Hematologia. 1. Coleta de sangue 30/12/2010. Coleta com anticoagulante adequado. Identificação do paciente. Rotulagem prévia dos frascos de coleta.

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1 Hematologia Marcos K. Fleury Laboratório de Hemoglobinas Faculdade de Farmácia - UFRJ mkfleury@ufrj.br 1. Coleta de sangue Coleta com anticoagulante adequado. Identificação do paciente. Rotulagem prévia dos frascos de coleta. Posição do paciente sentado ou deitado. Imobilização correta de crianças. Uso de luvas durante a coleta. 1

2 1. Coleta de sangue Coleta de material preferencialmente da fossa antecubital (cubital mediana, cefálica ou basílica). Desinfecção da pele com etanol a 70%. O garroteamento deve se estender por, no máximo, 1 minuto. 1. Coleta de sangue Coleta a vácuo ou com seringa. (0,9 mm e 0,8 mm para adultos e 0,7 mm e 0,6 mm para as crianças). Pressão negativa mínima. Liberar o garrote antes de retirar a agulha. Pressionar o local da punção com o braço esticado. Homogeneizar o material por inversão (4 ou 5 vezes). 2

3 1. Coleta de sangue Quando se usa uma sequência de tubos o anticoagulante de um pode contaminar o subsequente. Heparina interfere nos testes de coagulação. EDTA interfere na dosagem de cálcio. Fluoreto de sódio interfere nos testes hematológicos. Não coletar sangue acima de local de infusão venosa. 1. Coleta de sangue Sequência recomendada (CLSI, 1998) Tubos para hemocultura. Tubos secos (soro) Tubo com citrato de sódio. Tubos com gel separador / tubos secos. Tubos com heparina. Tubos com EDTA Tubos com fluoreto de sódio. 3

4 1. Coleta de sangue Sangue capilar Preferencialmente colhido da superfície plantar do calcanhar em bebês ou crianças até dois anos. Em crianças maiores ou adultos a coleta deve ser feita na superfície palmar das falanges distais dos dedos. 1. Coleta de sangue Sangue capilar O dedo médio ou o anular são os preferidos. Em adultos a picada deve ultrapassar 1,5 mm de profundidade. Lancetas mais curtas devem ser usadas em RN e prematuros. A primeira gota de sangue deve ser desprezada. 4

5 1. Coleta de sangue Sangue de cordão umbilical Coleta com seringa e agulha. Limpeza do sangue da superfície. Evitar a ordenha para não contaminar o material com a geléia de Wharton (hemaglutinação). Os parâmetros hematológicos são diferentes do sangue venoso de RN. 1. Coleta de sangue Anticoagulantes e contêineres. Anticoagulante de escolha K 2 EDTA, K 3 EDTA e o Na 2 EDTA. K 2 EDTA seco ou em solução, em concentração final de 1,5 a 2,2 mg/ml (ICSH). Evitar o excesso de EDTA morfologia e eritrócitos. K 3 EDTA causa desidratação dos eritrócitos. 5

6 1. Coleta de sangue Padronização dos procedimentos. Toda amostra é considerada como potencialmente infectante. Uso de luvas pelo coletador em qualquer circunstância. As luvas devem ser trocadas a cada paciente. O sistema a vácuo é preferível ao de seringas. Se a transferência de material for necessária, não retirar a tampa do tubo. O tubo não deve ser segurado com a mão durante a transferência. 1. Coleta de sangue Ferimentos com agulhas Hepatite B pacientes Hbe-positivo de 7 a 30%. Hepatite C Frequência de transmissão de 0 a 10%. HIV Frequência de transmissão é de 0,46%. Outras infecções malária, criptococose, tuberculose, febre hemorrágica viral e dengue. Vacina anti-hbv. Profilaxia anti-retroviral (HIV). Interferon (hepatite C). 6

7 2. Preparo da distensão de sangue Amostra Pode ser feita com sangue sem anticoagulante venoso ou capilar, ou com EDTA. O EDTA impede a agregação plaquetária distribuição homogênea. Sangue capilar apresenta grumos plaquetários. 2. Preparo da distensão de sangue Amostra Distensões sem anticoagulantes são isentas de artefatos. Boa Prática Anotar hora da coleta e hora da confecção da lâmina. 7

