Transferência de Imunidade Adotiva como Estratégia de Imunização para o vírus Dengue 2

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1 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Pós-Graduação em Imunologia Básica e Aplicada Transferência de Imunidade Adotiva como Estratégia de Imunização para o vírus Dengue 2 Maria Teresa Prudente de Aquino Ribeirão Preto- SP 2003

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3 Maria Teresa Prudente de Aquino Transferência de Imunidade Adotiva como Estratégia de Imunização para o vírus Dengue 2 Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, para obtenção de título de Mestre em Imunologia Básica e Aplicada Opção- Bioagentes Patogênicos. Orientador: Prof. Dr. Benedito Antônio Lopes da Fonseca Ribeirão Preto- SP 2003

4 FICHA CATALOGRÁFICA AQUINO, Maria Teresa Prudente de Transferência de Imunidade Adotiva como Estratégia de Imunização para o vírus Dengue 2. Ribeirão Preto, p. : il.; 30cm Dissertação de Mestrado- Apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP- Área de Concentração: Imunologia Básica e Aplicada, opção: Bioagentes Patogênicos. Orientador: Fonseca, Benedito Antonio Lopes da 1. Transferência de Imunidade Adotiva. 2. Dengue

5 Abreviaturas ΔR n - sinal de fluorescência ADE- aumento dependente de anticorpo APC- célula apresentadora de antígeno BSA- albumina de soro bovino C - proteína do capsídeo do vírus dengue C- controle negativo C1q, C3, C4, C5- proteínas do sistema complemento C3a e C5a- anafilatoxinas do sistema complemento C6/36- células da linhagem do mosquito Aedes albopictus CD62L- selectina-l cdna- DNA complementar Con-A- concanavalina A Ct- ciclo de limiar CTL- linfócito T citolítico DEN- vírus dengue DF- febre de dengue ou dengue clássica DHF- febre de dengue hemorrágica DNA- ácido desoxirribonucléico dntp- deoxinucleotídeo DSS- síndrome de choque por dengue ELISA- ensaio imunoenzimático Fc γ - receptor Fc gama FrhL- células de pulmão de feto de macaco rhesus Gag- HIV- proteína gag de HIV HA- hemaglutinina HIV-1- vírus da imunodeficiência adquirida tipo 1 HLA- antígeno leucocitário humano IE- índice de estimulação IFN-γ - interferon gama

6 Ig- imunoglobulina IL- interleucina M- proteína da membrana madura MHC- complexo de histocompatibilidade principal NGC- linhagem de dengue-2 New Guinea C NS- proteína não estrutural PAF- fator ativador de plaquetas PBMC- células mononucleares do sangue periférico PBS- solução salina de fosfato PCR- reação em cadeia da polimerase pd(n) 6 - primer randômico PDK- células primárias de rim de cachorro PFC- célula formadora de placa PFU- unidade formadora de placa PGMK- células primárias de rim de macaco verde africano PrM proteína pré- membrana PRNT- teste de neutralização e redução de placa RNA- ácido ribonucléico SBF- soro fetal bovino SF- fator de supressão SNC- sistema nervoso central TCD4 + - linfócito T CD4 TCD8 + - linfócito T CD8 TCGF- fator de crescimento de célula T TNF- β- fator de necrose tumoral beta TNF-α- fator de necrose tumoral alfa TS- célula T supressora UTR- região não traduzível WHO- organização mundial de saúde

7 Sumário 1. INTRODUÇÃO Considerações Gerais Estratégias de imunização para as infecções pelo vírus dengue Transferência de imunidade adotiva como estratégia de imunização OBJETIVOS DELINEAMENTO EXPERIMENTAL MATERIAL E MÉTODOS Cultura de células e linhagens virais Estoque viral propagado em cérebro de camundongos recém nascidos Titulação viral através de ensaio de unidades formadoras de placas (PFU) Extração de RNA através do Kit QIAamp RNA Viral (QIAGEN ) Confecção do DNA complementar (cdna) Reação em Cadeia da Polimerase (PCR convencional) PCR em Tempo Real Animais Cultura de células de baço e estimulação in vitro de linfócitos Preparação dos esplenócitos para inoculação Ensaios de proliferação celular Coleta de sangue para obtenção do soro Desafio intracerebral e análise de sobrevivência Teste de neutralização...41

8 5. RESULTADOS Titulação dos vírus dengue-2 propagados em cérebro de camundongos recém nascidos através de ensaios de unidades formadoras de placas (PFU) Análise dos estoques virais através de PCR convencional Análise dos estoques virais através da PCR em Tempo Real Ensaios de proliferação celular Análise da presença do material genético viral no sobrenadante das células esplênicas estimuladas in vitro com D2 inativado Análise da Sobrevivência após Desafio Intracerebral com vírus Dengue 2 New Guinea C Produção de anticorpos neutralizantes DISCUSSÃO CONCLUSÕES RESUMO SUMMARY REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...86

9 Introdução 8 1. Introdução

10 Introdução Considerações Gerais A febre da dengue é responsável por mais altos índices de morbidade e mortalidade que qualquer outra doença causada por um arbovirus em humanos (Gubler, 1998). É a mais importante doença viral transmitida por artrópodes de significância para a saúde pública (Fonseca & Fonseca, 2002). A cada ano, aproximadamente 100 milhões de casos de febre da dengue e centenas de milhares de febre da dengue hemorrágica ocorrem, dependendo da estrutura epidêmica (Gubler, 1998). Há mais de duzentos anos, a febre da dengue foi reconhecida clinicamente como doença. Durante os séculos XVIII e XIX, a dengue ocorreu como epidemias afetando a Ásia e Américas, em intervalos de várias décadas. A propagação era lenta, restringindo-se a embarcações que carregavam populações de Aedes aegypti e hospedeiros humanos susceptíveis. Este padrão mudou drasticamente durante a Segunda Guerra Mundial, na qual os vírus dengue foram propagados através de militares em campanhas no Pacífico. Múltiplos sorotipos de vírus dengue foram espalhados através de tropas, refugiados, associados aos vetores presentes em veículos, contêineres para estocagem de água e pneus. A disseminação dos vírus e dos vetores aumentou no pós-guerra devido ao rápido crescimento populacional e urbanização descontrolada, aumentando assim as condições para a proliferação dos vetores. Além disso, com o rápido crescimento das viagens aéreas, foram criados meios para a movimentação de seres humanos virêmicos de uma região para outra. Dessa forma, foram estabelecidas infecções hiperendêmicas de dengue no sudeste da Ásia, com padrões de epidemias anuais com os quatro sorotipos do vírus (Gubler, 1998). Neste contexto, houve o surgimento de casos das formas mais severas da doença, a febre de dengue hemorrágica (DHF) e síndrome de choque por dengue (DSS), em 1954 nas Filipinas. Nos anos de 1970 e 1980, a incidência de DHF cresceu dramaticamente e permanece

11 Introdução 10 elevada nos dias atuais. Assim como na Ásia, nas Américas, antes da Segunda Guerra Mundial, as epidemias de dengue eram raras, passando a serem mais freqüentes no pós-guerra, num período mais tardio que na Ásia. Durante os anos 60 os vírus dengue tipo 2 e 3 estabeleceram-se na região e em 1977, dengue tipo 1 foi introduzido. As endemias deixaram de ser intermitentes e passaram a ser anuais em vários locais com a cocirculação dos múltiplos sorotipos do vírus. A primeira verdadeira deflagração de uma epidemia com casos de DHF nas Américas ocorreu em Cuba no ano de 1981, com 116 mil hospitalizados, 34 mil casos documentados e 158 mortes (Monath, 1994). A partir de 1997, foram registrados casos de DHF em pelo menos 24 países americanos. No Brasil, em 1973, o principal vetor A. aegypti foi considerado extinto porém, três anos mais tarde, o vetor reapareceu e desde então foi gradualmente espalhando-se pelo país. Os primeiros casos relatados de dengue foram no estado de Roraima no início dos anos 80, com a circulação dos sorotipos 1 e 4. Em 1986, a primeiras epidemias ocorreram no Rio de Janeiro e nas capitais do nordeste. Desde então, a dengue tornou-se endêmica no país, com epidemias que introduziam novos sorotipos em regiões anteriormente não infectadas. Em 1990, houve a circulação do sorotipo 2 no estado do Rio de Janeiro. A partir dos anos 90, a incidência de dengue aumentou como conseqüência da disseminação do A. aegypti, principalmente em 1994 e com ele a dispersão de novos sorotipos para novas áreas. Entre 1999 e 2000, surgiram várias epidemias, principalmente nos grandes centros urbanos do sudeste e nordeste onde a maioria dos casos ocorreu. Em dezembro de 2000, foi detectada pela primeira vez a introdução do sorotipo 3 no estado do Rio de Janeiro, e subseqüentemente, no estado de Roraima em novembro de 2001 (Silva Jr et al., 2002). Atualmente, a dengue continua sendo uma doença endêmica no país e preocupante para a saúde pública, já que a cada ano, novos casos de dengue clássica e dengue hemorrágica são relatados, com presença de óbitos. Até dezembro de 2003, segundo dados fornecidos pela Secretaria de Vigilância em Saúde e pelas Secretarias Estaduais de Saúde,

