇÃO NO ESTADO SÓLIDO COM APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS Michelle Aparecida Coelho Moreira¹, Maria Luiza Fernandes Rodrigues², Nadia Krieger 3 1 Acadêmica do curso de Tecnologia em Bioprocessos e Biotecnologia da Universidade Tuiuti do Paraná (Curitiba,PR). 2 Doutora em Química Orgânica. Prof a. Orientadora e Adjunto da Faculdade de Ciências Biológicas e de Saúde da Universidade Tuiuti do Paraná. Curitiba, Paraná, Brazil. 3 Doutora em Química. Prof a. Orientadora e Titular, Laboratório de Tecnologia Enzimática e Biocatálise (LTEB), Departamento de Química da Universidade Federal do Paraná, Curitiba, Paraná, Brazil. Endereço para correspondência: Maria Luiza Fernandes Rodrigues mlmfernandes@hotmail.com RESUMO A parte experimental do presente trabalho foi desenvolvida nos Laboratórios de Tecnologia Enzimática e Biocatálise (LTEB), Departamento de Química da Universidade Federal do Paraná e no laboratório de Microbiologia da Faculdade de Ciências Biológicas e de Saúde da Universidade Tuiuti do Paraná. Neste trabalho foram estudados vinte e oito isolados de fungos Rhizopus sp cedidos pelo Professor Jesús Cordova (Universidade de Guadalajara, México). Essas estirpes, consideradas termofílicas e termotolerantes, foram inicialmente inoculadas em meio BDA (batata, dextrose ágar) e incubadas a 30 C durante 7 dias. Após esse período, somente nove cepas cresceram e apenas três apresentaram atividade lipolítica. Estas três cepas foram chamadas de Rhizopus R64a; Rhizopus 8a e Rhizopus 51a. Todas as três cepas produtoras de lipases foram mantidas em meio sólido de BDA. Após o isolamento, a próxima etapa do trabalho foi a produção de lipases fúngicas por Fermentação no Estado Sólido (FES), a determinação da atividade enzimática através de testes analíticos e a aplicação das enzimas em reações de hidrólise de triacilgliceróis e síntese do oleato de etila. Palavras-chaves: Rhizopus sp; lipases; FES. ABSTRACT The experimental parto of this Project was developed in the Enzime and Biocatalysis Technology Laboratory, in the Chemical Department of Universidade Federal do Paraná (Federal University of Paraná State), and in the Microbiology Laboratory of Faculdade de Ciências Biológicas e de Saúde da Universidade Tuiuti do Paraná (Biologic Science and Health Department of Tuiuti University of Paraná). This project studied twenty-eight isolates of fungi Rhizopus sp assigned by the teacher CORDOVA, Jesús (University of Guadalajara - Mexico). These strains, considered thermophilic and thermotolerant were inculate at begin in Petri dishes with means of Potato Dextrose Agar (PDA) agent, and incubated at 30 C for 7 days. From this nine strains, only three showed lipolytic activity. These three strains were called as Rhizopus R 64a; Rhizopus 8a and Rhizopus 51a. After isolation, the next step in the project was the production of fungal lipases in Solid State Fermentation (SSF), the determination of enzymatic activities by analytical tests and the application of enzymes in reactions of hydrolysis of triacylglycerols and synthesis of ethyl oleate. Keywords: Rhizopus sp; lipases, SSL

