Técnica de Transgenia

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1 29 Técnica de Transgenia Clélia Rejane Antonio Bertoncini Nas últimas décadas, o uso da biotecnologia tem permitido que se manipule o material hereditário de qualquer ser vivo. O sequenciamento dos genes e o cultivo das células-tronco embrionárias constituem-se nas inovações tecnológicas mais importantes para a transgenia técnica de transferência de DNA de uma espécie para outra. Esta técnica implica na alteração do genoma de um ser vivo pela intervenção da mão humana, e tornou-se possível porque a maquinaria celular, responsável pela transcrição e tradução do DNA em proteínas, funciona de maneira muito semelhante em todos os organismos. É a universalidade do código genético que permite que uma proteína codificada por uma sequência exclusiva do DNA humano possa ser produzida num vegetal ou animal transgênico. A adição de um gene humano a um embrião animal pode resultar num modelo transgênico com características específicas de uma doença humana, que se constitui, portanto, num modelo experimental valioso para o teste de vacinas e agentes farmacológicos. No sentido inverso, a desativação de um gene nas células embrionárias pode levar ao nascimento de um camundongo nocaute, que serve de modelo para se entender como as mutações produzem as malformações e os defeitos congênitos. É assim que, dentre múltiplas aplicações, a transgenia animal tem contribuído para a pesquisa de diversas doenças, incluindo aquelas de origem complexa e difícil cura, como câncer, diabetes, hipertensão, Alzheimer, Huntington, deficiências imunológicas e distrofias musculares, entre outras. Um animal transgênico é produzido pela inserção de um fragmento de DNA que resulte numa modificação genética transmissível a seus descendentes. Para fazê-lo, basta que se tenha em mãos algumas cópias do DNA de interesse e os meios de introduzi-las no genoma de um embrião, como uma parte de um vírus 471

2 Parte V Biotecnologia ou bactéria, um cromossomo artificial, uma célula-tronco ou até mesmo um espermatozoide contendo este fragmento de DNA de interesse para a transgênese. A produção de animais transgênicos foi impulsionada pela técnica de microinjeção de DNA no pró-núcleo de óvulos recém fertilizados. Em 1980, Gordon e colaboradores a implementaram para camundongos. Em 2001, nós a utilizamos pela primeira vez no Brasil para produzir um camundongo transgênico com níveis aumentados do receptor B2 de bradicinina no coração. Mas, como é aplicável a qualquer espécie, o uso da microinjeção pró-nuclear já possibilitou a geração de milhares de linhagens de transgênicos, incluindo ratos, aves, peixes, ovelhas, gado e macacos. Alguns animais transgênicos são utilizados como biorreatores. Inicialmente, foram gerados clones de ovelhas transgênicas que produzem leite contendo o fator IX de coagulação do sangue humano. Purificado do leite, portanto sem o risco de contaminação viral, este fator IX pode ser adquirido comercialmente para o tratamento de hemofílicos. Nos últimos anos, caprinos, bovinos e coelhos transgênicos também vêm sendo testados como possíveis produtores de diversas proteínas de interesse farmacológico, principalmente anticorpos e hormônios. Nas pesquisas recentes, vem aumentando também o uso de camundongos e ratos contendo o gene GFP (Green Fluorescent Protein) originário da Aequorea victoria marinha. Estes animais são usados principalmente como fonte de células marcadas para transplante, pois a luminescência das células GFP facilita sua localização entre as demais, mesmo que, eventualmente, este processo implique em uma marcação adicional com anticorpo fluorescente. Daí sua importância nos promissores estudos de terapia gênica e celular. Nesta perspectiva, as célulastronco retiradas de embriões ou da medula óssea de camundongos e ratos GFP podem ser acompanhadas após transplante para o sangue, cérebro, coração ou qualquer outro órgão, onde se deseje que elas se diferenciem e substituam as células danificadas, de modo a promover uma saudável regeneração do órgão afetado e possível cura da doença. A otimização do uso de animais de laboratório na pesquisa é uma das consequências mais positivas da transgenia animal. Além de provocar uma redução do número de animais utilizados na experimentação, o uso de transgênicos também possibilita a substituição de espécies geneticamente mais próximas do homem, como primatas, cães e porcos, por animais de menor tamanho, especialmente os camundongos. Isto porque aproximadamente 80% dos genes funcionam nos camundongos da mesma maneira que em humanos. Assim, essa tendência da redução na quantidade de animais por estudo deverá ser acentuada no futuro, pois o refinamento progressivo das técnicas de transgenia segue gerando modelos animais que mimetizam, cada vez com maior similaridade, os sintomas e as respostas aos tratamentos de doenças humanas. ¾ Trangene ou Construto de DNA A estrutura do transgene ou construto de DNA depende do tipo de animal a ser gerado, conforme se queira elevar a expressão de uma proteína, impedi-la de ser produzida ou alterar-lhe a estrutura (Figura 29.1A-C). O transgene inteiro ou parte dele pode ser proveniente da mesma espécie (DNA endógeno) ou de uma espécie diferente (DNA exógeno), desde vírus e bactérias até plantas e humanos. 472