12 Introdução 11 o Brasil possuía casos de dengue notificados, sendo 618 casos de DHF, com 33 óbitos causados pela forma hemorrágica da doença (FUNASA, 2003). A dengue é causada por quatro tipos de vírus dengue: dengue 1 a dengue 4. Estes vírus pertencem ao gênero Flavivírus e a família Flaviviridae, medem aproximadamente 50nm de diâmetro (Henchal & Putnak, 1990), sendo compostos por um envelope lipoprotéico que engloba um genoma de RNA de fita simples, senso positivo, e de aproximadamente 11kb. O genoma está incluso em um capsídeo icosaédrico, e o nucleocapsídeo está cercado pela bicamada lipídica contendo as proteínas E e M. Este genoma codifica as proteínas na seguinte ordem: 5 -C-prM(M)- E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3. As proteínas sintetizadas pelo vírus são: as estruturais, que consistem na proteína do nucleocapsídeo ou proteína do core (C), uma proteína associada à membrana (M) encontrada na forma glicosilada de vírions imaturos (prm), e uma proteína do envelope (E), e as proteínas não estruturais (NS), que incluem sete proteínas (NS1-NS5), com algumas estando envolvidas na replicação viral (Fonseca & Fonseca, 2002). Os vírus dengue são transmitidos pelas fêmeas dos mosquitos Aedes aegypti, mas também podem estar associados a outras espécies do gênero Aedes, como Aedes albopictus. Os mosquitos infectam-se após alimentarem-se em indivíduos virêmicos e somente depois de um período de incubação extrínseco de 8 a 12 dias é que são capazes de transmitir o vírus para indivíduos não infectados. Após a picada do mosquito, segue-se um período de incubação de 3 a 14 dias depois do qual o indivíduo infectado pode manifestar uma febre aguda acompanhada de uma série de sintomas. Estes sintomas variam desde de manifestações semelhantes à gripe (a dengue clássica ou febre da dengue- DF), até a complicações severas que culminam na forma mais grave da doença, que leva a hemorragias (febre de dengue hemorrágica - DHF), e choque hipovolêmico (síndrome de choque

13 Introdução 12 por dengue - DSS) (Gubler, 1998). Cabe lembrar que uma grande parte das infecções pelos vírus dengue são assintomáticas. A dengue clássica ou febre por dengue (DF) é a forma mais branda da doença que consiste em uma febre início abrupto, e uma série de sinais e sintomas não específicos, incluindo dor na região frontal da cabeça, dor retro-orbital, mialgias, artralgias e dores no abdômen, náusea e vômitos, fraqueza, rash, diarréia, mal-estar e linfoadenopatia. Sangramentos nasais, gengivais, petéquias, hematuria e menorragia não são incomuns. A febre e dores cessam em um intervalo de 5 a 7 dias com o aparecimento de um outro rash no final deste período. A febre de dengue hemorrágica (DHF) e síndrome de choque por dengue (DSS) iniciam-se com aparentemente os mesmos sintomas da dengue clássica, ou seja, febre alta (maior que 39 C) que permanece por 2 a 7 dias. Sangramentos nasais e gengivais são incomuns mas sangramentos gastrintestinais podem ser observados em casos severos (Fonseca & Fonseca, 2002). As manifestações hematológicas incluem um aumento no hematócrito, trombocitopenia, um prolongado tempo de sangramento, e um aumento no tempo de protrombina (Kurane & Takasaki, 2001). Hepatomegalia e esplenomegalia podem ser observados em alguns casos, especialmente em crianças. Efusão pleural e ascite podem também ser detectadas, e demonstram o desenvolvimento da DSS. Intensa dor abdominal é um sintoma que muitas vezes antecede o choque. Pacientes com choque apresentam pulso fino, diminuição da pressão sanguínea e hipotensão com pele fria e úmida. O paciente pode ir à óbito após 24 horas do início do choque, caso não seja feita a correta reposição de fluidos. A melhora clínica após um correto tratamento é curto, em torno de 2 a 5 dias (Gubler, 1998, Fonseca & Fonseca, 2002). A Organização Mundial de Saúde (WHO) classifica a DHF em quatro graus, do menos severo (grau 1) ao severo (grau 4). Os graus 3 e 4, nos quais a liberação de plasma é tão profunda que o choque ocorre, é também referida como Síndrome do Choque por Dengue (DSS) (World Health Organization, 1997).

14 Introdução 13 Estes vírus podem produzir padrões de manifestações clínicas bem contrastantes, indo de uma manifestação menos severa (DF) a uma forma potencialmente ameaçadora da vida que é a DHF. A primeira indicação de uma base imunológica para a DHF, foi a observação de elevados títulos de anticorpos com reatividade cruzada em 85% das crianças com DHF em Bangkok, durante uma epidemia nos anos 60. Esta observação levou à hipótese de que a DHF era mais comum em infecções secundárias que em infecções primárias pelo vírus dengue. Os mecanismos imunológicos que causam a DHF indubitavelmente não operam sozinhos. Juntamente com as respostas imunes do indivíduo, a virulência viral parece ter um papel importante na severidade da doença (Rothman & Ennis, 1999). As principais células envolvidas nas infecções causadas pelo vírus dengue são monócitos, macrófagos e outras células de origem retículoendotelial. As células de Langerhans, células dendríticas intersticiais e dérmicas, parecem ser mais permissivas para o vírus dengue, que monócitos e macrófagos (Kurane & Takasaki, 2001). Algumas hipóteses foram desenvolvidas para tentar explicar os mecanismos imunopatológicos que levam a DHF. Uma delas é a hipótese de aumento da infecção dependente de anticorpo (ADE), a qual foi desenvolvida a partir da observação de que os vírus replicam-se a títulos mais elevados em PBMC de pacientes com infecções secundárias pelo vírus dengue, que em PBMC de indivíduos naive para dengue. Esta maior probabilidade de infecção foi relacionada com a presença de anticorpos residuais da infecção primária. Anticorpos direcionados para a principal glicoproteína viral, a do envelope (E), ligam-se ao vírus. Dentre estes anticorpos, estão contidos os que neutralizam os vírus de um mesmo sorotipo, através da ligação a epítopos da proteína E relacionados com a penetração do vírus nas células, bem como anticorpos não neutralizantes, que se ligam a outros epítopos desta proteína. Em infecções por sorotipos diferentes, não ocorre a neutralização do vírus responsável pela infecção secundária, devido a condições de especificidade

15 Introdução 14 ou concentração. Assim, estes complexos imunes vírus-anticorpo são capturados mais facilmente que partículas virais não complexadas, por células expressando os receptores Fcγ como os monócitos e macrófagos. A existência de anticorpos pré-existentes, induzidos por uma infecção prévia de vírus dengue, favorece a sua ligação ao vírus de sorotipo heterólogo sem neutralizá-lo (Rothman & Ennis, 1999). Kliks e colaboradores (1989) examinaram soros pré-infecção de indivíduos que subseqüentemente desenvolveram DHF, e soros daqueles que desenvolveram infecções secundárias assintomáticas por vírus dengue. As amostras de soros não diluídas do grupo que desenvolveu DHF, aumentaram a infecção dos monócitos humanos por vírus dengue tipo 2, enquanto o soro daqueles indivíduos que desenvolveram a doença assintomática, possuía atividade neutralizante forte a diluições menores. Eles também examinaram a idade das crianças que desenvolveram DHF em suas infecções primárias, e o título de anticorpos nas amostras de soro de suas respectivas mães. As crianças que nasceram das mães que possuíam altos títulos de anticorpos, desenvolveram DHF nos meses tardios do primeiro ano de vida. Aqueles nascidos de mães, que possuíam baixos títulos de anticorpos, desenvolveram DHF nos primeiros meses do primeiro ano de vida. Foi concluído que, os níveis dos anticorpos anti-dengue maternais nas crianças precisam decair, para níveis que possam aumentar a infecção pelo vírus, e assim levar à DHF. Estas observações são consistentes com a idéia de que anticorpos intensificadores aumentam o número de células infectadas pelo vírus, e os níveis de viremia, levando à DHF (Kliks et al., 1988). Devido a maior probabilidade de infecção dos monócitos e macrófagos pelo vírus dengue, foi observado também, uma maior concentração de citocinas no plasma de pacientes com DHF, do que naqueles com febre da dengue. Uma das manifestações principais da DHF, a perda de plasma, parece estar relacionada com o mal funcionamento das células endoteliais induzida pelas citocinas, e não pela destruição dos pequenos vasos. As citocinas que aparecem elevadas em pacientes com

