Resumo da apresentação. Processos biotecnológicos baseados na cultura de células de mamíferos. Ampliação de escala
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- Maria Júlia Carrilho Olivares
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1 VP VP 1 /7/1 Ampliação de escala do cultivo de células-tronco pluripotentes empregando sistemas agitados Leda Castilho Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) COPPE Programa de Engenharia Química Laboratório de Engenharia de Cultivos Celulares (LECC) I Curso Teórico-Prático em Células-Tronco Pluripotentes LaNCE-UFRJ - Julho de 1 Resumo da apresentação Processos biotecnológicos baseados na cultura de células de mamíferos Produtos obtidos destes processos Características em comum Ampliação de escala Biorreatores Modos de operação Experiência adquirida com outras células Cultivo de células-tronco pluripotentes em sistemas agitados Utilizando microcarregadores Na forma de agregados suspensos Processos biotecnológicos baseados em células de mamíferos Produtos biotecnológicos de células de mamíferos Produtos biotecnológicos de células de mamíferos Proteínas terapêuticas Proteínas terapêuticas, incluindo ant. monoclonais Geralmente proteínas grandes e complexas Diversas modificações pós-tradução Muitas delas de fácil degradação Erythropoietin Vacinas virais e recombinantes Terapia gênica Produtos para a saúde humana baseados em células de mamíferos Diagnóstico (in vitro e in vivo) Proteínas Proteins DNA Viruses Vírus Polypeptides Vetores Plasmids Capsids VLPs Capsidomers Células para terapia celular (células-tronco embionárias em frascos T (esq.) e em microcarregadores, marcadas com DAPI e OCT-) Usadas no tratamento de várias doenças: Esclerose múltipla (β-interferon) Câncer (anticorpos monoclonais) Anemia (eritropoetina, EPO) Hemofilia (fatores VIII e IX recombinantes) Neutropenia (estimulantes hematopoéticos: G-CSF e GM-CSF) Doenças cardíacas (ativador de plasminogênio tecidual, t-pa) Source: Anticorpos monoclonais Anticorpos recombinantes Vacinas Em especial vacinas virais Evolução da tecnologia: Animais e ovos embrionados Culturas de células primárias Uso de linhagens estabelecidas ou de partículas pseudo-virais Terapias gênicas Objetivam corrigir defeitos genéticos bloqueando, corrigindo ou substituindo genes defeituosos Ex-vivo ou in-vivo Quiméricos ~3% murinos Lima et al. (), In: Moraes, Augusto e Castilho, Tecnologia do Cultivo de Células Animais: de Biofármacos a Terapia Gênica. Cap. 19. Editora Roca, São Paulo. Fonte: Tamashiro e Augusto () Maranhão e Brígido (1) Murine Anticorpos monoclonal murinos antibody Humanizados ~5-1% murinos 1
2 /7/1 Terapias gênicas Diversos vetores e alvos Terapias celulares: diversas já estabelecidas para restabelecer a estrutura e função de tecidos Doenças cardíacas, queimaduras, transplantes autólogos de medula óssea Desafios Pureza Qualidade Consistência Reprodutibilidade Células-tronco pluripotentes Aplicações na pesquisa Aplicações industriais (descoberta e teste de novas drogas) Aplicações clínicas () Aplicações: Ensaios toxicológicos Descoberta de drogas Lima et al. (), In: Moraes, Augusto e Castilho, Tecnologia do Cultivo de Células Animais: de Biofármacos a Terapia Gênica. Cap. 19. Editora Roca, São Paulo. Fonte: Trends in Biotechnology Terapias celulares Características em comum Necessidade de ampliação de escala para fornecer o produto aos consumidores Obtenção através de um processo biotecnológico Cultivo Purificação 1 7 células Desafios células Manter as características das células inalteradas até escala final de produção Obter a qualidade do produto requerida e a produtividade do processo necessária ACTIVE INGREDIENT Formulação e envase PRODUTO FINAL O que é um biorreator? O que é um biorreator? Ampliação de escala Biorreatores Definição mais ampla: Sistema de cultivo destinado a manter as condições adequadas para cultura de células in vitro Engloba desde pequenos frascos até biorreatores de larga escala Definição mais usada na prática: O termo biorreator é usado para sistemas de cultivo com nível de sofisticação que permita controle de temperatura, ph e oxigênio dissolvido Vários tipos, com diferentes características Ambiente asséptico Suprimento de nutrientes Controle de temperatura Controle de ph Suprimento e remoção de gases para fornecimento de O e injeção/remoção de CO Controle de formação de espuma Células aderentes: suporte sólido para adesão celular