3 O construto para adição gênica pode ser o transgene para microimjeção prónuclear (Figura 29.1A) ou o transgene viral (Figura 29.1C), ambos capazes de levar a produção de um animal que tem aumento da expressão de uma proteina. Já o construto para mutação sítio-dirigida (Figura 29.1B) possibilita a geração de animal nocaute (deficiente numa proteína) ou knok-in (produtor de uma proteina com defeito). A preparação do transgene deve iniciar-se com alguns meses de antecedência ao trabalho com os animais, pois sua construção requer o uso de diversas técnicas de biologia molecular, obedecendo-se em geral as seguintes etapas: isolamento, clonagem e sequenciamento do gene de interesse; introdução de mutações para codificar alterações proteicas ou remover sítio de enzimas de restrição indesejáveis; ligação do gene ao promotor e sequências reguladoras; inserção em vetores virais e plasmídeos bacterianos; amplificação de várias cópias dos fragmentos do DNA na forma circular em bactérias; exclusão de regiões de DNA de bactéria ou vírus; linearização e purificação do construto final. Transgene para Adição Gênica por Microinjeção Pró-nuclear O construto é formado essencialmente de um promotor ligado a sequência codificadora do gene a ser expresso (Figura 29.1A). O promotor indica onde (no coração, cérebro, outro órgão ou no corpo inteiro), quanto e em qual fase do desenvolvimento (embrionária, juvenil ou adulta) uma proteína deve se expressar no animal transgênico. Alguns promotores, podem ser induzidos por drogas ou nutrientes, como metais, de modo que a proteína de interesse pode ser produzida temporária ou permanentemente. Já a sequência codificadora é constituída basicamente de intron(s) e exon(s) de um gene conhecido. Uma ótima construção de transgene para a produção de um modelo de doenças humanas é aquela que leva a geração de uma linhagem animal que simule ao máximo os sintomas típicos da doença. Para isso, o construto deve ser estruturalmente o mais semelhante possível com a sequência de DNA responsável pela doença. Sabe-se, por exemplo, que a Coreia de Huntington humana é causada por uma alteração na proteína huntintina, que consiste num acréscimo de uma cauda de poliglutamina, codificada por uma centena de repetições do códon CAG no final do primeiro exon. Pois a adição desta sequência do gene humano, incluindo as repetições, a camundongos e macacos resultou em modelos transgênicos que apresentam desordens neurológicas e musculares tão severas quanto aquelas observadas nas pessoas afetadas. Além disso, a caracterização bioquímica do cérebro destes animais também reproduz o padrão de alterações em humanos portadores da doença de Huntington. Portanto, estes estudos usando animais transgênicos elevam a esperança do desenvolvimento de terapias para a doença humana. Capítulo 29 Técnica de Transgenia Transgene para Nocaute ou Alteração de um Gene A estrutura deste construto, em geral, compreende a sequência codificadora de um gene, interrompida pela inserção de um segundo gene que confere resistência ao antibiótico neomicina, acrescido de um terceiro gene que confere 473