16 Introdução 15 DHF incluem TNF-α, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12 e IFN-γ. TNF-α é conhecido por sua habilidade em induzir perda de plasma, e já foi relatado que monócitos e células endoteliais infectadas por dengue, produzem esta citocina. Outras citocinas como IFN-γ, IL-2, TNF-α e TNF-β, também são produzidos por linfócitos T CD4 + - vírus específico sob ativação. Assim, tanto monócitos quanto linfócitos- vírus específicos ativados, são reservas de níveis elevados destas citocinas na DHF. Dessa forma, a presença de níveis elevados de citocinas com suas múltiplas funções, provenientes de células hiper ativadas, são consideradas as responsáveis pela patologia e sintomas da DHF (Kurane & Takasaki, 2001). A presença de linfócitos de reatividade cruzada parece ser um outro mecanismo relevante na indução de DHF durante infecções secundárias pelo vírus dengue. Após uma infecção primária por vírus dengue de um determinado sorotipo, permanecem as células T de memória específicas a este vírus. Alguns clones de células T são capazes de responder ao sorotipo homólogo do vírus, enquanto outros clones são de reatividade cruzada, podendo responder a um, dois ou todos os três sorotipos heterólogos de dengue. Em uma segunda infecção, por vírus de sorotipo diferente da infecção prévia, tem-se uma expansão das células T de memória de reatividade cruzada, que são capazes de responder à infecção por este sorotipo diferente em uma cinética acelerada. O principal epítopo para estes clones de reatividade cruzada parece ser a da proteína não estrutural NS3. A ativação dos linfócitos T durante a interação com monócitos infectados por dengue, resulta em aumento da permeabilidade capilar através de vários mecanismos (Rothman & Ennis, 1999). O primeiro mecanismo envolve a produção de citocinas por linfócitos T ativados vírus específicos. Como mencionado anteriormente, linfócitos TCD4 + - vírus dengue específicos produzem elevados níveis de IFN-γ (Kurane et al., 1989a) e também IL-2, TNF-α e TNF-β (Gagnon et al., 1999). Linfócitos TCD8 + também podem produzir níveis de IFN-γ. Muitos pesquisadores demonstraram que a presença de TNF-α pode induzir a

17 Introdução 16 perda de plasma, assim como a presença de IL-2 (Rothman & Ennis, 1999). A produção de IFN-γ não induz uma perda de plasma de forma direta, ele age na produção de TNF-α pelos monócitos ativados (Nedwin et al., 1985) e interage com este último na ativação das células endoteliais in vitro. O IFN-γ pode também ajudar na apresentação de antígenos para os linfócitos T, já que é capaz de aumentar a expressão de antígenos HLA de classe II e de receptores de imunoglobulina induzindo ainda mais a captura de vírus dengue, através de anticorpos intensificadores, pelos monócitos ativados acentuando o fenômeno de ADE (Kontny et al., 1988). Um segundo mecanismo imunopatológico de ativação de linfócitos T dengue específicos é a lise celular das células alvo (Rothman & Ennis, 1999). Ambos linfócitos TCD4 + e TCD8 + - dengue específicos são capazes de lisar células alvo in vitro (Gagnon et al., 1996, Green et al., 1993, Kurane et al., 1989b, Livingston et al.,1995). A ativação do sistema complemento parece ser outro fator responsável pela patogênese da DHF. A cascata do complemento pode ser ativada na DHF por imunocomplexos formados por vírus dengue circulantes, e anticorpos específicos para o vírus dengue. Os níveis de anticorpos nãoneutralizantes aumentam rapidamente nas infecções secundárias pelo vírus dengue e, além disso, altos níveis de anticorpos são alcançados antes da viremia desaparecer, aumentando ainda mais a possibilidade de formação dos imunocomplexos. Uma outra hipótese é que o complemento seja ativado por citocinas produzidas de forma exacerbada na DHF (Ruangjirachuporn et al., 1979). Alguns pesquisadores como Bokisch e colaboradores (1973) e Malasit (1987) observaram a presença de níveis anormais no soro de C3, C4 e C5 e um metabolismo aumentado de C3 e C1q radiomarcados em pacientes com DHF, e no plasma foi detectado elevados níveis de produtos de ativação do complemento como C3a e C5a. Os níveis de C3a correlacionaram-se com o grau de DHF e alcançaram seu grau máximo em torno do tempo de defervescência, consistente com a hipótese que a

18 Introdução 17 ativação do sistema complemento induz diretamente a perda de plasma (Rothman & Ennis, 1999). Dessa forma, a imunopatogênese envolvida nas manifestações que levam à DHF, a forma mais grave da dengue, pode ser descrita resumidamente de acordo com o modelo proposto por Kurane e Ennis (1994). Anticorpos para o vírus dengue formam complexos vírus-anticorpo e aumentam a infecção dos monócitos e macrófagos. Células T CD4 + são estimuladas e produzem citocinas como IL-2 e IFN-γ. IFN-γ estimula a expressão de receptores Fcγ e intensifica a infecção pelo aumento dependente de anticorpo (ADE). O número aumentado de monócitos infectados por vírus dengue e a expressão aumentada de antígenos HLA classe I e II, facilita o reconhecimento dos epítopos nas células infectadas, pelos linfócitos T específicos ao vírus dengue, resultando em uma ativação elevada de linfócitos T. Esta ativação resulta em uma elevada produção de citocinas. Monócitos ativados por IFN-γ podem produzir elevados níveis de TNF-α, IL-1 e PAF (fator ativador de plaquetas) diante da infecção pelo vírus, ou através da lise por linfócitos T CD4 + e T CD8 + citotóxicos, e/ou por contato dos monócitos com linfócitos específicos. Os altos níveis de C3a e C5a são produzidos devido a ativação do sistema complemento pelos imunocomplexos ou outros mecanismos. PAF pode ser produzida por plaquetas ativadas ou por monócitos. Além disso, muitas citocinas podem ser produzidas, mediante a indução de outras citocinas. Uma vez que as citocinas são produzidas, uma rede complexa de indução aumenta os níveis de citocinas e mediadores químicos. As citocinas, além de induzirem a produção de outras citocinas, possuem efeitos sinérgicos. Assim, ocorre um rápido aumento de TNF-α, IL-2, IL-6, IFN-γ, PAF, C3a, C5a e histaminas, e os efeitos sinérgicos destes mediadores, induzem um mal funcionamento das células endoteliais vasculares. O funcionamento inadequado causa extravasamento de plasma e choque, e desarranjos no sistema de coagulação, levando às manifestações hemorrágicas. Estes processos

19 Introdução 18 podem ser iniciados pelo aumento dependente de anticorpo da infecção dos monócitos pelo vírus dengue, e disparados pela ativação de linfócitos T citotóxicos de reatividade cruzada Estratégias de imunização para as infecções pelo vírus dengue. A cada ano, há várias centenas de milhares de casos de dengue hemorrágica e síndrome de choque por dengue, resultando em milhares de mortes. O único método atualmente disponível para prevenir as infecções por dengue é o controle do mosquito vetor, Aedes aegypti. Este método temse mostrado caro e freqüentemente impraticável (Halstead & Deen, 2002). No entanto, sabe-se que o método realmente eficiente para combater as infecções virais e, dentre elas, as infecções pelos vírus dengue é a vacinação. No caso da dengue, estas vacinas precisam ser tetravalentes e eficientes em produzir anticorpos neutralizantes para os quatro sorotipos dos vírus dengue, pois a preexistência de anticorpos heterotípicos não neutralizantes, é um fator de risco que pode levar à DHF. Além disso, precisam ser economicamente viáveis para imunizações de populações numerosas dos países em desenvolvimento, que são os mais afetados pela doença. Os métodos de vacinação para dengue são colocados em três categorias: vacinas vivas atenuadas, vacinas quiméricas, e outros métodos que incluem vacinas derivadas de clones infectantes, subunidades de estruturas virais e vacinas de DNA. As vacinas vivas atenuadas tetravalentes foram desenvolvidas e testadas como vacinas candidatas na Universidade de Mahidol, Tailândia, e atualmente estão sendo produzidas em nível industrial pelo Pasteur Mérrieux Connaught (Pang, 2003). A atenuação dos vírus dengue foi feita através de passagens seriadas dos vírus em células primárias de rim de cachorro (PDK) certificadas quanto a serem livres de agentes infecciosos caninos ou

20 Introdução 19 humanos (Bhamarapravati & Sutee, 2000). A atenuação dos vírus através de passagens seriadas em células PDK foi conseguida com os sorotipos 1, 2 e 4, mas o sorotipo 3 não cresceu bem nestas células e então foi passado em células primárias de rim de macaco verde africano (PGMK), e depois em células de pulmão de feto de macaco rhesus (FrhL) (Bhamarapravati & Yoksan, 1997). Dessa forma, o número de vírions patogênicos seria reduzido enquanto o número de vírions não patogênicos e atenuados seria aumentado. O grau de atenuação desejado é aquele considerado biologicamente seguro para humanos mas que ainda pode produzir anticorpos neutralizantes (Bhamarapravati & Sutee, 2000). Os marcadores biológicos de atenuação viral considerados, foram a sensibilidade, a temperatura, e o diâmetro das placas (Bhamarapravati & Yoksan, 1997). O desenvolvimento desta vacina começou em 1981 como vacinas monovalentes para os quatro sorotipos e depois foram misturadas em vacinas bivalentes, trivalentes e tetravalentes (Bhamarapravati & Sutee, 2000). As vacinas candidatas foram testadas quanto a segurança em modelos experimentais e testes de neurovirulência em macacos. Após mostrarem ser seguras e imunogênicas nos testes experimentais, o protocolo de testes das vacinas em humanos foi aprovado pela Organização Mundial de Saúde e pelo Ministério da Saúde Pública da Tailândia através de um comitê de ética (Bhamarapravati & Yoksan, 1997). Os resultados em voluntários humanos mostraram que as vacinas são realmente imunogênicas, e não produzem sintomas clinicamente significantes, sinais ou anormalidades laboratoriais nestes voluntários adultos susceptíveis a flavivírus. As vacinas bivalentes induziram anticorpos bivalentes, sendo o mesmo observado em voluntários susceptíveis que receberam a vacina trivalente DEN-1, 2, 4. Nos indivíduos que receberam as vacinas tetravalentes, a produção de anticorpos neutralizantes não foi tão boa quanto a da vacina trivalente. A vacina tetravalente também foi administrada em crianças com idades entre 5 a 14 anos, e também mostrou ser segura e imunogênica (Bhamarapravati & Sutee, 2000). No entanto, esta vacina

