10. MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
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- Joaquim Gonçalo Teixeira Gusmão
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1 10. MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS 10.1 Teoria geral da cromatografia Introdução Separação eficiente de compostos quimicamente similares Extração líquido-líquido Cromatografia Separação baseada na partição do soluto entre duas fases líquidas imiscíveis = sistema estático = Separação baseada nas interações do soluto com a fase móvel e a fase estacionária = sistema dinâmico = Separação cromatográfica (múltiplos equilíbrios de distribuição) eluente amostra A+B fase estacionária A+B A B A B A B A eluato A separação baseia-se nas diferenças entre as forças de interação que os solutos A e B estabelecem com a fase estacionária e com a fase móvel 1
2 Algumas definições Fase móvel pode ser um líquido, um gás ou um fluído supercrítico (move-se através da fase estacionária) Fase estacionária pode ser um líquido, um sólido ou um gel. Se for um líquido tem que se encontrar a recobrir a superfície de um suporte sólido. Eluente fluído que passa através da fase estacionária ( fase móvel) Eluato - fluído que sai após atravessar a fase estacionária Eluição passagem do eluente pela coluna Evolução histórica Origem do nome cromatografia cromato cor (do grego khrômatos) grafia escrita (do grego graphé) 1906 Mikhail Tswett - 1º trabalho publicado descrevendo uma separação cromatográfica Experiências de separação dos componentes de extractos de folhas de plantas (clorofilas e xantofilas) e da gema do ovo, numa coluna de vidro recheada de CaCO 3 finamente dividido (fase estacionária) e eluição com éter de petróleo (fase móvel) 1931 Kuhn & Lederer - redescoberta da importância da cromatografia em coluna 1941 Martin & Synge - modelo dos pratos teóricos Desenvolvimento dos conceitos teóricos de altura equivalente de prato teórico (eficiência de separação). Lançamento das bases fundamentais da cromatografia gasosa e da cromatografia líquida de alta eficiência. = RECEBERAM O PRÉMIO NOBEL EM 1952 = 2
3 1956 J. J. van Deemter Desenvolvimento do denominado modelo cinético que permite descrever a separação cromatográfica como um processo dinâmico. Classificação dos vários tipos de separação cromatográfica CLASSIFICAÇÃO COM BASE NA TÉCNICA Cromatografia em coluna Cromatografia planar CLASSIFICAÇÃO COM BASE NO MÉTODO DE DESENVOLVIMENTO DO CROMATOGRAMA CROMATOGRAFIA ANALÍTICA A amostra é aplicada à coluna ou placa de forma descontínua, o cromatograma desenvolve-se através da passagem contínua da fase móvel ELUIÇÃO CROMATOGRAFIA PREPARATIVA ELUIÇÃO DESLOCAMENTO DESENVOLVIMENTO FRONTAL Aplicação contínua da fase móvel após a colocação de uma quantidade finita de amostra (cromatografia analítica) Colocação de uma quantidade finita de amostra. A fase móvel contém um composto que é mais retido que os componentes da amostra e promove a sua remoção (ex. desionização da água) Aplicação contínua da amostra. A fase móvel é a amostra. O componente menos retido é o único a ser eluído puro (ex. remoção de compostos orgânicos pelo carvão ativado) 3
4 CLASSIFICAÇÃO COM BASE NO MODO DE SEPARAÇÃO Natureza da fase móvel cromatografia gasosa cromatografia líquida Natureza da fase estacionária líquida sólida fase ligada líquida fase ligada sólida Mecanismo de separação partição adsorção partição partição partição adsorção permuta iónica (resinas sintéticas) exclusão afinidade (bioafinidade) Técnica coluna coluna coluna capilar coluna planar coluna planar coluna planar coluna coluna coluna Nome do método cromatográfico cromatografia gás líquido cromatografia gás sólido cromatografia gasosa cromatografia líquido líquido clássica cromatografia de camada fina cromatografia líquida alta eficiência cromatografia de camada fina de alta eficiência cromatografia líquido sólido clássica cromatografia de camada fina cromatografia de permuta iónica Cromatografia de exclusão ou de permeação de gel cromatografia de afinidade 4
