Produção de Proteínas com Ação Terapêutica, com Foco em Cultura de Células Animais. Ricardo Medronho
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1 Produção de Proteínas com Ação Terapêutica, com Foco em Cultura de Células Animais Ricardo Medronho Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) Escola de Química Departamento de Engenharia Química 13/11/2008
2 Resumo da apresentação Uma visão global da área O processo de produção de biofármacos Os desafios de Engenharia Bioquímica Linhas de pesquisa em desenvolvimento no Laboratório de Engenharia de Cultivos Celulares-LECC e no Laboratório de Fluidodinâmica Computacional-Lab CFD, ambos da UFRJ Principais temas em estudo Exemplos de resultados obtidos
3 Produtos derivados do cultivo de células animais
4 Sistemas com células animais in vivo
5 Sistemas com células animais in vitro
6 Ano Células animais - Histórico Evento 1949 Crescimento de vírus em cultivo de células (Enders e col.) 1954 Vacina inativada Salk contra a poliomielite (cél. rim de macaco) 1955 Vacina atenuada Sabin contra a poliomielite (cél. rim de macaco) 1963 Vacina contra o sarampo (células de embrião de galinha) Vacinas contra raiva, caxumba e rubéola (cél. WI-38) 1975 Produção de anticorpos monoclonais (Köhler e Milstein) 1979 Primeira linhagem de célula recombinante 1980 Ampliação para escala de produção de L (vac. febre aftosa) 1981 Primeiro kit diagnóstico com anticorpo monoclonal fármaco oriundo da tecnologia do rdna (insulina; microrganismo) biofármaco produzido em células animais (CHO): t-pa recombin AM de uso terapêutico: OKT3 (rej. a transplante; produz. camund.) > 1990 Testes clínicos e aprovação de diversos produtos oriundos da tecnologia do DNA recombinante e tecnologia de hibridomas > 2000 Intensificação de estudos com células-tronco visando a terapias celulares
7 Por que células de mamíferos? Microrganismos Ausência de maquinaria metabólica capaz de realizar as complexas modificações pós-tradução Bactéria: incapazes de realizar a glicosilação Leveduras: padrão diferente de glicosilação Normalmente não são capazes de secretar a proteína de interesse Corpos de inclusão Processos de purificação mais complexos Usados para proteínas relativamente simples (por ex. insulina e hormônio do crescimento)
8 Por que células de mamíferos? Células animais (especialmente de mamíferos) Modificações pós-tradução adequadas Secretam as proteínas recombinantes para o meio de cultivo Linhagens celulares mais empregadas: Células de ovário de hamster chinês (CHO.K1, CHO dhfr - ) Células de rim de bebê de hamster (BHK-21) Células de hibridoma (mieloma + limfócitos-t) Células de mieloma de camundongo (NS0, Sp2/0)
9 Por que células de mamíferos? Proteínas terapêuticas são, em geral, proteínas complexas e com várias modificações pós-tradução Atividade biológica Estabilidade Imunogenicidade Por isso células de mamíferos Anticorpo C225 C 6466 H 9982 N 1726 O 2024 S 40 (fórmula da sequência de aminoácidos) (MM = )
10 Alguns exemplos de produtos comerciais Produto Indicação Célula Aprov. Humulin (insulina) diabetes E. coli 1982 Activase/Alteplase (t-pa) infarto CHO 1986 Benefix (fator IX) hemofilia B CHO 1997 Epogen (EPO) anemia CHO 1989 Avonex (β-interferon) esclerose múltipla CHO 1996 Herceptin/Trastuzumab (MAb) câncer de seio CHO 1998 Refacto (fator VIII) hemofilia A CHO 2000 ProstaScint (MAb, diagn. in vivo) câncer de próstata hibridoma 1996 Simulect/Basiliximab (MAb) rejeição de órgãos Sp2/ Campath (MAb) leucemia CHO 2001 Avastin/Bevacizumab (MAb) câncer coloretal CHO 2004 Xolair/Omalizumab (MAb) asma CHO 2003 Soliris/Eculizumab (MAb) hemoglobinuria (PNH) NS0 2007
11 O processo de produção Desenvolvimento da linhagem celular Cultivo celular em biorreatores Downstream processing (separação das células, purificação do produto) Formulação
12 Os desafios de Engenharia Bioquímica Desenvolvimento de linhagens altamente produtoras Estabelecimento de processos de cultivo de alta produtividade Desenvolvimento de processos de purificação de alto rendimento pg cel -1 dia -1
13 Os desafios de Engenharia Bioquímica Desenvolvimento de linhagens altamente produtoras Estabelecimento de processos de cultivo de alta produtividade Desenvolvimento de processos de purificação de alto rendimento
14 Os desafios de Engenharia Bioquímica Desenvolvimento de linhagens altamente produtoras Estabelecimento de processos de cultivo de alta produtividade Desenvolvimento de processos de purificação de alto rendimento
15 Biorreatores Células aderentes
16 Biorreatores Células adaptadas a crescimento em suspensão
17 Modos de operação
18 O objetivo final: um processo economicamente viável
19 Trabalhos de pesquisa em andamento Trabalhos de pesquisa em andamento no Lab CFD e no LECC
20 Principais linhas de pesquisa do LECC e Lab CFD da UFRJ Clonagem e expressão de proteínas Clonagem e expressão: proteínas terapêuticas, enzimas envolvidas no processamento pós-tradução, proteínas anti-apoptóticas Construção de um sistema de vetores para integração sítio-dirigida, para acelerar a geração de linhagens recombinantes Desenvolvimento de processos de cultivo celular Desenvolvimento de um meio livre de soro para células CHO Desenvolvimento de equipamentos para retenção de células em processos em perfusão (hidrociclone, filtro de disco rotativo, módulo de fibras ocas) Estudo da produção de vírus em células Vero Cultivo de células-tronco embrionárias murinas e humanas em sistemas agitados utilizando microcarregadores Desenvolvimento de processos de purificação dos produtos Uso de cromatografia com membranas e processos integrados
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