21 Introdução 20 tetravalente precisa ser aperfeiçoada, pois foi encontrado em voluntários humanos, um titulo maior de anticorpos dirigidos ao vírus Dengue 3, embora em todos os voluntários tenham sido detectados anticorpos contra mais de um vírus. Parece ter havido uma interferência competitiva entre os quatro vírus ou o vírus Dengue 3 não foi completamente atenuado (Pugachev et al., 2003). Uma outra estratégia de vacinação, é a das vacinas quiméricas, a qual baseia-se em recentes observações de que genes estruturais de um flavivírus, podem ser substituídos por genes homólogos de um outro flavivírus. Como resultado, tem-se um vírus quimérico que contém um envelope heterólogo e induz uma resposta imune neutralizante para o vírus heterólogo. A quimerização parece ser um fator atenuante per se, freqüentemente reduzindo de forma significativa a virulência do vírus patógeno, o doador dos genes estruturais (Pugachev et al., 2003). Uma destas vacinas para a dengue tem a vantagem do uso de uma vacina de alto sucesso desenvolvida contra o vírus da febre amarela, o qual pertence a mesma família viral. Neste método, os genes das proteínas pré-membrana (prm) e do envelope (E) dos vírus dengue foram inseridos nas regiões prm e E do genoma da vacina da febre amarela 17D, para desenvolver uma vacina quimérica. A vacina está sendo desenvolvida pela Acambis (USA) e licenciada por Aventis Pasteur (França). Uma única dose desta vacina quimérica tetravalente foi capaz de estimular a produção de anticorpos neutralizantes, em 100% dos macacos inoculados. Porém, em experimentos realizados em macacos rhesus com as vacinas quiméricas tetravalentes, foi observado um título maior de anticorpos neutralizantes anti-dengue 2, embora todos os macacos tenham soro-convertido para os quatro sorotipos. Com a redução da dose do vírus dengue-2 na formulação da vacina, ocorreu um equilíbrio maior da resposta imune contra os vírus dengue 1, 2, 3, mas esta resposta continuou mais acentuada em relação ao vírus dengue-4. Assim, mais estudos serão necessários para identificar uma formulação ótima para as quatro vacinas virais (Pugachev et al., 2003). Os testes

22 Introdução 21 clínicos da fase I já estão sendo realizados. A avaliação da habilidade de mosquitos vetores tornaram-se infectados através do sangue de um indivíduo vacinado e assim transmitirem a vacina candidata, também foi realizada com a vacina quimérica dengue-febre amarela e parece ser incomum (Pang, 2003). Em acréscimo a este método de vacina quimérica da febre amarela, os vírus dengue também podem ser usados como espinhas dorsais para vacinas quiméricas. Elas têm sido baseadas na deleção ou inserção de mutações e/ou inserção de genes de prm e E de vários sorotipos nas regiões estruturais dos vírus DEN-1, DEN-2, DEN-4. As quimeras de DEN-2 produziram anticorpos neutralizantes em camundongos susceptíveis (Kenney & Huang, 2001), e a vacina candidata usando a espinha dorsal de DEN-1 foi altamente imunogênica em macacos rhesus susceptíveis (Markoff et al., 2002). A vacina construída usando a espinha dorsal de DEN-4, onde os genes de virulência foram deletados, causou somente reações mínimas em 20 voluntários adultos com 100% de soro conversão de anticorpos neutralizantes (Durbin et al., 2001). Esta última vacina quimérica também mostrou ter uma capacidade restrita para disseminação em mosquitos e ausência de transmissão das vacinas para mosquitos (Pang, 2003). A tecnologia dos clones infecciosos tem aberto novas oportunidades na pesquisa de vacinas para flavivírus. Um clone infeccioso é uma cópia de cdna de um vírus de genoma de RNA, que pode ser propagado de forma estável, em vetores de plasmídeos bacterianos e facilmente manipulado (Pugachev et al., 2003). A vantagem desta tecnologia está na redução do risco de gerar variantes com fenótipos biológicos alterados, durante passagens convencionais nas preparações de vacinas vivas atenuadas em cultura celular (Chambers et al., 1997). Através de um clone infeccioso, deleções foram introduzidas na região 3 não traduzível (3 UTR) do genoma de dengue 4. As mutações alteraram, mas não impediram a replicação do vírus na cultura celular. O vírus produziu placas de pequeno diâmetro nas células C6/36 de mosquito, e cresceu pobremente nas células de símios

23 Introdução 22 LLC-MK2. Após inoculação em macacos, alguns dos vírus mutantes demonstraram duração de viremia reduzida, mas desenvolveram respostas de anticorpos neutralizantes. No entanto, reversões fenotípicas foram encontradas após cultivo prolongado em células C6/36, sugerindo uma limitação potencial nas substituições de um único nucleotídeo, o que limitaria seu uso como vacina (Pugachev et al., 2003). As vacinas de subunidades empregam vários vetores de expressão, para gerar segmentos de polipeptídios definidos da poliproteína dos flavivírus. As tecnologias recombinantes possuem uma potencial vantagem, particularmente na expressão da proteína de dengue NS1, devido sua ausência na indução de reação cruzada de anticorpos anti-e, eliminando o risco de aumento da imunidade mediada por Fc e conseqüentemente, da replicação do vírus dengue em recipientes da vacina subseqüentemente exposta ao vírus selvagem. A vacinação com polipeptídios selecionados, os quais já são sabidos em gerar ativação pobre de células T via MHC de classe I durante exposição primária ou secundária à infecção por vírus dengue, pode minimizar a indução de citocinas pró-inflamatórias. Um sistema de expressão através de Escherichia coli, o qual produz uma proteína contendo a região C terminal e um terço da proteína E, junto com a região N-terminal da proteína NS1 do vírus dengue 2 (linhagem PR#159/S1), tem sido empregado. Esta vacina de subunidade recombinante mostrou ser altamente imunogênica em camundongos Swiss e Balb-c, os quais receberam pelo menos duas doses tendo como adjuvante o alumínio, e desenvolveram altos títulos de anticorpos neutralizantes contra o vírus dengue 2. Uma completa proteção contra desafio intracerebral com vírus dengue 2 também foi conseguida. Porém, a imunização de macacos exigiu três doses para induzir níveis substanciais de anticorpos neutralizantes, mas a resposta foi transitória e, nos experimentos de desafio, a não redução em magnitude ou duração da viremia foi demonstrada, se comparada com os animais controles não imunizados. Um outro sistema de expressão, baseado em baculovírus, também foi empregado para produzir a proteína E de

24 Introdução 23 dengue com uma tag de histidina. A proteína pôde ser recuperada nas formas monoméricas e diméricas com antigenicidade mantida. A imunização de camundongos Balb-c com a forma dimérica mais o adjuvante de alumínio, produziu anticorpos neutralizantes para vírus dengue tipo 2, similarmente à imunização com o vírus inativado purificado. Após três doses da vacina, a proteção contra o desafio foi conseguida na presença ou ausência de adjuvante, mas a produção de anticorpos neutralizantes somente foi conseguida com adjuvante. Uma crítica relacionada com as vacinas de subunidades refere-se à durabilidade das respostas de anticorpos neutralizantes, e assim, à proteção contra as conseqüências imunopatológicas de uma infecção seqüencial (Chambers et al., 1997). Um método muito popular usado para imunização é o DNA nu, contendo genes apropriados de flavivírus, o qual é baseado na inoculação direta em animais ou humanos pela rota intramuscular ou dentro de células dendríticas. A inoculação é feita via gene gun ou plasmídeo de DNA, contendo promotores eucarióticos apropriados para a expressão das proteínas codificadas. O DNA é transcrito no núcleo das células, resultando em subseqüente expressão da proteína e indução de imunidade. As desvantagens das vacinas de DNA são as grandes quantidades de DNA necessárias, e a possibilidade dos plasmídeos integrarem-se de forma estável, em cromossomos em loci aleatórios. Além disso, os promotores fortes que são usados nestes plasmídeos, teoricamente podem resultar em uma regulação positiva de alguns genes celulares como oncogenes (Pugachev et al., 2003). Uma vacina de DNA para dengue foi desenvolvida e sua imunogenicidade avaliada em camundongos. A vacina chamada de pcd2me, é baseada em um plasmídeo pcdna3, que codifica a seqüência sinal dos genes das proteínas do envelope (E) e da pré-membrana (prm) do vírus dengue tipo 2 da linhagem New Guinea C. Os camundongos Balb-c receberam doses de 100μg da vacina pcd2me por duas ou três vezes, e desenvolveram títulos de anticorpos neutralizantes de 1:40 ou maiores, nos dias 4 e 8 depois do desafio com 3x10 5 PFU de dengue- 2 New Guinea C.