2 1. INTRODUÇÃO As lipases (triacilglicerol éster hidrolase, E.C ) são enzimas hidrolíticas que "in vivo" catalisam a hidrólise de triacilgliceróis de cadeia longa (acima de 10 átomos de carbono), sendo a trioleína o seu substrato padrão, aos ácidos graxos correspondentes e glicerol, constituíndo uma classe especial de carboxil éster hidrolases (Diaz et al., 2006). Do ponto de vista de desenvolvimento de aplicações, está relacionada com a diversidade de sua função catalítica. "In vitro", as lipases também atuam como catalisadores em diversas reações, com alta especificidade, estabilidade e condições reacionais brandas, incluindo as reações de esterificação, transesterificação, lactonização, acilação regioseletiva e aminólise, quando a quantidade de água do sistema em que estão presentes é suficientemente baixa a ponto de deslocar o equilíbrio termodinâmico no sentido da síntese (Fernandes, 2006 a,b; Foresti, 2006; Fernandes et al., 2004). Existem dois tipos básicos de fermentação para produção de lipases, proteases e outros metabólitos: Fermentação Submersa (FS) e Fermentação em Estado Sólido (FES). Na FES, o microrganismo cresce em substratos sólidos umedecidos ou suportes inertes, na ausência (ou quase) de água livre, e na FS, os substratos são dissolvidos em meio líquido. Neste caso, o microrganismo pode crescer entre os fragmentos do substrato (dentro da matriz do substrato) ou sobre a superfície, consumindo o substrato e secretando metabólitos, dentre os quais as enzimas (Mitchell et al., 2006). O material sólido é insolúvel e age como suporte físico e como fonte de nutrientes, poderá ser um substrato sólido natural, como resíduos da agricultura, ou um suporte inerte, como poliuretano ou resinas poliméricas (Fernandes, 2006 b). A bioconversão de resíduos agroindustriais tornou-se, atualmente, um objetivo de várias indústrias. Pensa-se em como diminuir os resíduos gerados pelas fábricas, como uma simples tentativa de compensar a poluição já existente no meio ambiente. Analisando o contexto da poluição já existente, temos o dever de conter ou mesmo tentar amenizar os resíduos gerados. Exemplificando a situação podemos citar as indústrias de alimentos que diariamente produzem toneladas de lixo orgânico e inorgânico. A reutilização bioconversão pode ser feita. Técnicas de manejo são empregadas efetivamente para que tais resíduos tenham destinação correta. Resíduos maus tratados e com destinação incorreta podem gerar graves problemas de saúde e ambientais. Os mesmos, quando jogados erroneamente são desperdício de fonte de energia e muitas vezes de matéria-prima para outra atividade. Pode-se trabalhar com a compostagem de matéria orgânica na produção de adubos e também na utilização de fonte de energia. Os resíduos contêm muitas substâncias de alto valor (Germano, 2000). Dentro deste contexto, este trabalho pretende contribuir para o conhecimento dos processos fermentativos usando materiais sólidos, estudando a produção de lípases e proteases por fungos filamentosos em FES, utilizando substratos baratos e resíduos agroindustriais, e sua aplicação em reações de hidrólise ou síntese com possíveis aplicações industriais. Desta maneira, pretende-se aliar a produção de enzimas com características desejáveis (estabilidade em solventes e termoestabilidade), a partir de substratos de baixo custo, à sua utilização em biocatálise (reações de hidrólise e síntese). O objetivo do presente trabalho é estudar o isolamento de três cepas de Rhizopus sp. produtoras de lipase por Fermentação em Estado Sólido (FES). 2