5 Cromatografia planar - aplicações, essencialmente, qualitativas e semiquantitativas Linha de chegada da fase móvel d M sinal do detector dra drb Relações fundamentais em cromatografia A A + B B Partida Profundidade da fase móvel Sendo: dr distância percorrida pelo soluto (A, B) d M distância percorrida pela frente do solvente Cromatografia em coluna - aplicações qualitativas e quantitativas t R1 t R2 t M injecção linha de base tempo 5
6 Se a velocidade do fluxo da fase móvel for constante tempo volume t M tempo morto tempo que todos os solutos passam na fase móvel. (Pode ser estimado através do tempo que um soluto não retido demora a percorrer desde a injeção até ao detector) t R1, t R2 tempo de retenção para os solutos 1 e 2 PARÂMETROS CARACTERIZADORES DA RETENÇÃO Em cromatografia em coluna Corresponde ao tempo que o soluto tempo de retenção ajustado t R passa na fase estacionária t R = t R - t M Factor de selectividade (ou de separação) (entre picos adjacentes) = t R2 t R1 sendo que t R2 > t R1 quanto maior maior a separação entre os picos 1 e 2 é praticamente independente da velocidade de fluxo da fase móvel. Pode ser utilizado para caracterizar e identificar os picos factor de retenção k (parâmetro de retenção mais usado em CLAE) k = t R - t M t M quanto maior k maior a retenção parâmetro utilizado para identificar os picos nos cromatogramas os valores devem, nos casos óptimos, variar entre 1 e 5 A evolução ao longo do tempo da capacidade de separação de uma coluna pode ser avaliada medindo: fator de retenção para a separação de uma substância padrão; número de pratos teóricos (eficiência da coluna); assimetria do pico. Alterações acentuadas nestes parâmetros experimentais relativamente aos valores que a coluna apresenta quando nova indicam que a coluna cromatográfica se encontra degradada. (os fabricantes juntam às colunas novas cromatogramas de teste) 6
7 Exemplo de cromatograma de teste de uma coluna de HPLC 7
8 A definição de fator de retenção corresponde a: t R - t M k = = t M tempo passado na fase estacionária tempo passado na fase móvel = Cs Vs CM VM nº moles de soluto na fase estacionária nº moles de soluto na fase móvel Sendo: Cs - concentração de soluto na fase estacionária Vs - volume de fase estacionária CM - concentração de soluto na fase móvel VM - volume de fase móvel Se admitirmos que no sistema cromatográfico a distribuição do soluto pelas duas fases se encontra sempre em equilíbrio, então o quociente Cs CM corresponde à constante de distribuição KD, entre as duas fases Ficará, então: resultando k = KD Vs VM VR = VM + KD.Vs como V t então t R v R e t M v M Relação fundamental da cromatografia. Relaciona os parâmetros de retenção com a constante de distribuição termodinâmica KD para o soluto, entre a fase estacionária e a fase móvel V R depende de K D (não depende da quantidade de soluto a separar) Limitações A equação não contempla os fatores responsáveis pelo alargamento dos picos Muitas vezes é muito difícil saber com rigor o Vs (volume da fase estacionária) 8
9 Na cromatografia planar Distância percorrida pelo soluto Rf = = Distância percorrida pela frente do solvente dr1 dm Na cromatografia planar é, muitas vezes, difícil de obter reprodutibilidade nos valores de Rf, pelo que é comum corrigir esses valores a partir da migração de uma substância padrão Distância percorrida pelo soluto Rpadrão = Distância percorrida pelo padrão = dr1 dpad Eficiência da coluna. Eficiência da separação. Modelo dos pratos teóricos e modelo cinético A eficiência de uma separação cromatográfica está diretamente relacionada com a dispersão (alargamento dos picos) observada nos cromatogramas. Existem dois modelos teóricos que tentam explicar o alargamento dos picos cromatográficos: Modelo dos pratos teóricos proposto por Martin e Synge em Baseado (modelo clássico) na analogia com o processo de destilação fracionada ou com a extração líquido líquido em contracorrente (considera-se existir uma sucessão de estados discretos de equilíbrio na coluna) Modelo cinético proposto do J. J. van Deemter em Ao contrário do anterior considera a separação cromatográfica como um processo dinâmico em que a difusão dos solutos resulta de vários processos dinâmicos (neste modelo a cinética dos processos envolvidos na separação é crucial) 9