25 Introdução 24 Em contraste, os camundongos imunizados duas ou três vezes com 100μg de pcdna3, não desenvolveram anticorpos neutralizantes detectáveis nos dias 4 e 8 após o desafio, indicando assim, que a imunização com pcd2me é capaz de induzir a produção de anticorpos neutralizantes e respostas de células B de memória, ao vírus dengue- 2 New Guinea C (Konishi et al., 2000). Uma vacina de DNA candidata, expressando a glicoproteína E truncada sem a expressão concomitante de prm, foi construída contra o vírus dengue -2 New Guinea C no Laboratório de Virologia Molecular da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP. Os camundongos que foram vacinados através de inoculação intramuscular com o plasmídeo recombinante contendo 94% do gene E não produziram anticorpos antidengue, resposta linfoproliferativa ou síntese de citocinas, quando estimuladas com vírus dengue 2 purificado. Porém, foi observada uma proteção contra desafio dos camundongos imunizados com o plasmídeo recombinante, em um índice de 20%. A baixa resposta imune encontrada foi relacionada com a possível secreção imperfeita da proteína E, devido a ausência da proteína prm, apontando assim a necessidade da presença da proteína prm nas próximas vacinas candidatas de dengue, para o correto processamento da glicoproteína E (Jimenez & Fonseca, 2001). 1.3 Transferência de imunidade adotiva como estratégia de imunização. A transferência de imunidade adotiva é um mecanismo através do qual é feita a transferência de células do sistema imune, como linfócitos, de um doador imune para um receptor singenéico (geneticamente idêntico) não imune para determinado antígeno. Esta transferência celular deve ser feita entre doadores e receptores geneticamente idênticos, como membros da mesma linhagem endocruzada de camundongos, de modo que os linfócitos de um doador não sejam rejeitados pelo receptor e não ataquem os tecidos

26 Introdução 25 do mesmo. Este procedimento pode ser refinado transferindo-se certas subpopulações de linfócitos, tais como células B, células T CD4, células T CD8, além de linhagens clonadas de células T, também capazes de conferir imunidade adotiva ao seu antígeno específico (Janeway & Travers, 1997). A transferência de imunidade adotiva tem como objetivos substituir ou enriquecer a população de células T pertencentes ao receptor das células transferidas. As células estimuladas para determinado antígeno ao serem transferidas para um receptor singenéico normal, estariam se multiplicando na presença do antígeno específico a que estão previamente estimuladas, permitindo uma resposta imune celular adaptativa de forma muito mais rápida e eficiente. Estariam também possibilitando a ação da resposta imune humoral do indivíduo receptor com a ativação de células B, e produção de anticorpos. Sendo uma resposta imune adaptativa, tem como características a especificidade, que garante a eliminação de microorganismos específicos, e a memória, que intensifica as respostas às repetidas exposições ao mesmo antígeno. Em infecções virais, por exemplo, o receptor das células previamente primadas para o vírus específico, ao entrar em contato com o mesmo, dispondo de células T específicas a este, teria uma expansão clonal destas células após ativação através das células apresentadoras de antígeno (APCs), expondo os peptídeos virais na superfície. Após a expansão clonal, haveria um estímulo tanto da resposta imune celular como da humoral, com a função de eliminar o patógeno, neste caso o vírus, de forma mais rápida e mais potente. Esta eliminação, ocorrendo com sucesso, resultaria em um receptor que não sofreria os sintomas da doença causada pelo vírus, pois teria células T responsivas a este, sem que precisasse adoecer para produzí- las. Uma outra vantagem, seria o desenvolvimento no receptor, de células T de memória, que prolongassem esta resposta imune às infecções posteriores com o mesmo vírus. Nos dias atuais tem-se empregado a transferência adotiva de células T como um mecanismo promissor no tratamento de infecções virais persistentes (Hunziker et al., 2002), em terapias anti-tumorais (Kessels et al.,

27 Introdução ) e como uma importante estratégia de pesquisa para definir o papel de determinadas populações celulares, como por exemplo, das células TCD4 + em uma resposta imune (Abbas et al., 2000). É sabido que as células TCD8 citotóxicas possuem um papel importante na erradicação e controle de infecções virais persistentes (Riddell & Greeenberg, 1995). Nas infecções pelo HIV, o papel destas células não está bem definido embora se saiba que pacientes HIV + com longos períodos de infecção assintomática mantêm respostas fortes de células T citotóxicas (CTLs) específicas para HIV, ao contrário de pacientes sintomáticos, que progressivamente vão perdendo esta resposta das CTLs específicas para HIV (Cao et al.,1995, Harrer et al., 1996, Klein et al., 1995). Assim, através da atividade funcional destas CTLs específicas para HIV e da habilidade destas células efetoras em migrarem para sítios de infecção in vivo, clones autólogos de CTLs CD8 + específicas para Gag de HIV-1 foram expandidas in vitro e transferidas adotivamente em indivíduos infectados por HIV. As CTLs transferidas retiveram suas funções líticas in vivo, permaneceram acumuladas junto às células infectadas por HIV nos linfonodos, e de forma transitória, reduziram os níveis de células TCD4 + circulantes infectadas pelo vírus. Estes resultados mostram uma evidência direta que as CTLs HIVespecíficas tem como objetivo, atingir os sítios de replicação do vírus e mediar uma atividade antiviral, e indicam também que, o desenvolvimento de estratégias imunoterapêuticas para manter uma forte resposta citotóxica para HIV pode ser uma importante arma no tratamento das infecções pelo vírus (Brodie et al.,1999). Os tumores freqüentemente expressam antígenos que podem ser reconhecidos pelo sistema imune, entretanto, as células tumorais conseguem evadir-se de sua monitoração. Recentes dados mostraram que o sistema imune adaptativo possui um papel definido na monitoração imune e tanto as células CD4 quanto CD8 podem contribuir para a regressão do tumor (Shankaran et al., 2001). Outros estudos demonstraram a possibilidade de erradicação de tumores estabelecidos através da transferência adotiva de células T CD8 (Hanson et al., 2000). O

28 Introdução 27 papel das células T CD4 na resposta anti-tumoral está em prevenir a deleção dirigida do antígeno pelas T CD8 e assim prolongar a citotoxicidade dirigida das células CD8 (Kurts et al., 1997). Dessa forma, para melhor entender o mecanismo de evasão, Klein e colaboradores (2003) fizeram com que células T CD4 e T CD8 reagissem contra um tumor em crescimento subcutâneo, o qual foi modificado para expressar a hemaglutinina (HA) do vírus influenza, como um antígeno substituto do tumor. Camundongos transplantados com um carcinoma de cólon CT26 receberam aproximadamente 8000 células T CD8 antígeno específicas, o que foi suficiente para proteger os camundongos contra um desafio de 1x10 6 células tumorais, porém, números maiores de células T rejeitaram tumores estabelecidos. As células T CD4 não rejeitaram por si os tumores, mas ajudaram na rejeição dos tumores pelas células T CD8 específicas. A rejeição do tumor coincidiu com uma prolongada sobrevivência das células T CD4 e CD8 específicas, enquanto uma falha na resposta anti-tumoral, foi acompanhada por uma expansão transitória seguida de rápida eliminação das células T antígeno específicas. Portanto, tumores altamente imunogênicos podem evadir-se da monitoração imune, por causa do número insuficiente de células T específicas ao tumor, e também devido a sobrecarga de antígeno, resultando em uma exaustão da resposta imune. Neste contexto, segundo os pesquisadores, a imunoterapia adotiva melhor que a vacinação, promete ser um tratamento de sucesso no combate ao câncer. Uma outra forma de utilização da transferência adotiva é no estudo do comportamento de certas populações celulares, como células T CD8 de memória. Barber e pesquisadores (2003) avaliaram a atividade de citotoxicidade de células T CD8 efetoras e de memória. Foi observado que, durante uma infecção aguda pelo vírus da coriomeningite linfocítica, as células T CD8 efetoras rapidamente mataram e começaram a eliminar células alvo adotivamente transferidas, dentro de 15 minutos, por um mecanismo dependente de perforina. Células T CD8 de memória apesar de

29 Introdução 28 serem pobremente citolíticas in vitro, neste estudo mostraram uma rápida eliminação (1-4 horas) das células alvo após transferência, e as células de memória expressando tanto CD62L low quanto CD62L high (moléculas de superfície celular responsáveis pela adesão endotelial de leucócitos), foram capazes de matar rapidamente in vivo. De forma surpreendente, as células T CD8 de memória foram apenas um pouco mais lentas que as células efetoras em eliminar as células alvo. Assim, concluiu-se que, as células T CD8 de memória vírus específica podem rapidamente adquirir função citolítica sob re-exposição ao antígeno, e seriam células eliminadoras de antígenos muito mais eficientes in vivo, que previamente esperado. Em relação ao vírus dengue, poucos trabalhos foram realizados usando a transferência adotiva de imunidade. Os poucos existentes, utilizaram esta estratégia como forma de estudar a atividade supressora ao vírus dengue de células T específicas transferidas adotivamente em camundongos (Chaturvedi et al., 1981, Tandon et al., 1979a, Tandon et al., 1979b). Dessa forma, devido a inexistência de pesquisas realizadas com estratégias de imunização utilizando a transferência adotiva de imunidade para o vírus dengue, e a potencialidade mostrada por este mecanismo com outras infecções virais, faz-se necessária sua avaliação como uma estratégia de imunização, de forma a enriquecer o campo de pesquisas para encontrar a melhor estratégia vacinal para a infecção causada pelo vírus dengue.