3 2. MATERIAIS E MÉTODOS O presente trabalho foi desenvolvido nos Laboratórios de Tecnologia Enzimática e Biocatálise (LTEB), Departamento de Química da Universidade Federal do Paraná e no Laboratório de Microbiologia da Faculdade de Ciências Biológicas e de Saúde da Universidade Tuiuti do Paraná. As cepas isoladas ainda não foram caracterizadas, mas poderão ser enviadas para caracterização no Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA, UNICAMP) Microrganismo Os microrganismos utilizados neste trabalho foram isolados de fungos Rhizopus sp e foram gentilmente cedidos pelos Professores Jesús Cordova da Universidade de Guadalajara, no México, e pela Professora Nadia Krieger do Departamento de Química da Universidade Federal do Paraná Esterilização dos Meios e Equipamentos Para garantir condições estéreis de crescimento dos microrganismos, os meios sólidos de propagação, do inóculo e de produção, bem como todos os materiais utilizados foram esterilizados em autoclave a 121 C, durante 15 min Seleção de Cepas Lipolíticas Seleção e manutenção de cepas lipolíticas em placas de Petri Os prováveis produtores de lipase, vinte e oito isolados de fungos Rhizopus sp, foram cedidos pelo Professor Jesús Cordova (Universidade de Guadalajara, México). Essas estirpes, consideradas termofílicas e termotolerantes, foram inicialmente inoculadas em placas de Petri contendo o meio BDA (batata, dextrose ágar) e incubadas a 30 C durante 7 dias. Após esse período de incubação, somente nove cepas fúngicas cresceram. Dessas nove cepas, apenas três apresentaram atividade lipolítica. Estas três cepas foram chamadas de Rhizopus R 64 a; Rhizopus 8 a e Rhizopus 51 a. Essas cepas isoladas são mantidas em meio sólido de ágar batata-dextrose (BDA) com repiques mensais e também em estoque em óleo mineral Preparo do Inóculo Para obtenção do inóculo, cada cepa do fungo Rhizopus sp. produtora de lipase foi primeiramente inoculada em placas de Petri contendo BDA e incubada por 7 dias, a 30 C. Após esse período de incubação, os esporos foram raspados, suspensos em água destilada estéril contendo Tween 80 (0,01% v/v) e submetidos à agitação magnética até a obtenção de uma solução homogênea. A concentração de esporos na suspensão foi determinada por contagem em câmara de Neubauer. A concentração final de esporos no meio sólido foi de 3,0x10 7 esporos/gss. 3

4 2.4. Fermentação no Estado Sólido Preparo do Substrato Para os estudos de FES, foram estudados dois substratos, o farelo da semente de girassol e o bagaço da cana-de-açúcar. O bagaço da cana, fornecido pela indústria Melhoramentos (Jussara, PR), foi submetido ao processo de tamisação e partículas entre 1,7 mm e 1 mm foram selecionadas. Em seguida, o bagaço foi lavado três vezes com água destilada e foi seco a 80 C por 24 h. Para obtenção do farelo de girassol, sementes da planta, adquiridas no comércio local, foram trituradas em moinho elétrico, peneiradas e a granulometria adotada foi de 1,4 e 0,85 mm. Em cada experimento, adicionaram-se proporções de 50 % de girassol e 50 % de bagaço de cana-de-açúcar, que eram misturados, umedecidas com 40 ml de tampão fosfato 0,1 mol/l, ph 7,0. Após o preparo, os substratos foram autoclavados a 121 C, 1 atm por 15 min Determinação da Umidade dos substratos A umidade inicial dos substratos, previamente umedecidos com tampão fosfato 0,1 mol/l, ph 7,0 e autoclavados foi determinada em balança de infravermelho (Gehaka), utilizando-se 1 g de amostra Condições de cultivo no meio sólido Os ensaios de FES foram realizados em frascos Erlenmeyers de 250 ml, contendo 10 g do substrato (5 g de farelo da semente de girassol e 5 g do bagaço da cana-de-açúcar). Após o preparo, os substratos foram inoculados assepticamente com a suspensão de esporos, mantendo-se uma concentração final no meio sólido de 3,0x10 7 esporos/gss. Após inoculação, os meios foram incubados em estufa a 40 C. A produção de lipase foi quantificada e acompanhada pela dosagem da atividade lipolítica diretamente no sólido fermentado liofilizado, através