4 Parte V Biotecnologia sensibilidade a uma droga, como ganciclovir, que mata as células onde houve integração aleatória (não homóloga) do transgene (Figura 29.1B). Assim, ao incorporar-se no DNA em células-tronco embrionárias cultivadas na presença de ambas as drogas (neomicina e ganciclovir), este construto permite que sobrevivam apenas aquelas células que tiveram o gene defeituoso inserido por recombinação homóloga, que são as que servem para a produção do animal nocaute ou knock-in. O transgene inserido no camundongo nocaute ou knock-in causa uma modificação genética dirigida a um gene alvo específico, cuja ausência ou mutação é a causa de algum distúrbio conhecido. Nestes animais, o construto contendo o gene desativado ou defeituoso tomou o lugar do gene íntegro original. No nocaute, há o acréscimo do gene de codifica para a proteína que destrói neomicina, cuja sequência interrompe o DNA do gene alvo, desativando-o. A distância interposta entre partes inicial e final do gene alvo impede a transcrição completa do RNA mensageiro da proteína por ele codificada, mas é suficientemente curta para ter permitido a recombinação homóloga com o DNA original. No knockin, um gene modificado por uma ou mais mutações substituiu o gene funcional original e isto leva a expressão de uma proteína alterada na nova linhagem de animal transgênico. Transgene Viral Constitui-se de um vetor de DNA viral (em geral uma parte de um retrovirus, como HIV ou vírus da leucemia murina, MMLV) ligado a um promotor e a região codificadora da proteína de interesse (Figura 29.1C). Utilizado para adição gênica, o transgene viral tem estrutura em geral mais complexa do que aquele construído para microinjeção pró-nuclear, e guarda semelhança com os construtos usados em terapia gênica. Por exemplo, o transgene de algumas linhagens de camundongos e ratos que expressam a proteína GFP (green fluorescent protein) foi construído juntando-se uma porção do vírus HIV com o promotor de ubiquitina humana fundido ao gene GFP da Aequorea Victoria. O transgene viral frequentemente contém sequências regulatórias específicas, especialmente algum elemento que reforce a capacidade do promotor em elevar a expressão do gene (enhancer). Por exemplo, para as linhagens de camundongos Tg-EGFP, a nomenclatura EGFP indica a presença de Enhanced GFP, o que contribui para a visualização a olho nu da bioluminescência por todo o corpo dos camundongos verdes (Figura 29.2). ¾ Métodos de Produção de Animais Transgênicos Os métodos de manipulação de embriões e transferências de genes vêm sendo continuamente refinados e atualmente encontram aplicação para os mais variados propósitos. Desde 1976, ano em que foi gerado o primeiro camundongo transgênico até as recentes clonagens de ovelhas, bezerros e macacos previamente modificados geneticamente, podemos destacar três diferentes técnicas de transgênese: 474

5 Figura 29.1 Trangenes: Estrutura do construto de DNA para micoinjeção pronuclear (A), inativação ou alteração de um gene (B) e transgenia por retrovirus (C). Os construtos A e C contêm os elementos essenciais para a adição gênica e consequente produção de um animal transgênico para expressar uma proteína. O construto B é usado para fazer um animail nocaute (não produz uma proteína) ou knock-in (produz uma proteína alterada). Capítulo 29 Técnica de Transgenia Figura 29.2 camundongos verdes ou transgênicos que expressam GFP ( green fluorescent protein ). A imagem é resultado da sobreposição de fotografias em campo claro e sob luz fluorescente. A reprodução é parte de uma nota divulgada na Internet com a seguinte indicação para citação: NIH/National Institute Of Child Health And Human Development (2004, November 4). Researchers Grow Sperm Stem Cells In Laboratory Cultures. ScienceDaily. Retrieved June 3, 2008, from releases/2004/11/ htm. 475

6 Microinjeção Pronuclear Parte V Biotecnologia Esta é a estratégia mais comum de transgenia animal. O construto é injetado com o auxílio de um micromanipulador dentro dos pró-núcleos de óvulos fecundados (Figura 29.3). Após injeção, os embriões são reimplantados dentro do oviduto de uma fêmea pseudográvida devido à modificação de sua condição hormonal por acasalamento com um macho vasectomizado. Uma vez obtido o animal transgênico, deve-se aguardar a geração seguinte (F1), obtida do cruzamento com um animal não-transgênico para proceder-se à análise dos descendentes (em geral de 10 a 50% da ninhada apresentam o transgene). A integração do transgene ocorre de forma aleatória, em uma ou várias cópias e, quase sempre, durante a primeira divisão mitótica do ovócito. Dessa forma, todas as células de um mesmo animal portam o transgene no genoma, mas cada microinjeção resulta na produção de uma única linhagem, caracterizada pelo local de inserção e número de cópias do construto de DNA incorporado. Para a obtenção de homozigotos é necessário esperar a geração F2, que é obtida do cruzamento entre macho e fêmea, ambos hemizigotos e descendentes daquele único animal fundador da linhagem transgênica. Um exemplo clássico de transgenia usando microinjeção pró-nuclear é aquele iniciado pela fusão do gene do hormônio de crescimento de rato com o promotor de metalotioneina, que possibilitou o nascimento de um camundongo com o dobro do peso de um camundongo normal. Mas, este exemplo também ilustra a baixa eficiência da técnica: nasceu um único animal de fenótipo mais volumoso entre 21 filhotes no total, como o resultado de 170 embriões transferidos para mães adotivas, que por sua vez foram selecionados pela sua aparência viável entre aproximadamente quase mil zigotos microinjetados. A manipulação dos animais para a adição de um gene encontra-se descrita em diversos manuais e revisões da literatura. De uma maneira geral, a produção de um animal transgênico por microinjeção pronuclear compreende as seguintes etapas: Superovulação Para obter uma grande quantidade de óvulos fecundados, fêmeas prépúberes de idade entre 4 e 8 semanas são induzidas artificialmente a uma superovulação pela injeção de dois diferentes hormônios, com dois dias de intervalo: o primeiro hormônio é o PMSG (Pregnant Mare s Serum Gonadotropin) que ativa o hormônio estimulante de folículo chamado FSH (Follicular Stimulating Hormone); o segundo hormônio é o hcg (human Chorionic Gonadotropin) que mimetiza o pico de LH (hormônio luteinizante). As injeções são feitas intraperitonealmente. Após a segunda injeção, as fêmeas são colocadas junto com um macho durante uma noite. No dia seguinte, as fêmeas que acasalaram podem ser reconhecidas pela presença de um tampão vaginal, o qual é constituído de uma massa branca e endurecida formada por proteínas do líquido seminal. Em geral, mais de 50% das fêmeas são positivas. 476

