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Thiago Gusmão Fialho
8 Há anos
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14 IV-14 & * % -/.B --! -/ A!1" 8 T 2?!-B -! -?!.1 T 2 -?!.B -/ A! 1/ A2-?!.B -!1 T 2 T * ; ( " $ 6 ;1 2 T " 6 0 " 6 D # " (# 0 ( * & ' & 0 ) M.N 0 * # " (# * 121 C 2 1' 2 * =+! #` # - * $ #` 4 5, ( # $ % & " + ) +<$ ; $ ( $ A" ( W -<= +== $ ><S " W $ +<? $ $ 5 2 Um baixo valor de Km indica uma alta afinidade da enzima com seu substrato. MAN

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istura de solução de NaOH 2,5 N a uma solução de sulfato de cobre a 1%, na proporção 5:3. 4 Dissolver 0,1 g de vermelho de fenol em 250 ml de água destilada alcalinizada com 2,82 ml de NaOH 0,1 N.

16 IV-16? >= K $ 6 $ *.>? - K T E $ +<.=.= $ E 0 E 8 +K +S A literatura fornece os seguintes valores [3] (V máx e K m dependem da concentração de enzima utilizada): [uréia], kmol/m 3 0,2 0,02 0,01 0,005 0,002 -r uréia, kmol/m 3.s 1,08 0,55 0,38 0,2 0,09 Para concentração de urease [E] de 5 g/dm 3. Em outra fonte [2]: Km = 4, mol.l -1, para urease em 50% de glicerina, 1000 U/ml. 4 + & *. * A 7 ( [ * / + $ +A - # * & * A +, +,M' N1$ K ] ( O ^ 2.? # " (# * F& / a b!% # " (#? A? * <? " L ; 6 9 T >? D=S T 8 =<. =+,. ===+ $, ((((O * 6 % / -? %' K 1P 5 ) E2+IDD - ((((K W & %? & #9' FE_ R c $ ) _ \ &. 5!R K & E' &? " E & $ $. P ' %) ( +III

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17 IV OBJETIVOS: Determinar a estabilidade térmica da enzima urease na forma solúvel e imobilizada a 60 o C. INTRODUÇÃO: A determinação da estabilidade térmica da enzima é um fator de grande importância prática, uma vez que, do ponto de vista industrial deseja-se ter um catalisador com alta atividade e um longo tempo de meia vida. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA: A Atividade catalítica das enzimas depende da temperatura, e como no caso dos catalisadores convencionais, à medida que se aumenta a temperatura a taxa de reação aumenta, porém, a estabilidade da proteína decresce devido a desativação térmica. A desnaturação da enzima pelo efeito da temperatura, normalmente é obtida incubando-se a enzima em água, solução tampão ou em presença do substrato por um certo período de tempo e, em seguida, determinando-se a atividade residual. Neste caso os gráficos são construídos relacionando-se a atividade relativa em função do tempo. A relação entre a atividade inicial (A inicial ) e a residual (A residual ) num determinado tempo é do tipo exponencial (Dixon & Webb citado por ZANIN, 1996) A inicial = A residual.exp (K d. t) (1) Onde, A inicial atividade enzimática inicial observada no reator sem incubação da enzima. A residual atividade enzimática residual observada no reator, após um certo período de incubação. K d constante de desnaturação da enzima em uma determinada temperatura, modelo exponencial (h -1 ). t tempo de incubação. A partir da curva de ln (A residual /A inicial ) em função do tempo pode-se obter o valor da constante de desnaturação (K d ). Outra característica importante da estabilidade da enzima, é o tempo de meia-vida (t 1/2 ) que representa o tempo necessário para que a atividade seja reduzida à metade do seu valor inicial num determinado conjunto de condições. Se a atividade decresce com a equação

18 IV-18 1, há uma relação inversamente proporcional entre o tempo de meia-vida e o coeficiente de desnaturação ou inativação (modelo exponencial). t 1/2 = ln 0,5/K d = 0,693/K d (2) METODOLOGIA: a) ENZIMA SOLÚVEL: Colocar a solução de enzima em um banho a 60 o C e acionar o cronômetro. Esta solução estoque de enzima deve permanecer incubada a 60 o C, sendo que em intervalos de 30 minutos, uma alíquota de 3 ml é retirada para a determinação da atividade residual a 37 o C. A atividade residual é determinada, pelo método das atividades iniciais e de acordo com a metodologia descrita na prática 12 (Cinética enzimática:determinação da constante de Michaelis-Menten). b) ENZIMA IMOBILIZADA Colocar as 4 cestas numeradas no banho a 60 o C, e a cada 30 minutos determinar a atividade residual da urease, procedendo como no caso da enzima solúvel. RESULTADOS: Determinar os valores da atividade residual e de K d para a enzima solúvel e imobilizada.

Esta solução estoque de enzima deve permanecer incubada a 60 o C, sendo que em intervalos de 30 minutos, uma alíquota de 3 ml é retirada para a determinação da atividade residual a 37 o C.

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