do método titulométrico. A atividade lipolítica dosada será expressa como unidades de atividade enzimática por grama de sólido fermentado (U/gSS) Liofilização do Sólido Fermentado Para a liofilização, o sólido fermentado foi transferido para balões de fundo redondo, resfriado em congelador (-18ºC) por 24 h e submetido à liofilização por mais 48 h. Depois de liofilizado, o sólido foi acondicionado em sacos plásticos, os quais foram armazenados em potes plásticos, à temperatura ambiente Biocatálise: Estudo da Síntese do Oleato de Etila Para os estudos de síntese utilizaram-se os sólidos fermentados (adição direta) liofilizados. 4

5 Adição Direta do Material Fermentado Nestes experimentos, a enzima foi produzida por FES e no pico máximo de produção da enzima, o cultivo foi interrompido e o material fermentado foi liofilizado. Estudos cinéticos foram realizados para a verificação de síntese do oleato de etila (Figura 1). O OH + OH Enzim a O O + H 2 O acido oleico etanol oleato de etila Figura 1. Reação de síntese do oleato de etila catalisada pela lipase. Os substratos utilizados foram o ácido oléico (70 mm) e o etanol (350 mm). As reações foram realizadas utilizando-se 1 g material fermentado na temperatura de 37 0 C. As reações foram realizadas em agitador orbital, a 200 rpm e acompanhadas durante 1 h. A conversão em éster foi avaliada pelo método de Lowry-Tinsley (1976). O monitoramento da reação de síntese foi acompanhado durante 60 min, sendo retiradas alíquotas do meio reacional nos intervalos de tempo zero até 60 min. A conversão em éster foi avaliada pelo método de Lowry-Tinsley (1976). Em cada análise foi realizado ensaio-padrão (branco) com um controle negativo contendo o material fermentado, meio reacional com ausência do ácido carboxílico (ácido oléico). O objetivo desta etapa foi garantir que a catálise da reação de síntese do oleato de etila estava ocorrendo somente pela presença da lipase Métodos Analíticos Determinação da atividade lipolítica em meio aquoso pelo método titulométrico Ensaios de atividade frente ao triacilglicerol foram realizados utilizando a trioleína como substratos. A determinação da atividade de lipases por titulometria foi baseada no método proposto por Stuer et al. (1986), com modificações. O método baseia-se na titulação com NaOH dos ácidos graxos liberados pela ação da enzima a partir dos triacilgliceróis (Figura 2). Figura 2. Reação de hidrólise de triacilgicerol catalisada por lipases. 5

6 O meio reacional para o substrato trioleína (óleo de oliva, Marca La Violetera) foi previamente preparado na forma de emulsão. A emulsão foi composta por solução de Tris-HCl 0,25 mm e NaCl 150 mm, CaCl 2 2mM, goma arábica 3% e pelo substrato trioleína (1,0 mm). Os ácidos graxos liberados dos substratos emulsificados pela ação da enzima foram titulados com NaOH 0,05 M, em titulador automático ph-stat (Metrohm 718 Stat Titrino), a 37 C e ph 7,0 por 5 mim. Uma unidade de atividade enzimática é definida como a liberação de 1 mol de ácido graxo por minuto, nas condições do ensaio Determinação da atividade lipolítica em meio não-aquoso A determinação de atividade lipolítica em meio não-aquoso foi feita pelo método de Lowry-Tinsley (1976). Este é um método espectrométrico e foi utilizado para quantificar o teor residual de ácidos graxos durante a síntese do oleato de etila. Trata-se de um método colorimétrico que mede a coloração do complexo azul-esverdeado (715 nm) formado entre os íons Cobre II e os ácidos graxos livres, solúveis em fase orgânica (Figura 3). A conversão em éster foi calculada a partir do consumo do ácido graxo do meio reacional. A concentração de ácido graxo no meio foi relacionada à absorbância através da curva de calibração feita com ácido oléico e nas mesmas condições do ensaio. Figura 3. Complexo formado entre os íons Cobre II e os ácidos graxos livres. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1. Composição Físico-Química dos Substratos Neste trabalho foram empregados os seguintes substratos: farelo de semente de girassol (FSG) e bagaço da cana-de-açúcar (BCA), preparados no laboratório. O bagaço de cana foi fornecido pela indústria Melhoramentos, Jussara-PR. A Tabela 1 apresenta os resultados da composição físico-química dos substratos FSG e BCA. As análises do FSG foram realizadas pelo CEPPA (Centro de Pesquisa e Processamento de Alimentos da UFPR) e as análises do BCA foram realizadas pela indústria Melhoramentos. Como pode ser observado na Tabela 1, o FSG possui um maior teor de lipídeos (25,9 %) em relação ao BCA (menor que 1 %). 6

7 Estes resultados estão de acordo com a origem e o tipo de processamento que estes materiais sofreram antes de serem utilizados como substratos. O FSG foi preparado moendo-se sementes de girassol e classificando-se a farinha resultante e, portanto, por se tratar de um material integral, era de se esperar que o seu conteúdo lipídico fosse alto. Tabela 1. Composição físico-química dos substratos utilizados para produção de lipases por Rhizopus sp. Substrato Lipídeos % Carboidratos Proteínas % Fibras % FSG 25,9% 45,7% 18,0% 28,5% BCA menor que 2 % % % 3.2. Estudo da Produção de Lipases por Rhizopus sp Ensaios Preliminares Com relação ao estudo sobre isolamento e cultivo dos microrganismos, foram estudados vinte e oito isolados de fungos Rhizopus sp cedidos pelo Professor Jesús Cordova (Universidade de Guadalajara, México). Essas estirpes, consideradas termofílicas e termotolerantes, foram inicialmente inoculadas em placas de Petri contendo o meio BDA (batata, dextrose ágar) e incubadas a 30 C durante 7 dias. Após esse período de incubação, somente nove cepas fúngicas cresceram. Dessas nove cepas, apenas três apresentaram atividade lipolítica. Essas cepas isoladas são mantidas em meio sólido de ágar batatadextrose (BDA) com repiques mensais e também em estoque em óleo mineral. Para verificar se as cepas fúngicas de Rhizopus sp eram produtoras de lipase, foram realizados testes em placas de Petri com meio em ágar contendo o corante Rodamina B 0,001 %, óleo de oliva 1 %, MgSO 4.7H 2 O 0,2 g/l; K 2 HPO 4 0,7 g/l, KH 2 PO 4 0,4 g/l; extrato de levedura 2,0 g/l e Tween 80 0,01 %. A produção de lipase em placas de Petri foi confirmada pela presença de halos alaranjados, fosforescentes ao UV, após 24, 48, 72, 96, e 120 h de incubação em estufa a 29 0 C (Figura 4). Todas as três cepas produtoras de lipases são mantidas em meio sólido de ágar batata-dextrose (BDA) com repiques mensais e também em estoque em óleo mineral. Figura 4. Produção de lipase pelas cepas de Rhizopus sp. em placas de Petri contendo ágar, contendo o corante Rodamina B 0,001 %, óleo de oliva 1 %, MgSO 4.7H 2 O 0,2 g/l; K 2 HPO 4 0,7 g/l, KH 2 PO 4 0,4 g/l; extrato de levedura 2,0 g/l e Tween 80 0,01 %. O resultado positivo é indicado pelo halo de fosforescência alaranjada que é visualizado quando a placa é irradiada ao UV em 365 nm. 7