7 Capítulo 29 Técnica de Transgenia Figura 29.3 Esquema da produção de animais transgênicos pela técnica da microinjeção pró-nuclear: Os óvulos fertilizados são removidos do oviduto no estágio de zigotos óvulo fecundados, mas com o material genético dos pais ainda separados em dois pró-núcleos. A microinjeção é feita pela adição de alguns picolitros de solução contendo de 100 a 500 moléculas do DNA transgene dentro de um pró-núcleo. Os zigotos manipulados são reimplantados dentro do oviduto de uma fêmea pseudográvida. Os neonatos são submetidos à análise de DNA, que é isolado a partir de uma biópsia da ponta da cauda. Cada amostra de DNA é amplificada por PCR e a presença do transgene é detectada por eletroforese em gel de agarose. Em caso positivo, todas as células de um mesmo animal carregam o transgene. Cada microinjeção resulta na produção de uma única linhagem de transgênicos. A figura ilustra a produção de camundongos, mas esta técnica é aplicável a qualquer espécie. (Adaptado de Watson & Gilman, 1998). Remoção dos Óvulos Fertilizados As fêmeas são sacrificadas por deslocamento cervical e procede-se a abertura da cavidade abdominal para a dissecção dos ovidutos (Figura 29.4). Cada oviduto contem entre 10 e 15 óvulos localizados numa região bem dilatada, próxima a abertura denominada de infundibulum. Os óvulos fecundados são recolhidos sob uma lupa binocular pela ruptura e lavagem do oviduto, utilizando-se 477

8 um meio de cultura contendo a enzima hialuronidase que os liberta do grumo de células foliculares. Então, os óvulos são lavados mais três vezes em um meio de cultura sem hialuronidase e conservados neste meio a 37 o C, sob atmosfera de 5% de CO 2, até o momento da microinjeção. Parte V Biotecnologia Figura 29.4 Dissecção do oviduto pela ruptura da região mais dilatada para coleta dos óvulos fertilizados, sob uma lupa binocular. Microinjeção Esta etapa é realizada sob um microscópio invertido acoplado a micromanipuladores e a um monitor de vídeo (Figura 29.5A-C). Os ovócitos são colocados sob uma gota de meio de cultura, coberta por óleo de parafina, sobre uma lâmina de vidro escavada. O micromanipulador esquerdo auxilia na contenção do ovócito por uma micropipeta, sob fraca e contínua aspiração (Figura 29.5A). Neste estágio do desenvolvimento o zigoto apresenta dois núcleos bem visíveis que correspondem aos pró-núcleos masculino e feminino. O pró-núcleo masculino é maior e localiza-se mais próximo à membrana pelúcida, sendo em geral o escolhido para a injeção. Com auxílio do micromanipulador direito, é possível introduzir neste pró-núcleo uma pipeta de microinjeção (Figura 29.5B) e adicionar um volume de 1 a 5 picolitros da solução contendo entre 100 e 1000 cópias do transgene. A injeção da solução provoca um aumento no volume do pró-núcleo visível ao microscópio (Figura 29.5C). Os zigotos injetados constituem os chamados embriões micromanipulados que devem ser mantidos em estufa de CO 2 a 37 o C até o momento da transferência para um oviduto da mãe adotiva. 478