8 2. Preparo da distensão de sangue Lâminas limpas desengorduradas e não devem ser porosas coloração de fundo Uso de luvas. A rolha do tubo não deve ser usada como conta-gotas. O sangue deve ser manipulado com um capilar. 2. Preparo da distensão de sangue Colocação de uma gota de sangue na extremidade da lâmina Ângulo de 25 o a 30 o aplicado na frente da gota. Movimento suave e uniforme. Bain B, 4ª Ed

9 2. Preparo da distensão de sangue Amostras mais viscosas (hematócrito alto) necessitam de um ângulo mais agudo para uma película mais fina. Amostras menos viscosas (mais anêmicas) o ângulo da distensora deverá ser mais obtuso. A técnica deve produzir uma película de sangue com uma cauda reta. A distensora deve ser limpa após cada utilização. Identificação correta do material. A secagem deve ser rápida. Área mais fina Área mais grossa 9

10 3. Coloração Vários corantes estão disponíveis Wright, Giemsa, May- Grünwald. Todos estão baseados no método de Romanowsky (eosina + azul de metileno). Os azures conferem aos ácidos nucléicos, às nucleoproteínas e ao grânulos basófilos a coloração azul. A eosina confere a cor laranja à hemoglobina, aos grânulos eosinofílicos e combinado á proteínas confere um gradiente de tons de azul a várias estruturas. 3. Coloração A coloração deve ser feita em ph correto. ph muito baixo leucócitos pálidos com grânulos vermelhos. ph alto impregnação de corante básico, impede a visualização de policromatofilia, os grânulos eosinófilos ficam acinzentados. O ph ideal deve estar entre 6,4 e 7,2. Os corantes devem ser filtrados. 10

11 3. Coloração Componentes celulares Cromatina (incluindo Howell-Jolly) Grânulos promielocíticos e bastonete de Auer Citoplasma de linfócitos Citoplasma de monócitos Citoplasma rico em RNA Corpos de Döhle Grânulos de neutrófilos e linfócitos Grânulos basofílicos Grânulos eosinofílicos Eritrócitos Cor Púrpura Vermelho púrpura Azul Azul-acinzentado Azul escuro Azul-acinzentado Púrpura claro ou roxo Azul ou negro Laranja Rosado 11

12 Baço Rins Fígado Sistema Hematopoético Sangue Medula Óssea 12

13 Componentes celulares Stem Cell Stem Cells Mielóide Stem Cell Linfóide Progenitores Unipotentes Linfócitos Basófilos Eosinófilos Neutrófilos Monócitos Plaquetas Eritrócitos Plasma Mecanismo de transporte 90-92% água. 6-7% proteínas 2-3% Gorduras Carbo-hidratos (glicose) Eletrólitos Gases (O 2, CO 2 ) Mensageiros químicos Proteínas 7% 13

14 Hemácias Hemoglobina Molécula transportadora de O 2 Composta de 4 subunidades:» Globina (1 molécula de O 2 )» Heme (ferro) Totalmente saturada = 4 subunidades de globina com O 2» cada grama de hemoglobina = 1,34 ml O 2 Produção de eritrócitos Eritropoese Eritropoietina Análise laboratorial das hemácias Contagem de hemácias Hematócrito Hemoglobina Hemácias : 45% Plasma: 54% Hematócrito 14

15 Leucócitos Leucometria Normal 5,0 a 9,0 x 10 9 /l Leucopoese Granulócitos Neutrófilos Basófilos Eosinófilos Monócitos Linfócitos Leucócitos Marginação Fagocitose 15

16 Leucócitos -Imunidade Linfócitos T imunidade celular Linfócitos B imunidade humoral Imunidade humoral Um macrófago fagocita um determinado antígeno e processa-o. O determinante antigênico liga-se a uma proteína e é apresentado à superfície do macrófago; O determinante antigênico é reconhecido linfócitos T auxiliares; O clone de linfócitos B é ativado e sofre multiplicação; Os linfócitos B diferenciam-se em plasmócitos (produzem anticorpos) e em células de memória (atuam na segunda resposta imunitária); Os anticorpos interagem com o antígeno e levam à sua destruição; 16