8 Atividade (U/gSS) 3.3. Produção de Lipases por FES utilizando Resíduos Agroindustriais Um dos parâmetros mais importantes na produção de enzimas por FES é o tipo de substrato utilizado. Na FES, o microrganismo cresce em substratos sólidos umedecidos ou suportes inertes, na ausência (ou quase) de água livre. Neste caso, o microrganismo pode crescer entre os fragmentos do substrato (dentro da matriz do substrato) ou sobre a superfície do substrato, consumindo o substrato e secretando metabólitos, dentre os quais as enzimas (Mitchell et al., 2006; Rajard et al., 2005). O material sólido é insolúvel e age como suporte físico e como fonte de nutrientes. O material sólido poderá ser um substrato sólido natural, como resíduos da agricultura, ou um suporte inerte, como poliuretano ou resinas poliméricas (Pandey, 2003). Para a produção de lipases foram utilizados os substratos FSG e BCA. O FSG agiu como fonte de nutrientes, principalmente de lipídeos (25,9 %), enquanto que o BCA apenas como suporte físico, pois apresenta baixo teor de lipídeos (menos de 1 %). Para a determinação de produção de lipases utilizou-se o método titulomético, conforme descrito em Analisando-se a Figura 5, verifica-se que a maior produção de lipases ocorreu em 18 h de fermentação para os três fungos estudados (Rhizopus R 64 a; Rhizopus 51 a; Rhizopus R 8a). Através da Figura verifica-se que a maior produção de lipase ocorreu para o fungo Rhizopus 51 a (37 U/gSS), seguido dos fungos Rhizopus R 8a (32 U/gSS) e Rhizopus 64a (31 U/gSS). Como os resultados de atividade lipolítica obtidos para os três fungos foram muito próximos, então, foi realizado ensaios de atividade de esterificação. A reação modelo de síntese estudada foi a do oleato de etila Tempo (horas) Figura 5. Produção de lipase por Rhizopus sp. por Fermentação no Estado Sólido. Rhizopus R 64 a (- -); Rhizopus 51 a (- -); Rhizopus R 8a (- -). Os ensaios foram realizados com umidade de 55 %. Experimentos realizados em triplicata com temperatura de 40 C Biocatálise: Estudo e Otimização da Reação de Síntese do Oleato de Etila Nos estudos de biocatálise realizou-se a FES a 40 0 C, mistura de FSG (5 g) e BCA (5 g) contendo 55 % de umidade e 3x10 7 esporos/ml. No pico máximo de produção da enzima (18 h), o cultivo foi interrompido e o material fermentado foi liofilizado. Estudos cinéticos foram realizados para a verificação de síntese do oleato de etila. O método utilizado nesta etapa foi o de Lowry-Tinsley (1976), que dosa os 8

9 % Éster ácidos graxos livres no meio reacional. O substrato BCA foi escolhido porque era importante demonstrar a possibilidade de utilização de um subproduto industrial em biocatálise. Ensaios foram realizados utilizando-se 1 g do material fermentado e liofilizado, em n-heptano, a 37 0 C, com uma razão molar 1:5 (ácido/álcool). Os ésteres de ácidos graxos de cadeia longa, como os oleatos, palmitatos e linolenatos são os principais constituintes do biodiesel. O oleato de etila, estudado neste trabalho, é utilizado como aditivo biológico, plastificante do policloreto de vinila (PVC), agente resistente à água e como fluído hidráulico (Hazarika et al., 2002) Tempo de reação (min) Figura 6. Variação na conversão do oleato de etila em função do tempo utilizando-se o sólido fermentado e liofilizado, contendo a lipase de Rhizopus sp. produzida por FES. Rhizopus 51 a (- -); Rhizopus 64 a (- -) e Rhizopus R 8a (- -). Os ensaios foram realizados a 37 C em n-heptano, com razão molar 1:5 (ácido:álcool) e 1 g de material fermentado. Os resultados apresentados na Figura 6 mostraram que a enzima catalisou a síntese do oleato de etila, após 1 h de reação para as três cepas de Rhizopus estudadas. A melhor conversão em éster (93 %) ocorreu para o fungo Rhizopus R 8a, seguido do Rhizopus 64 a (76 %). A menor conversão em éster foi obtida para o fungo Rhizopus 51 a (43 %). 