30 Objetivos Objetivos

31 Objetivos 30 Os objetivos deste estudo foram: Verificar se ocorre a transferência de imunidade através de células esplênicas estimuladas in vitro pelo vírus Dengue tipo 2, em camundongos isogênicos. Analisar a resposta imune humoral específica para Dengue-2 induzida por esta estratégia.

32 Delineamento Experimental Delineamento Experimental

33 Delineamento Experimental 32 IMUNIZAÇÃO Inóculo via endovenosa Cultura de células esplênicas estimuladas ou não com vírus D2 inativado Camundongos BALB/c isogênicos Grupos: Células esplênicas estimuladas in vitro com D2 inativado Células sem estímulo Controle Positivo: D2 New Guinea C ativo Controle Negativo: Solução PBS 1x 6 dias booster com vírus inativado nos grupos de células estimuladas in vitro 14 dias Obtenção de soro (anticorpos) Linfoproliferação Desafio intracerebral Análise da sobrevivência (21 dias) Obtenção de soro (anticorpos)

34 Material e Métodos Material e Métodos

35 Material e Métodos Cultura de células e linhagens virais Neste estudo, foi utilizado para a estimulação dos linfócitos e desafio dos camundongos isogênicos, o vírus Dengue 2 da linhagem New Guinea C (TVP-1698 SM# 26) propagados em cérebro de camundongos recém nascidos. As células utilizadas para ensaios de unidades formadoras de placas (PFU) e para testes de neutralização (PRNT) foram as células da linhagem Vero (rim de macaco verde africano- Cercopithecus aethiops) obtidas do Instituto Adolfo Lutz de São Paulo-SP. As células Vero foram cultivadas em garrafas de cultura de 25cm 3 (Costar-USA) com meio Leibowitz L-15 suplementado com soro fetal bovino a 10%, triptose e antibióticos (penicilina 100U/mL e estreptomicina 1mg/mL). Após a formação de monocamadas, estas células foram tripsinizadas e repicadas para garrafas de cultura de 75cm 3 (Costar-USA). Posteriormente estas células foram passadas para placas de cultura de 24 wells com 1,91cm 2 /poço, até o uso em ensaios a que foram destinadas. 4.2 Estoque viral propagado em cérebro de camundongos recém nascidos. Foram inoculados aproximadamente 10μl de vírus Dengue 2 New Guinea C no cérebro de camundongos Swiss recém-nascidos. Após o aparecimento dos sinais da doença, que normalmente ocorrem após o 3º dia da inoculação do vírus, os camundongos foram sacrificados e congelados a - 70 C até o uso. O cérebro foi coletado por aspiração com seringa e homogeneizado em graal estéril com solução de gelatina a 10% (Sigma) na proporção de aproximadamente 1:1. Os homogeneizados foram transferidos para tubos de centrifuga de 15 ml (Corning-USA), sedimentados a 5445 x g por 20 minutos em centrífuga (Beckman). Os sobrenadantes foram coletados e estocados em tubos criogênicos (Corning-USA) em freezer a 70 C.

36 Material e Métodos Titulação viral através de ensaio de unidades formadoras de placas (PFU). As células Vero após formarem monocamadas, foram removidas com 5 ml de tripsina a 0,25% (GIBCO TM -Invitrogen). Em seguida, foram plaqueadas de forma que estivessem na concentração de 1x10 6 células/ml de meio L15 a 10% de soro fetal bovino em placas de poliestireno (Costar- USA) de 24 poços. As placas foram mantidas em estufa por 48 horas a 37ºC. Em seguida, foram feitas diluições seriadas de vírus (10-1 a ) em PBS 1x estéril e estas diluições de vírus Dengue 2 New Guinea C foram adicionadas em duplicata nos poços das placas. Após aproximadamente 2 horas de infecção, o inóculo foi retirado e os poços das placas receberam uma camada de solução viscosa (carboximetilcelulose a 3%, meio L15 1x, soro fetal bovino a 10%, penicilina 100U/mL e estreptomicina 1mg/mL, L- glutamina a 1%). Após 6 dias da infecção, os poços das placas foram corados com vermelho neutro a 2% em meio L15 a 2% de SBF. O cálculo do título viral é feito a partir da maior diluição onde as placas são visíveis, levando em conta o número de placas, a diluição e o volume do inóculo (Russell et al., 1967). 4.4 Extração de RNA através do Kit QIAamp RNA Viral (QIAGEN ). Para obtenção de RNA viral presente nos estoques virais ou no sobrenadante dos esplenócitos em cultura estimulados in vitro, foi feita a extração do RNA das amostras através do QIAamp RNA viral kit que utiliza uma coluna com afinidade para RNA. Na obtenção do RNA, 140μL de cada amostra foi lisada pelo tampão de lise e depois passadas nas colunas de sílica com afinidade para RNA e submetidas a uma centrifugação de 6428 x g por 1 minuto. Após centrifugação, as amostras foram lavadas com tampões de lavagem e por último, o RNA extraído presente nas colunas foi

37 Material e Métodos 36 eluído através de tampão de eluição, e estocado em freezer a 20 C, conforme instruções do fabricante. 4.5 Confecção do DNA complementar (cdna). Após a extração do RNA total das amostras, a confecção da fita de cdna foi feita com o kit Superscript TM (GIBCO TM - Invitrogen). De cada amostra de RNA, foi retirada uma alíquota de 11μL à qual foi adicionada 1μL de primer randômico pd(n) 6 (Amersham Pharmacia, CA, USA). As amostras foram submetidas a aquecimento de 70ºC por 10 minutos. Em seguida, foi feito um cocktail com tampão da transcriptase reversa, DTT, transcriptase reversa e dntps. O cocktail foi adicionado às amostras, e estas, incubadas por 1 hora a 42ºC, e em seguida, foi feita uma nova incubação de 15 minutos a 70ºC, para desnaturar a transcriptase reversa. O cdna obtido foi posteriormente estocado em freezer a 20 C. 4.6 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR convencional). A reação em cadeia da polimerase foi empregada neste estudo para analisar a presença de RNA viral nos estoques virais e também no sobrenadantes de cultura de células de baço. Os primers utilizados foram aqueles cujo sucesso já havia sido comprovado pela literatura (Henchal et al., 1991). A reação de PCR já foi padronizada em nosso laboratório (De Paula et al., 2001) e foi feita a partir de 3μL de cdna das amostras em uma reação de 50μL contendo 0,5 pmol/μl dos primers AD3 e AD4 sense e antisense (ver tabela 1), 0,2 mm dntps, tampão 10x da enzima e 2,5U de Taq- DNA Polimerase. O controle positivo utilizado foi o vírus Dengue sorotipo 2, propagado em cérebro de camundongos recém-nascidos, e previamente analisado por PCR em tempo real. As amplificações foram feitas em 35 ciclos de 3

38 Material e Métodos 37 segmentos: 94ºC por 1 minuto, 55 C por 1 minuto, 72 C por 1 minuto e um ciclo final de 10 minutos a 72 C. O resultado das amplificações foi verificado por eletroforese em gel de agarose a 2%, corado com brometo de etídeo 1μg/mL e visualizados através de luz ultravioleta e digitalizados pelo software UVP Vision Works. Tabela 1- Seqüências de primers AD3 e AD4 Primers Seqüência Região Referência AD3 5 CTGATTTCCAT(A,C,G,T)CC(A,G)TA 3 NS1 Henchal et al., 1991 AD4 5 GA(C,T)ATGGG(A,C,G,T)TA(C,T)TGGATAGA3 NS1 4.7 PCR em Tempo Real. A PCR em Tempo Real foi outra metodologia empregada neste estudo, através do Sistema de Detecção de Seqüências GeneAmp 5700 (Applied Biosystems ), cuja metodologia foi padronizada em nosso laboratório, para confirmarmos a presença do sorotipo específico Dengue-2, além de quantificarmos o estoque do vírus. O sistema TaqMan, de detecção e quantificação de seqüências foi preparado utilizando um par de primers e uma sonda específica para Dengue-2, correspondente a região 3 -não codificadora do genoma do vírus Dengue (Huong et al., 2001). O RNA do vírus dengue foi amplificado utilizando o TaqMan One- Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit (Applied Biosystems), composto por AmpliTaq Gold DNA polimerase, dntps com dutp, referência passiva (ROX), componentes de tampões, e um tubo adicional contendo enzimas de transcrição reversa Multiscribe e inibidor de RNase. Para tanto, foi preparada uma mistura padrão contendo 12,5μl do master mix, 2,25 μl de cada primer (450nM), 1,5 μl de sonda (150nM), 0,63μl de Multiscribe/inibidor de RNase,