9 Figura 29.5 Microinjeção do transgene dentro do pró-nucleo de um zigoto. (A) Uma micropipeta de sucção segura o óvulo fertilizado enquanto a micropipeta de injeção é alinhada com o pró-núcleo; (B) micropipeta de injeção introduzida dentro do pró-núcleo; (C) microinjeção do DNA evidenciada pelo aumento de volume do pró-núcleo. Transferência para o Oviduto Embriões transplantados podem desenvolver-se e alcançar maturação normal somente quando encontram um ambiente hormonal adequado na mãe receptora. Para isto, é necessário acasalar fêmeas de aproximadamente seis semanas de idade na véspera da reimplantação com machos adultos vasectomizados, obtendo-se assim as chamadas fêmeas pseudográvidas. Nelas são reimplantados os zigotos sobreviventes à etapa da microinjeção. A cirurgia de transferência inicia-se com uma abertura no torso da fêmea anestesiada, donde é exposto o oviduto de modo a deixar bem visível, sob a lupa, a abertura do infundibulum. Cerca de 15 a 20 zigotos aparentemente viáveis são coletados e mantidos entre duas bolhas de ar dentro de uma micropipeta. Esta micropipeta é introduzida pelo infundíbulum em cada oviduto da fêmea pseudográvida, liberando os embriões, na expectativa de a gestação seja levada a termo. Capítulo 29 Técnica de Transgenia Modificação Genética de Células-Tronco para Produzir Camundongo Nocaute ou knock-in Animais transgênicos conhecidos como nocautes ou knock-in podem ser produzidos a partir de células embrionárias modificadas geneticamente (Figura 29.6). A modificação genética consiste na troca de um gene íntegro e funcional por um transgene contendo o mesmo gene desativado ou alterado (Figura 29.1B). As células-tronco são provenientes da massa celular interna do blastocisto do camundongo e são totipotentes, isto é, capazes de contribuir para grande parte do embrião quando injetadas na cavidade interna de um blastocisto recep- 479

10 tor (Figura 29.7). O embrião resultante contém, de maneira constitutiva, duas linhagens celulares distintas, uma proveniente das células-tronco do blastocisto doador e outra originária do blastocisto receptor. Os primeiros neonatos provenientes destes embriões são denominados de quimeras, que cruzados entre si, podem gerar o animal nocaute ou knock-in. Esta técnica permitiu a realização de um antigo sonho dos geneticistas: Provocar, a priori, mutações dentro de um gene escolhido para estudo. Isto se tornou possível em decorrência dos trabalhos realizados por Mansour e cols. (1988), que conseguiram substituir in vitro, ou seja, dentro das células embrionárias em cultura, uma sequência de DNA normal por uma sequência homóloga mutada. Assim, em teoria, é possível inativar qualquer gene, desde que sua sequência genômica seja conhecida. O gene endógeno pode ser trocado por uma construção contendo uma mutação específica ou que interrompa o gene impedindo-o de se expressar. Este evento, que só ocorre por recombinação homóloga, é mais fácil nas células-tronco embrionárias porque elas são ainda totalmente indiferenciadas. Parte V Biotecnologia Isolamento dos blastocistos doadores de células-tronco Transferência para fêmea pseudográvida Remoção da massa celular interna Transgene Injeção das células-tronco modificadas no blastocisto receptor Recombinação homóloga Camundongo Camundongo nocaute ou knock-in heterozigoto Figura 29.6 Esquema da produção de animal nocaute ou knock-in pela injeção de célulastronco embrionárias modificadas em blastocisto. Os primeiros neonatos provenientes da fusão da células-tronco modificadas com o bastocisto receptor produzem camundongos quiméricos, que cruzados entre si, podem gerar o animal nocaute ou knock-in. 480