3 /7/1 Determinante para seleção: cultivo aderente x suspensão Biorreatores Sistemas multifásicos Fase sólida: células Fase líquida: meio de cultivo Fase gasosa: oxigenação, controle de ph h h Classificação Heterogêneos Sistemas de cultivo estacionários Linhagem CHO.K1 aderente Frascos T, placas de Petri ou multipoços Sistemas com múltiplas placas ou múltiplas bandejas Para células aderentes Ambiente heterogêneo: gradientes de concentrações de nutrientes, O e metabólitos Monitoramento de ph, po, etc. dificultado Cell Factory Cell Cube h A fase sólida não está distribuída uniformemente no meio líquido 7h Homogêneos A fase sólida está uniformemente distribuída no meio líquido Cultvo de células Vero em microcarregadores para produção de vírus da febre amarela Linhagem CHO.K1 em suspensão Garrafas rotatórias (roller bottles) Biorreatores de fibras ocas Biorreatores com superfícies semi-permeáveis Intensivas em manipulação Intensivas em mão-de-obra Risco de contaminação mais elevado Monitoramento dificultado Ambiente mais homogêneo Superfícies permeáveis a nutrientes/metabólitos e/ou a O/CO Em alguns casos, compartimentalização Em sua maioria descartáveis mini-perm CellMax i-mab, até 3 L Frascos agitados: tubos, spinners, erlenmeyers Para cultivos em suspensão ou em microcarregadores frascos spinner: Frascos agitados: tubos, spinners, erlenmeyers Ambiente homogêneo Escalas intermediárias possíveis Amostragem para monitoramento off line possível Monitoramento on line de algumas variáveis possível tubos agitados: frascos erlenmeyer: Sistemas homogêneos, amostragem possível Muito populares para operação em todas as escalas Monitoramento e controle possíveis (ph, po, T ) Operação automatizada, menores riscos de contaminação Sempre acompanhados de um sistema de controle 3
4 /7/1 Biorreatores com bolsas descartáveis: Wave Biorreatores com bolsas descartáveis: PBS Biotech Aço inoxidável AISI 31L (grau farmacêutico) Rugosidade baixíssima:,-, Ra (,-1µm) eletropolimento Biorreatores com bolsas descartáveis: Hyclone Hyclone SUB 5 L PBS15 Biorreator Wave, até 1 L PBS Modos de operação de biorreatores Alimentação Alimentação Leda: de células Batelada Batelada alimentada Batelada x Perfusão Redesenhar Batelada x Perfusão Perfundido Suspensão Alimentação ü Para uma dada escala de producão, diferentes volumes Equipamento de retenção celular requeridos Perfusão Contínuo simples 1 Xv (1^ cells/ml). Perfusão Perfusion 1 Fed-batch Batelada alimentada Contínuo Continuous 1 Batch Batelada Cultivos contínuos Estado estacionário: nutrientes e metabólitos permanecem em níveis contantes Mimetiza condições fisiológicas in vivo
5 /7/1 Xv (1^ cells/ml). Batelada x Perfusão Perfusion 1 1 Fed-batch 1 Experiência adquirida com outras células Cultivo de células rcho em meio livre de soro (Teutocell-) a 37 o C, 5% po e rpm (volume útil: 75 ml) VCD (1^/mL), glucose (g/l), lactate (g/l), ammonium (mm) 1 1 VCD Glucose Lactate Ammonium Viability Viability (%) Aminoacid concentration (µm) Experiência adquirida com outras células Cultivo de células rcho em meio livre de soro (Teutocell-) a 37 o C, 5% po e rpm (volume útil: 75 ml) ASP GLU ASN SER GLN HIS GLY THR ARG ALA TYR MET VAL TRP PHE ILE LEU Quantificação de variáveis associadas aos processos Quantificações relevantes (µ, integral of VCD, q glc, etc.) VCD (1^/mL), glc (g/l), product (arbitr. units/ml) 1 1 VCD Glucose Product µ=.79d -1 =.33h -1 t D =.7d q P =.7 µu/cell/d VCD (1^/mL) Cálculos análogos para outros qs 1 Product (arbitrary units/ml) y =,7x R² =,997 y =,31e,79x R² =, IVC (1^ cells.day/ml) Cultivo de células-tronco pluripotentes em sistemas agitados H9 USP-1 Trabalho conjunto do LaNCE/ICB/UFRJ e do LECC/COPPE/UFRJ 11 h Células murinas (USP-1) Cultura estática Cultivo agitado 13 h 1 µm 5 µm area (1 5 cells/cm ) area (1 5 cells/cm ) Cultura estática Cultivo agitado area volume (1 cells/ml) volume (1 cells/ml) per volume of medium Marinho et al. (1), Biotechnology Progress. Células murinas Mean area of colonies (1 3 µ m ) Before spinner culture 1 Marinho et al. (1), Biotechnology Progress. 5 µm Morfologia das colônias Before spinner culture After spinner culture 5 µm After spinner culture (replated) Células murinas Formação de corpos embrióides Antes 5 µm Após β-tubulin-iii (ectoderm) Mean EB diameter ( µ m) 1 1 Before spinner culture 1 After spinner culture Antes do cultivo em spinner Após o cultivo em spinner 1 µm Marinho et al. (1), Biotechnology Progress. Células murinas Avaliação de marcadores de pluripotência Marinho et al. (1), Biotechnology Progress. Before During After A C E SOX- 97.±3. B 95.±. 99.±1. D 9.1±.5 F 97.±5.5/ 9.5±.5 Oct- / SSEA-1 5
6 /7/1. stem cells in stirred vessels Cultivo estático Cultivo agitado area Capacidade de diferenciação: formação de corpos embrióides e avaliacão de AFP (endoderma), α-sma (mesoderma) e nestina (ectoderma) Avaliação de cariótipo.5medium per volume of.15. volume (1 cells/ml).5 Cell concentration per area area (1 cells/cm )..1 Avaliação de marcadores de pluripotência Scale-up of human embryonic volume (1 cells/ml) area (1 cells/cm ) Células humanas (H9) per volume of medium Fernandes et al. (9), Braz. J. Med. Biol. Res, v., p Fernandes et al. (9), Braz. J. Med. Biol. Res, v., p Fernandes et al. (9), Braz. J. Med. Biol. Res, v., p Concentração do inóculo em spinner Serra et al. (1) Nível de O dissolvido (biorreator) Serra et al. (1) Nível de O dissolvido (biorreator) Serra et al. (1) Perfusão (biorreator) SSEA- Serra et al. (1) TRA-1-
7 /7/1 Obrigada! Para quem quiser ler mais: capítulo 9 - biorreatores 7
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