39 Material e Métodos 38 0,87μl de água DEPC (dietil pirocarbonato 97% - ACROS Organics), e 5μl de RNA, totalizando um volume final de 25μl por reação. As condições de amplificação usadas foram: 48 C por 20 min e 95 C por 10 min, seguido por 40 ciclos de 95 C por 15 segs e 60 C por 1 min. 4.8 Animais. Os animais utilizados neste estudo foram camundongos isogênicos fêmeas da linhagem BALB/c naive (que não receberam qualquer estímulo) de aproximadamente 4 semanas, obtidos junto ao Biotério Geral da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP. Os camundongos foram mantidos com ração e água estéreis em uma sala individualizada de outros animais no biotério da Clínica Médica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP. 4.9 Cultura de células de baço e estimulação in vitro de linfócitos. Camundongos isogênicos da linhagem BALB/c naive foram sacrificados sob anestesia para a obtenção de baços. Os baços foram divulsionados e as hemácias lisadas com tampão de lise (Tris a 0,17M e NH 4 Cl a 0,16 M). Após centrifugações seriadas com PBS 1x (GIBCO TM - Invitrogen) a 259 x g por 10 minutos a 4 C, o sedimento celular foi ressuspenso em 2mL de meio RPMI 1640 completo (GIBCO TM - Invitrogen) suplementado com 10% de soro fetal bovino, 10 mm de Hepes, 2mM de L- glutamina, aminoácidos não-essenciais, 5x10-5 M de 2-mercaptoetanol, penicilina 100U/mL e estreptomicina 1mg/mL. O número de células foi ajustado para 5 x 10 6 /ml em meio RPMI a 10% de SBF e plaqueadas em placas de poliestireno (Costar-USA) de 24 poços (1 ml/poço). Células esplênicas de camundongos C57Bl/6 naive, utilizadas como controle da transferência de células, foram igualmente manipuladas e estimuladas com

40 Material e Métodos 39 vírus dengue, como as células da linhagem de camundongos BALB/c. As células que foram estimuladas in vitro com vírus Dengue 2 New Guinea C inativado (60ºC por 30 minutos) receberam aproximadamente 1,5 x10 5 pfu/ml de vírus. As células não estimuladas com vírus não receberam qualquer estímulo. As placas foram mantidas em estufa a 5% de CO 2 e a 37ºC por 48 horas Preparação dos esplenócitos para inoculação. As células foram coletadas das placas com solução salina de PBS 1x estéril e centrifugadas a 259 x g por 10 minutos a 4ºC. Após a última centrifugação, o número de esplenócitos foi ajustado para 5x 10 7 /ml, em solução de PBS 1x estéril. Os camundongos BALB-c foram inoculados com 100μL de PBS 1x, contendo 5x 10 6 células esplênicas de BALB-c ou de C57Bl/6, através da via endovenosa pela cauda Ensaios de proliferação celular. Os vírus dengue 2 New Guinea C foram testados em uma cultura de esplenócitos de camundongos BALB-c com intuito de verificar o efeito do vírus sobre a proliferação antígeno-específica de células T. Para tal, esplenócitos foram obtidos de camundongos previamente imunizados e não imunizados para o vírus Dengue 2 por divulsionamento do baço em solução de PBS 1 x estéril, após 14 dias de imunização e antes do desafio. Estas células foram centrifugadas por 10 minutos a 259 x g, e diluídas em meio RPMI 1640 a 10% de SBF. As culturas foram efetuadas em placas de cultura de fundo chato e 96 poços (Corning- USA), numa concentração de 5 x 10 5 células/ poço. As células foram estimuladas com concentrações de 1x10 3, 1x10 2 e 10 pfu/ml de vírus Dengue 2 inativado (60 C por 30 minutos), como controle positivo do ensaio, as células também foram estimuladas com 2μg/mL de Con-A e como controle negativo do ensaio,

41 Material e Métodos 40 estas células também receberam meio RPMI Após um período de incubação de 48 horas em uma estufa a 5% de CO 2 a 37ºC, as células foram pulsadas com metil- 3 H- timidina (Amersham Life Science, Bukinghamshire, UK), numa concentração de 0,5 μci por poço. Depois de 8-10 horas, a quantidade de timidina incorporada nas células foi determinada utilizando-se um coletor de células (Cambridge Technology Inc., Watertown, MA) e um contador de cintilação líquida (Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA). O índice de estimulação (IE) foi calculado de acordo com a média das cpm (contagem por minuto) dos antígenos virais dividido pela média das cpm das células controle incubadas apenas com meio RPMI-1640 a 10% de soro fetal bovino. Os valores de IE considerados como positivos seriam aqueles maiores e/ou iguais a 3 (Murata et al., 2003). Os Valores de IE foram analisados através do software GraphPad Prism versão Coleta de sangue para obtenção do soro. Os camundongos foram anestesiados e com auxílio de pipetas Pasteur (Costar-USA), o sangue de cada animal foi coletado pela punção do seio retroocular e armazenado individualmente. Após retração do coágulo e centrifugação a 4018 x g, os soros dos camundongos foram coletados, armazenados individualmente em tubos criogênicos e estocados em freezer a 70 C Desafio intracerebral e análise de sobrevivência. A fim de verificarmos se a transferência de imunidade adotiva foi capaz de proteger os camundongos imunizados contra uma dose elevada de vírus Dengue 2 New Guinea C, foi feito o ensaio de desafio intracerebral. Os camundongos de todos os grupos receberam um inóculo de 50μL contendo 1,5 x10 5 pfu/ml de vírus dengue 2, via intracerebral. A análise da sobrevivência foi realizada observando estes animais quanto ao

42 Material e Métodos 41 aparecimento dos sinais da doença e sobrevivência ao desafio por 21 dias. Os dados obtidos foram analisados através do software GraphPad Prism versão Teste de neutralização. O teste de neutralização tem como objetivo verificar a presença de anticorpos neutralizantes no soro obtido dos camundongos imunizados. Para tal, diluições seriadas de soro (1:10, 1:20, 1:40, 1:80 e 1:160) foram incubadas overnight a 4ºC com uma amostra de vírus contendo aproximadamente 30 pfu/ml. Após este período, as soluções vírus-soro foram colocadas em duplicata em placas de 12 poços (Corning-USA) contendo monocamadas de células Vero. Depois de um período de 2 horas de infecção, o inóculo foi retirado e os poços das placas foram cobertos com uma camada de solução viscosa (carboximetilcelulose a 3%, meio L15 1x, soro fetal bovino a 10%, penicilina 100U/mL e estreptomicina 1mg/mL, L- glutamina a 1%). Após 6 dias da infecção, os poços das placas foram corados com vermelho neutro a 2% em meio L15 a 2% de SBF. O cálculo do título de anticorpos neutralizantes é feito de acordo a maior diluição que foi capaz de reduzir em 50%-90%, o número das placas formadas no controle positivo (Russell et al., 1967).

43 Resultados Resultados

44 Resultados Titulação dos vírus dengue-2 propagados em cérebro de camundongos recém nascidos através de ensaios de unidades formadoras de placas (PFU). Três estoques virais de dengue-2 New Guinea C foram os utilizados neste estudo, todos obtidos após passagens seriadas em camundongos em períodos diferentes. A titulação dos vírus Dengue obtidos de estoques virais em cérebro de camundongos recém-nascidos foi feita de acordo como descrito no item 4.3. Após coloração das placas com vermelho neutro, que é um corante vital, as placas formadas pelo vírus a ser titulado nas células Vero foram visualizadas e contadas a olho nu. A maior diluição do vírus que apresentou a formação de placas foi a utilizada no cálculo do título viral e os títulos encontrados podem ser visualizados na tabela 2. A solução mãe após 2 passagens seguidas teve seu título viral levemente aumentado. TABELA 2 Títulos virais dos estoques de Dengue 2 através de ensaio de unidades formadoras de placas (PFU) Estoque viral Título viral (PFU/mL) D2-NGC (Solução mãe) 1,5 x 10 6 D2-NGC (1ª Passagem) 1,5 x 10 6 D2-NGC (2ª Passagem) 2,0 x 10 6

45 Resultados Análise dos estoques virais através de PCR convencional. Após extração do RNA, obtenção do DNA complementar e amplificação do DNA por PCR convencional usando os primers AD3 e AD4, o DNA amplificado dos estoques virais foi detectado através de eletroforese em gel de agarose a 2% como descrito anteriormente. O resultado das amplificações pode ser visualizado na figura 1, mostrando o fragmento de 419 pb que confirma a presença do material genético do vírus e marcador de 50 pb. M C pb pb 50 Figura 1- Análise dos fragmentos amplificados por PCR (419 pb) (par de primers AD3/AD4) por meio de eletroforese em gel de agarose a 2 %, corado pelo brometo de etídeo. M - marcador de peso molecular (50 pb, Gibco BRL); 1 3, controles positivos da PCR, extração de RNA e transcrição; 4-6, amostras positivas dos estoques virais ; C- controle negativo.