4. CONCLUSÕES Neste trabalho, foi realizado o screening de microrganismos produtores de lipases. Foram estudadas vinte e oito cepas de fungos Rhizopus sp, cedidas pelo Professor Jesús Cordova (Universidade de Guadalajara, México). Dentre as vinte e oito cepas, apenas nove cresceram, sendo que destas, somente três apresentaram atividade lipolítica. Na etapa de produção de enzimas por FES utilizando-se resíduos agroindustriais, os resultados de hidrólise da trioleína demonstraram que as três cepas de Rhizopus sp. apresentaram resultados semelhantes (próximo a 30 U/gSS), sendo necessário a realização de experimentos para verificar a atividade de esterificação. Nos ensaios de síntese do oleato de etila, a maior conversão em éster (93 %) foi obtida pela lipase do fungo Rhizopus R 8a. O oleato de etila é um dos ésteres do biodiesel. A partir destes resultados obtidos neste trabalho poderão ser realizados estudos para verificar a possibilidade de reutilização do sólido fermentado na síntese do oleato de etila. 9

10 5. AGRADECIMENTOS Agradeço a pesquisadora e orientadora Maria Luiza F. Rodrigues, a Universidade Tuiuti do Paraná e a Universidade Federal do Paraná, pelo apoio ao desenvolvimento deste trabalho. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the quantiation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 72, , DIAZ, J.C.M.; RODRÍGUEZ, S.; ROUSSOS, J.; CORDOVA, A.; ABOUSALHA.; CARRIÉRE, F.; BARATTI, J. Lipases from the thermotolerant fungus Rhizopus homothallicus is more thermostable when produced using solid state fermentation than liquid fermentation procedures. Enzyme Microbial Technol., v. 39, p , FERNANDES, M.L.M.; SAAD, E.B.; MEIRA, J.A.; RAMOS, L.P.; MITCHELL, D.A.; KRIEGER, N. Esterification and transesterification reactions catalysed by addition of fermented solids to organic reaction media. J. Mol. Catalysis B: Enzymatic., v. 263, 8-13, 2006 a. FERNANDES, M.L.M. Produção de Lipases por Fermentação no Estado Sólido e sua utilização em Biocatálise. Curitiba, 2006 b. Tese (Doutorado em Química Orgânica) Setor de Ciências Exatas, Universidade Federal do Paraná. FERNANDES, M.L.M.; KRIEGER, N.; BARON, A.O; ZAMORA, P.P.; RAMOS, L.P.; MITCHELL, D.A. Hydrolysis and synthesis reactions catalysed by Thermomyces lanuginosa lipase in AOT/Isooctane reversed micellar system. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic., v. 30, p , FORESTI, M.L.; ERRAZU, A.; FERREIRA, M.L. Effect of several reaction parameters in the solvent-free ethyl oleate synthesis using Candida rugosa lipase immobilised on polypropylene powder. Biochem. Eng. J., v. 25 (1), p , GERMANO, S. Desenvolvimento de Bioprocessos para a produção e caracterização de proteases de Penicillium sp. por Fermentação no Estado Sólido. Curitiba, Tese (Doutorado em Agroindústria)-Setor de Tecnologia, Universidade Federal do Paraná. HAZARIKA, S.; GOSWAMI, P.; DUTTA, N.N.; HAZARIKA, A.K. Ethyl oleate synthesis by Porcine pancreatic lipase in organic solvents. Chemical Eng. J., v. 85 (1), p , LOWRY, R.R AND TINSLEY, J.I. Rapid colorimetric determination of free fatty acids. J. Am. Oil Chem. Soc., 53, , MITCHELL, D.A.; BEROVIC, M.; NOPHARATANA, M.; KRIEGER, N. The bioreactor Step of SSF: A Complex Interaction of Phenomena. In: Mitchell, D.A.; Krieger, N.; Berovic, M. Ed. Springer, p.13-32, Heidelberg, PANDEY, A. Solid-state fermentation. Biochem. Eng. J., v. 13, p , STUER, W.; JAEGER, K.E.; WINKLER, U.K. Purification of extracellular lipase from Pseudomonas aeruginosa. J. BACTERIOL., v. 168, p ,