17 Imunidade celular Os determinantes antigênicos são reconhecidos pelos linfócitos T auxiliares; Os linfócitos T auxiliares diferenciam-se em linfócitos T citotóxicos e linfócitos T de memória. Liberam mediadores químicos que estimulam a fagocitose, a produção de interferon e a produção de anticorpos pelos linfócitos B; Os linfócitos T citotóxicos ligam-se às células estranhas e libertam perforina (proteína que provoca a lise celular); Os linfócitos T de memória desencadeiam uma resposta mais rápida e vigorosa num segundo contato com o mesmo antígeno. 17

18 Ag 1ª Exposição Ativação direta Macrófagos Células apresentadoras de antígeno Ag presentes em células Infectadas ativam diretamente Linfócitos B Linfócitos T Helper Ag 2ª Exposição Linfócitos T citotóxicos Plasmócitos Anticorpos Células B de memória Linfócitos T Citotóxicos ativos Técnicas Básicas 18

19 Técnicas básicas Hematócrito fração ocupada pelos eritrócitos em uma coluna de sangue centrifugado expresso como plasma fração decimal volume/volume. Hematócrito -Representa o percentual de células vermelhas na amostra de sangue. VN: 39 a 48% É determinado por meio de centrifugação a uma velocidade de a g por 5 minutos de um capilar preenchido com sangue. X cm Y cm hemácias Pode ser usado sangue com EDTA ou heparina. Pode apresentar uma variação de 2 a 3% em relação aos equipamentos automatizados. Técnicas básicas Hemoglobina medida por colorimetria sendo expressa como uma fração decimal massa/volume. A dosagem é feita pela dissolução de um volume de sangue em diluente que lisa as hemácias produzindo uma solução de hemoglobina. VN: 13,0 a 16,0 g/dl A dosagem é feita por densidade ótica (ou absorvância) em 540 nm. O método recomendado pelo ICSH é o da cianometehemoglobina. 19

20 Técnicas básicas Contagem de eritrócitos Contados automaticamente permite uma estimativa do volume globular correlacionando-a ao hematócrito. Expressa como número de células por unidade de volume. Realizada em contadores automatizados pelo método de impedância. VN: 4,30 a 5,60 x /l Os equipamentos contam de a células melhorando a reprodutibilidade. Técnicas básicas Contagem de leucócitos contados em câmara (hemocitômetro) ou automaticamente. Expressos em número de células por unidade de volume. VN 5 a 9 x 10 9 /l Na contagem manual é difícil distingui-los dos eritroblastos. Amostras leucopênicas devem ser contadas manualmente. 20

21 Técnicas básicas Contagem manual de leucócitos. N = no de células contadas nos 4 quadrantes. D = diluição empregada (1:20) V = volume total contado. Se 200 células forem contadas: 200 x (10 x 20) /4 = /mm 3 Técnicas básicas Contagem de plaquetas Contadas por microscopia ótica ou automaticamente são expressas como número de células por unidade de volume. VN de 150 a 450 x 10 9 /l As técnicas manuais incluem metodologias usando sangue total ou plasma rico em plaquetas sedimentado ou centrifugado. O tamanho das plaquetas pode interferir nas contagens. 21

22 Técnicas básicas Índices hematimétricos - calculados a partir dos dados relativos a série vermelha Volume globular médio (VGM) -VN: 80 a 96 fl. VGM (fl) = Ht (%) x 10 Hm (milhões/µl) Hemoglobina globular média (HGM) VN: 27 a 32 pg HGM (pg) = Hb (g/dl) x 10 Hm (milhões/µl) Concentração de Hemoglobina globular média (CHGM) VN: 31 a 35% CHGM (g/dl ou %) = Hb (g/dl) x 100 Ht (%) Técnicas básicas Contagem de reticulócitos Podem ser contados manualmente ou por métodos automatizados. Os métodos manuais carecem de reprodutibilidade devido ao pequeno número de células contadas. As metodologias automatizadas podem classificar os reticulócitos de acordo com o grau de maturação da célula além de calcular os índices hematimétricos. 22