11 Figura 29.7 Microinjeção de células-tronco embrionárias no blastocisto. (A) Blastocisto receptor posicionado na direção da micropipeta de injeção contendo células-tronco modificadas. (B) Injeção das células-tronco modificadas na cavidade interna do embrião. Capítulo 29 Técnica de Transgenia A obtenção do alelo nulo, denominado nocaute, possibilita o estudo da função gênica. Tecnicamente podemos inativar de maneira sistemática todos os genes dos quais a sequência seja conhecida e assim acessar os efeitos da ausência de sua função pelo estudo do animal nocaute. Até o presente, esta técnica tem sido aplicada apenas a camundongos, pois além de humanos, esta é a única espécie animal da qual foi possível estabelecer culturas de células tronco-embrionárias totipotentes. Para outros animais, a limitação consiste justamente na dificuldade de manter indiferenciadas as células-tronco derivadas de embriões. O método cre-loxp também é utilizado para inativação de genes. Este consiste em inativar um gene de forma específica em um tecido determinado com um tempo pré-estabelecido. Essa técnica possibilita a inativação de genes essenciais durante o desenvolvimento embrionário, porém ela perde sua especificidade tissular no indivíduo adulto. A produção do animal nocaute ou knock-in inclui muitas etapas semelhantes àquelas descritas para a microinjeção pró-nuclear. Diferencia-se principalmente por requerer as etapas de cultura e transfecção das células tronco e a manipulação dos embriões na fase de blastocisto, conforme o detalhamento seguinte: 481

12 Inserção do Construto de DNA nas Células-Tronco Embrionárias Parte V Biotecnologia Em geral utiliza-se o método de eletroporação, que por choque elétrico, permite uma transfecção rápida de uma grande quantidade de células. A tranfecção consiste em introduzir de uma a várias cópias de DNA exógeno dentro das células, obtendo-se em geral apenas de 1% de recombinantes. Estas sobrevivem porque incorporam o gene da proteína que destrói o antibiótico colocado no meio de cultura, geralmente neomicina, além de não serem sensíveis a um bloqueador do alongamento da cadeia de DNA (geralmente ganciclovir); é que a recombinação homóloga também as livrou do gene de timidina quinase que leva a incorporação do bloqueador de síntese de DNA. As células transfectadas são mantidas em cultura para a proliferação de clones, constituindo-se nas células-tronco geneticamente modificadas a ser utilizadas na produção do animal nocaute ou knock in. Atualmente, é possível adquirir células-tronco deficientes em um gene específico dos mesmos laboratórios que costumam fornecer células-tronco embrionárias e animais de diversas linhagens. Coleta dos Embriões Embriões em fase de blastocisto são coletados do útero três dias após do acasalamento. Recolhidos por lavagem uterina com um meio de cultura apropriado, os balastocistos são mantidos a 37 o C em estufa de CO 2 até o momento de injeção. Microinjeção Os embriões na fase de mórula a blastocisto são injetados utilizando-se um micromanipulador (Figura 29.7), de modo semelhante à injeção em óvulos fecundados, conforme descrito no item Oito a dez células que contêm o transgene são microinjetadas dentro de cada embrião. Os embriões injetados são mantidos a 37 o C até o momento de reimplantação. Reimplantação no Útero Os blastoscistos que resistiram à microinjeção e aparentam desenvolvimento embrionário normal são transferidos para o útero de fêmeas pseudográvidas. Cada fêmea conduz a gestação de 10 a 15 embriões. Infecção Viral Consiste no cultivo de embriões na presença de sequências virais de DNA ou RNA ligadas a um gene de interesse (Figura 29.1C). Essas sequências podem se integrar no genoma dos embriões produzindo animais quiméricos, que após cruzamento podem dar origem a linhagens transgênicas. Deste modo, é possível obter-se animais transgênicos de quaisquer espécies, não sendo necessário equipamentos sofisticados de micromanipulação. Entretanto, há limitações quanto 482