46 Resultados Análise dos estoques virais através da PCR em Tempo Real. Utilizando a metodologia de PCR em Tempo Real que é altamente específica e sensível, foi possível quantificar e detectar os estoques virais de Dengue 2 New Guinea C utilizados neste estudo. Todos os estoques virais testados foram específicos para o sorotipo Dengue 2 (figuras 2 e 3) pois os primers e sondas utilizados nesta metodologia são altamente específicos e correspondentes à região 3 - não codificadora, que é uma região altamente conservada nos vírus Dengue, e além disso, todos os primers e sondas utilizados, já foram previamente testados e padronizados em nosso laboratório para esta metodologia. Dessa forma, a especificidade pode ser comprovada pela amplificação ocorrida, representada pela curva, e comparada com a curva padrão que é o controle positivo da reação que corresponde a um vírus Dengue 2 New Guinea C de padrão 2x10 5 pfu/ml (figura 2). As curvas da amostras amplificadas contidas na figura 3 também comprovam a sua especificidade e o seu título, quando comparadas com todas as curvas padrão amplificadas na figura. Os estoques da 1ª passagem e 2ª passagem foram quantificados e os valores obtidos estão apresentados na tabela 3. Como pôde ser observado, o estoque da 1ª passagem possui o título viral de 3x10 6 pfu/ml enquanto que o estoque da 2 passagem possui o título viral de 4 x10 6 pfu/ml. O estoque viral solução mãe não foi quantificado mas seu valor pôde ser calculado como em torno de 2x10 6 pfu/ml através da figura 2, comparando a curva da amostra com o padrão de 2x10 5 pfu/ml, pois a curva da solução mãe iniciou a emissão de fluorescência num ciclo anterior ao da amostra padrão, detectando assim, uma maior quantidade de DNA.

47 Resultados 46 a b ΔRn n Ct Número de Ciclos Figura 2 - Perfil de amplificação do estoque viral solução mãe. O perfil de amplificação é a representação gráfica do sinal da fluorescência (ΔR n ) versus os ciclos da PCR. A presença da curva de amplificação da amostra comprova a especificidade do estoque viral. a) curva de amplificação da amostra; b) curva padrão 2x10 5 pfu/ml. Ct (ciclo do limiar- início da detecção da fluorescência). ΔRn a b c d e f g Ct Número de ciclos Figura 3 Perfil de amplificação dos estoques virais D2 NGC 1ª passagem e 2ª passagem. O perfil de amplificação é a representação gráfica do sinal da fluorescência (ΔRn) versus os ciclos da PCR. A presença das curvas de amplificação das amostras comprova a especificidade dos estoques. a)curva de amplificação dos estoques 1ª passagem e 2 passagem; b) curva padrão 2x10 6 pfu/ml; c) curva padrão 2x10 5 pfu/ml; d) curva padrão 2x10 4 pfu/ml; e) curva padrão 2x10 3 pfu/ml; f) curva padrão 2x 10 2 pfu/ml; g) curva padrão 2x10 1 pfu/ml. Ct (ciclo do limiar- início da detecção da fluorescência).

48 Resultados 47 TABELA 3- Valores quantitativos dos estoques virais da 1ª e 2ª passagem obtidos pela PCR em Tempo Real. Amostra 1- estoque viral da 2ª passagem; Amostra 2- estoque viral da 1ª passagem Tipo Primer/Sonda Ct * Quantidade Quantidade Média ** Padrão PR Padrão PR Padrão PR Padrão PR Padrão PR Padrão PR Padrão PR Padrão PR Padrão PR Padrão PR Padrão PR Padrão PR Amostra 1 PR Amostra 1 PR Amostra 2 PR Amostra 2 PR (*) Ct- Ciclo do limiar (o início da detecção da emissão de fluorescência); (**) Quantidade média- valores médios da quantidade de DNA das amostras que são amplificadas em duplicata, correspondem aos títulos virais.

49 Resultados Ensaios de proliferação celular. Procurando verificar se a transferência adotiva de imunidade confere resposta antígeno-específica aos camundongos receptores e qual o efeito do vírus Dengue 2 (NGC) na proliferação de esplenócitos oriundos de camundongos BALB/c, foram realizados ensaios de proliferação, na presença de diferentes concentrações do vírus. Primeiramente foi realizado um ensaio, para verificar se esplenócitos oriundos de camundongos imunizados com 1x10 6, 1x10 5 e 1x10 4 pfu/ml de vírus Dengue 2 selvagem, proliferam in vitro, e a que concentrações de antígeno isto ocorre. Através deste ensaio foi verificado que as melhores concentrações de vírus para imunizar os animais e para se obter resposta antígeno-específica foram 10 5 e 10 6 pfu/ml de Dengue 2, e que as concentrações de antígeno para estimular as células seriam 10 3, 10 2 e 10 pfu/ml de vírus Dengue 2 inativado, como observado na figura 4. Os gráficos B e C correspondentes ao grupo de animais que foram imunizados com 1x10 5 e 1x10 6 pfu/ml com vírus Dengue 2 NGC selvagem, respectivamente, obtiveram o Índice de Estimulação (IE) correspondente a valores iguais e/ou maiores que 3. Estes valores de IE foram conseguidos, quando os esplenócitos foram estimulados in vitro com 10 3, 10 2 e 10 pfu/ml de vírus Dengue 2 inativado. A partir deste ensaio, foi padronizada a quantidade de vírus a ser utilizada em experimentos posteriores. Para a transferência adotiva de imunidade, as células esplênicas naive seriam estimuladas in vitro com 3x10 5 pfu/ml de Dengue 2, e nos ensaios de proliferação celular o antígeno viral usado como estímulo, seria inativado e nos títulos de 10 3, 10 2 e 10 pfu/ml. Como observado na figura 5, a transferência adotiva de células esplênicas que foram estimuladas in vitro não resultou em valores de IE significantes. Apenas no grupo Controle Positivo, que é representado pelos camundongos imunizados com vírus selvagem e não com células esplênicas, foi obtido valor significante de índice de estimulação.

50 Resultados 49 A IE pfu/m D2 selvagem 10 3 pfu/ml D2 selvagem 10 2 pfu/ml D2 selvagem 10 3 pfu/ml D2 inativado 10 2 pfu/ml D2 inativado 10 pfu/ml D2 inativado B IE C IE p < 0,001 Estatisticamente significante em relação aos outros grupos com p< 0, p<0,01 p<0,001 Estatiscamente diferentes entre si com p< 0,01 e p< 0,001 respectivamente. Figura 4 Efeito do vírus dengue 2 selvagem e inativado na proliferação de células esplênicas murinas. Os camundongos foram imunizados com vírus Dengue 2 selvagem. As células esplênicas foram coletadas e cultivadas na presença de antígeno viral. A proliferação celular foi determinada pela incorporação de metil - 3 H timidina e o índice de estimulação (IE) foi calculado como anteriormente descrito. Os valores positivos do IE referem-se aos grupos de camundongos imunizados com 1x10 5 e 1x10 6 pfu/ml de Dengue 2. A) Camundongos imunizados uma dose de 1x10 4 pfu/ml de vírus; B) Camundongos imunizados uma dose de 1x10 5 pfu/ml de vírus; C) Camundongos imunizados uma dose de 1x10 6 pfu/ml de vírus. p < 0,01 e p < 0,001, diferença estatisticamente significante (Teste de Tukey).

51 Resultados 50 A pfu/ml D2 inativado 10 2 pfu/ml D2 inativado 10 pfu/ml D2 inativado B 10 8 IE 6 IE C 10 D IE 6 ** IE ** 2 0 (**) Estatisticamente diferentes entre si com p< 0,01. 0 E 10 8 IE Figura 5 - Efeito do vírus Dengue 2 inativado na proliferação de células esplênicas murinas. Os camundongos receberam adotivamente aproximadamente 5x10 6 células esplênicas/ml. As células esplênicas foram obtidas e cultivadas na presença de antígenos virais inativados. A proliferação celular foi determinada pela incorporação de metil - 3 H timidina e o índice de estimulação (IE) foi calculado como anteriormente descrito. Os valores positivos do IE referem-se apenas ao grupo Controle Positivo, os demais grupos foram considerados negativos quanto ao IE. A) Camundongos imunizados com células esplênicas não estimuladas com antígeno viral; B) Camundongos imunizados com células esplênicas estimuladas in vitro com Dengue 2 inativado ; C) Camundongos imunizados com 3 x 10 5 pfu/ml de vírus Dengue 2 selvagem (controle positivo); D) Camundongos não imunizados (controle negativo); E) Camundongos imunizados com células esplênicas de camundongos C57Bl/6 estimulados in vitro com vírus Dengue 2 inativado. **, p < 0,01, diferença estatisticamente significante (Teste de Tukey).

52 Resultados Análise da presença do material genético viral no sobrenadante das células esplênicas estimuladas in vitro com D2 inativado. Na transferência adotiva de imunidade é importante que sejam inoculadas apenas as células que irão conferir a imunidade ao camundongo receptor, e não o vírus, que é antígeno apresentado às células para estimulá-las. Deste modo, teremos a certeza de que a resposta imune obtida provenha das células e não do vírus em cultura. Uma das maneiras utilizadas para verificar a ausência da partícula viral no sobrenadante das células esplênicas foi a PCR convencional, e a análise desta, mostrou que não se encontrava presente o RNA viral nas amostras de sobrenadante, da cultura de células esplênicas estimuladas in vitro (figura 6). Como observado, não houve amplificação do DNA de 419 pb do vírus nas amostras obtidas dos sobrenadantes da cultura celular. M C pb pb Figura 6 - Análise dos fragmentos amplificados por PCR (419 pb) (par de primers AD3/AD4) por meio de eletroforese em gel de agarose a 2 %, corado pelo brometo de etídeo. M - marcador de peso molecular (100 pb, Gibco BRL); 1- controle positivo; 2-4: amostras negativas do sobrenadante dos esplenócitos sem estímulo viral, dos esplenócitos de BALB-c estimulados in vitro e dos esplenócitos de C57Bl/6 estimulados in vitro; C- controle negativo.