23 Técnicas básicas Contagem diferencial de leucócitos é a especificação dos tipos leucocitários expressa em percentagem. O ICSH preconiza a expressão dos resultados em valores absolutos. Distribuição desigual dos leucócitos na lâmina. Neutrófilos final da lâmina. Monócitos - nas bordas ao longo de toda a lâmina. Blastos e células imaturas concentram-se nos bordos. 23

24 Alterações dos Leucócitos. Eosinofilia ( > 700 cels. /mm 3 ) Alergias - asma brônquica, urticária e dermatite herpetiforme. Infestações parasitárias - esquistossomose e a estrongiloidíase. Doenças hematológicas - LMC, PV, anemia perniciosa. Doenças malignas - principalmente com metástases ou necrose. Eosinopenia Infecções - com neutrofilia e processos inflamatórios. Alterações dos Leucócitos. Linfocitose (> cels. / mm3). Infecções agudas: coqueluche, viroses inespecíficas, hepatite e mononucleose. Infecções crônicas: brucelose, tuberculose, sífilis secundária e congênita. Doenças hematológicas: LLC, LLA, alguns linfomas e tricoleucemia. Linfocitose relativa:exantemas, caxumba, rubéola, neutropenia e na convalescença de infecções agudas. 24

25 Alterações dos Leucócitos. Linfocitopenia (< cels. / mm3). Infecções agudas: pneumonia, tuberculose ativa. Doenças do colágeno: LES, artrite reumatóide. Deficiência imunológica: inclusive por HIV. Outras causas: necrose do pâncreas, radiação, quimioterapia, uso de esteróides. 25

26 Atipia linfocitária. Atipia linfocitária. 30/12/

27 Atipia linfocitária. Atipia linfocitária. 27

28 Atipia linfocitária. Alterações dos Leucócitos. Neutrofilia (> cels. / mm 3 ) Infecções agudas:causadas por cocos, bacilos, fungos, parasitas e algumas viroses (poliomielite, herpes zoster e catapora). Danos teciduais: decorrentes de queimaduras, cirurgias, infarto, gota e reações de hipersensibilidade. Intoxicações metabólicas: (uremia e cetoacidose diabética) Envenenamento: por drogas, agentes químicos e veneno de insetos. 28

29 Alterações dos Leucócitos. Neutrofilia (> cels. /mm 3 ) Hemorragia aguda. Hemólise aguda. Fisiológica: causada por exercício físico e gravidez e no neonato. Tumores:especialmente hepáticos e gastro-intestinais. Neoplasias hematológicas: principalmente a LMC e policitemia vera. Outras causas:como em decorrência da administração de corticóides e de fatores de crescimento. 29

30 Neutrofilia na infecção bacteriana. CM CA PM PC Normal. CM CA PM PC Mobilização do pool marginal. CM CA PM PC Liberação do compartimento de armazenamento. CM CA PM PC Aumento da proliferação. Fases do hemograma infeccioso. Fase Leucócitos Desvio à esquerda Granulação grosseira Granulação tóxica Vacúolos C. de Döhle Degeneração nuclear Bastão Mielócito Prómielócito (blastos) Blastos Blastos Neutropenia Blastos

31 Infecção bacteriana. 31

32 30/12/

33 Alterações dos Leucócitos. Neutropenia ( < cels. /mm 3 ) Infecções virais: citomegalovirus, dengue, EBV, hepatite, caxumba e febre amarela. Infecções bacterianas: brucelose, tuberculose, febre tifóide. Infecções parasitárias: leishmaniose e malária. Induzida por drogas: dipirona, barbitúricos, quinino, diazepina etc. Nutricionais: anemia megaloblástica. Alterações dos Leucócitos. Monocitose (> 950 cels. / mm 3 ). Infecções bacterianas: tuberculose, endocardite, sífilis, brucelose. Recuperação: de infecções bacterianas e agranulocitose. Parasitoses: malária, D. de Chagas e calazar. Doenças hematológicas: linfomas, leucemia monocítica, mieloma. Neoplasias: carcinoma de ovário, estômago e mama. Doenças do colágeno: LES e artrite reumatóide. Monocitopenia. Infecção:por HIV e nos casos de LLC. 33

34 30/12/