13 ao tamanho da sequência a ser inserida no vetor viral e a transfecção de células embrionárias geralmente resulta em baixa frequência de expressão do transgene entre as células germinativas. É importante ressaltar que foi a infecção de embriões de camundongo com o retrovírus da leucemia Moloney que permitiu a geração da primeira linhagem de animais transgênicos, um marco da Biotecnologia realizado por Jaenish e colaboradores em Atualmente, a transgenia viral é ainda uma opção interessante para a transgênese de espécies cujos embriões escuros dificultam a microinjeção pronuclear, como os de galinha e de porco. Além disso, a sofisticação nas contruções dos transgenes pelo acréscimo de novas sequências virais, como CMV (citomegalovirus) ou outros elementos de efeito enhancer, resultaram na geração de muitas espécies de transgênicos nos últimos anos, como os camundongos verdes (Figura 29.2) e os ratos GFP. Paralelamente, o aprimoramento da trangenia viral tem contribuído para o aperfeiçoamento da terapia gênica. Uma estratégia importante para esta forma de terapia é que vetores virais são utilizados para inserir genes de interesse em células tronco derivadas de embriões ou da medula óssea, que por sua vez podem ser integradas ao organismo e gradualmente atenuar diversos tipos de doenças. A diferença relevante entre terapia gênica e transgenia viral é que nesta última somente as espécies quiméricas que tiverem o novo gene acrescentado nas suas células germinativas poderão constituir uma nova linhagem de animal transgênico. ¾ Genotipagem de Animais Transgênicos Capítulo 29 Técnica de Transgenia A análise dos neonatos pode ser feita a partir de uma pequena quantidade de tecido, em geral proveniente da ponta da cauda ou de um furo na orelha. Cada biópsia pode ser congelada a -20 o C durante alguns dias, mas deve ser processada tão logo quanto possível para a extração do DNA antes que ocorra a sua degradação. Em geral a solução de extração do DNA contém um detergente, alguns sais, e as enzimas Proteinase K e Ribonuclease A. A detecção do transgene no genoma dos filhotes é realizada pela técnica de PCR (Polimerase Chain Reaction), embora a metodologia de Southern blot (hibridização com sonda de DNA contendo fósforo radioativo) também tenha sido usada. Para a reação de PCR, necessita-se de uma enzima de síntese de DNA resistente à alta temperatura (Taq polimerase) e de dois a cinco pequenos oligonucleotídeos específicos para cada modelo animal. Estes oligonucleotídeos são mais conhecidos como primers, pois se anelam ao DNA complementar para dar início à amplificação de várias cópias de DNA. Assim, os produtos de PCR apresentam tamanhos diferentes, conforme os primers encontrem como molde o transgene ou apenas o DNA do animal selvagem. A separação dos produtos de PCR é realizada por eletroforese em um gel de agarose corado com brometo de etídeo. A imagem do gel é fotografada sob luz ultravioleta. Conforme o êxito do procedimento, aparece no gel uma banda de migração do transgene, geralmente mais próxima ao topo do gel, porque o construto de DNA frequentemente apresenta maior peso molecular do que o gene original sozinho. Neste caso, quando primers para o gene não alterado são 483

14 Parte V Biotecnologia adicionados à reação de PCR, aparece também uma banda de menor tamanho como o resultado da amplificação uma região do gene intacto, ou seja, a banda que indica ser a amostra proveniente um animal selvagem ou heterozigoto. Nessas condições, a detecção uma única banda do tamanho esperado para a presença do transgene identifica um animal transgênico homozigoto. A genotipagem da colônia de ratos Sprague-Dawley transgênicos que expressam a green fluorescent protein (SD-Tg(GFP)2BalRrrc) foi recentemente estabelecida em nosso laboratório de Controle Genético (Figura 29.8). Esta linhagem é muito usada como fonte de células marcadas para transplante, mas ao contrário dos camundongos GFP verdes (Figura 29.2) não podem ser reconhecidos a olho nu, visto que não expressam a proteina bioluminescente na pele, e sim em órgãos internos. Então, é a genotipagem por PCR que nos permite distinguir animais selvagens de transgênicos heterozigotos e homozigotos e assim garantir a continuidade da colônia. Para isso, adaptamos protocolos previamente descritos. Como na maioria dos casos, a adaptação implicou em mudança na temperatura e no tempo de anelamento dos pimers, pré-determinados no programa a ser executado pelo termociclador. A necessidade de modificações nos protocolos de PCR, em relação ao recomendado pelo fornecedor, pode ser consequência do contínuo aperfeiçoamento de equipamentos e kits de reagentes, cada vez mais sensíveis à menos de DNA e menos insensíveis à mais impurezas. Esta percepção é mais acentuada em relação à linhagens mais antigas, afinal dependendo do modelo transgênico, já pode ter envelhecido até três décadas. 1 pb Peso molecular Rato selvagem Sprague-Dawley Transgênica GFP heterozigoto Transgênica GFP homozigoto pb Figura 29.8 Genotipagem dos ratos Sprague-Dawley transgênicos que expressam a green fluoescent protein, conhecidos como ratos GFP. O programa para o termocicador inclui 35 ciclos de três etapas: (a) desnaturação a 94 o C por 1 min, (b) anelamento a 56 o C por 50 segundos e (c) extensão a 72 o C por dois minutos. As bandas nesta imagem do gel correspondem aos produtos da reação de PCR, utilizando-se primers da literatura. 484

15 ¾ Considerações Finais A questão de melhoramento das espécies é um tema ressonante na memória coletiva, o que torna necessário o controle da utilização indevida das inovações da biotecnologia. Isso implica a incorporação da dimensão histórica da inovação, não só por meio da evolução da espécie e do desenvolvimento do organismo, mas também da dinâmica geopolítica de sua interpenetração no ambiente e no universo social, conforme sugerido em recente ensaio dialético de Lewontin & Levins. Por outro lado, promover o desenvolvimento de novos modelos animais, tanto para a pesquisa como para produção de medicamentos, é uma questão de soberania nacional. Portanto, a produção e uso animais de transgênicos deve ser, caso a caso, criteriosamente avaliada pelos comitês e órgãos públicos encarregados das questões éticas, sem prejuízo da concepção de que os benefícios das novas tecnologias deverão ter alcance universal. Bibliografia Consultada 1. Benavides F, Guénet J. Murine models for human diseases. Medicina (B Aires), 61:215-31, Bertoncini CRA. Animais Transgênicos. In: EÇA, L. Biologia Molecular Guia Prático e Didático. Rio de Janeiro: Ed. Revinter, pp , Bertoncini CRA, Lima H. Biotecnologia e soberania nacional. Revista Universidade e Sociedade, 36:125-36, Coulson-Thomas YM, Coulson-Thomas VJ, Filippo TR, Mortara RA, Silveira RB, Nader HB, Porcionatto MA. Adult bone marrow-derived mononuclear cells expressing chondroitinase AC transplanted into CNS injury sites promote local brain chondroitin sulphate degradation. J Neuro Meth, 171:19-29, Echelard Y, Ziomek CA, Meade HM. Production of recombinant therapeutic proteins in the milk of transgenic animals. Biopharm Int, 19:36-46, Freitas VJF, Serova IA, Andreeva LE et al. Production of transgenic goat (Capra hircus) with human Granulocyte Colony Stimulating Factor (hg-csf) gene in Brazil. An Acad Bras Cienc, 79:585-92, Gordon JW, Scangos GA, Plotkin DJ, Barbosa JA, Ruddle FH. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc Natl Acad Sci USA, 77:7380-4, Gu H, Marth JD, Orban PC et al. Deletion of a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene targeting. Science, 265:103-6, Houdebine L. The Mouse as an animal model for human diseases. In: Hedrich H, Bullock G. The Laboratory Mouse. San Diego: Ed. Elsevier Academic Press, pp , Hogan B, Beddington R, Costantini F, Lacy E. Manipulating the mouse embryo. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Jaenisch R. Transgenic animals. Science, 240: , Lewontin R, Levins R. Biology Under the Influence Dialectical Essays on Ecology, Agriculture, and Health. Monthly Review Press, Lois C, Hong EJ, Pease S, Brown EJ, Baltimore D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science, 295:868-72, Capítulo 29 Técnica de Transgenia 485

16 Parte V Biotecnologia 14. Monk M. Mammalian Development: a practical approach. IRL Press, Oxford, Mothe AJ, Kulbatski I, Bendegem RL, Lee L, Kobayashi E, Keating A, Tator CH. Analysis of green fluorescent protein expression in transgenic rats for tracking transplanted neural stem/progenitor cells. J Histochem Cytochem, 53: , Okabe M, Ikawa M, Kominami K, Nakanishi T, Nishimune Y. Green mice as a source of ubiquitous green cells. FEBS Lett, 407:313-9, Palmiter RD, Brinster RL, Hammer RE et al. Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothionein-growth hormone fusion genes. Nature, 300:611-5, Pesquero J, Magalhães LE, Baptista HÁ, Sabatini RA. Animais transgênicos. Biotecnologia, Ciência & Desenvolvimento, 27:52-6, Pesquero JB, Baptista HÁ, Motta FL, Oliveira SM. Aplicações dos animais transgênicos. Scientific American Brasil, p. 56, Schnieke AE, Kind AJ, Ritchie WA, Mycock K, Scott AR, Ritchie M, Wilmut I, Colman A, Campbell KHS. Human factor IX trangenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts. Science, 278:2130-3, Teles AVFF, Rosenstock TR, Okuno CS, Lopes G, Bertoncini CRA, Smaili SS. Increase in bax expression and apoptosis are associated in Huntington s disease progression. Neuroscience Lett, 438:59-63, Watson JD, Gilman M, Witkowski J, Zoller M. The introduction of forein genes into mice. In: Recombinant DNA. New York: Freeman & Company, pp , Yang S, Cheng P, Banta H et al. Towards a transgenic model of Huntington s disease in a non-human primate. Nature, in press, doi: /nature06975,