10 MODELO DOS PRATOS TEÓRICOS (modelo clássico) Considera-se neste modelo que a coluna cromatográfica se encontra dividida em N segmentos independentes, representando cada um estádio de equilíbrio ou prato teórico Considera-se que se atinge um estado de equilíbrio entre a fase estacionária e a fase móvel em cada prato teórico Na cromatografia planar o número de pratos teóricos é estimado pela expressão: N = 16 dr 2 w 2 sendo w largura longitudinal da mancha Na cromatografia em coluna o número de pratos teóricos é estimado por: tr 2 N = 16 = 5,545 w b 2 tr 2 w 1/2 2 Considerando que o pico cromatográfico corresponde a um pico Gaussiano O nº de pratos teóricos é muito simples de calcular: basta conhecer o tempo de retenção do pico e a largura do pico a meia altura ou na base. Ambos os valores podem ser obtidos a partir dos cromatogramas registados Fatores que podem influenciar o número de pratos teóricos Fase estacionária Condições de desenvolvimento do cromatograma Volume de amostra Tipo de soluto Comprimento da coluna A comparação de eficiência entre colunas deve ter em consideração o comprimento da coluna; deste modo a comparação deve ser feita em função da altura equivalente do prato teórico, H ou HEPT (e não de N) H = L N sendo L comprimento da coluna N número de pratos teóricos 10
11 - De acordo com o modelo dos pratos teóricos o valor de H (altura equivalente do prato teórico) deveria ser uma característica da coluna (fase estacionária), independente do tipo de soluto; contudo, devido às limitações do modelo a comparação da eficiência das colunas deve ser feita usando a mesma substância, o que permite ultrapassar a possibilidade de ocorrerem interações específicas dos solutos com a fase estacionária Alturas de prato teórico típicas: entre 0,1 a 1 mm cromatografia gasosa (coluna capilar) cerca de 10 m cromatografia líquida (hplc) Como calcular a largura de um pico na base? Considerando tratar-se de um pico gaussiano pontos de inflexão 2 w 1/2 = 2,35 (largura do pico a meia altura) h ½ h w = 4 (largura do pico na base admitindo as tangentes pontos de inflexão) Os solutos tendem a dispersar-se ao longo do processo cromatográfico. Como resultado os picos surgem com forma gaussiana e desvio padrão característico. A dispersão pode ser avaliada medindo: (1) w 1/2 largura do pico a meia altura; (2) w largura do pico na base, a partir das tangentes aos pontos de inflexão. 11
12 EXEMPLO Determine k, N e H para a separação do tolueno por cromatografia gasosa Soluto t R, min w, min ar 1,5 benzeno 7,45 2,10 tolueno 10,6 2,90 comprimento da coluna = 10 m caudal da fase móvel = 30 ml/min temp. constante Cálculo de k k = tr tm tm 10,6 1,50 = = 6,07 1,50 Cálculo de N tr 2 N = 16 w = 16 10,6 2 = 213,8 2 b 2,90 2 Cálculo de H L N = = N ,8 12
13 Na estimativa da eficiência da coluna a partir do modelo de pratos teóricos admite-se que: Na coluna têm lugar uma sucessão de estádios de equilíbrio pratos teóricos (como na destilação fracionada ou na extração contracorrente) Que o equilíbrio na distribuição do soluto entre a fase móvel e a fase estacionária é atingido em cada prato. Fatores experimentais como: propriedades das fases (móvel e estacionária) difusão dos solutos cinética do processo de distribuição (transferência de massa) velocidade da fase móvel espessura das fases tamanho das partículas da fase estacionária porosidade da fase estacionária NÃO SÃO CONSIDERADOS NO PROCESSO DE ALARGAMENTO DOS PICOS NO MODELO DOS PRATOS TEÓRICOS O MODELO É INCOMPLETO van Deemter desenvolveu uma relação (celebrizada pelo nome de equação de van Deemter) em que sistematiza a influência de parâmetros dinâmicos (cinéticos) do processo de separação na eficiência dessa separação. É o denominado MODELO CINÉTICO 13
14 MODELO CINÉTICO EQUAÇÃO DE VAN DEEMTER 2 DM 8 k H = 2 dd + + d2 f (1 + k) 2 DS 2 Termo relacionado com o empacotamento A Termo relacionado com a fase móvel gasosa B Termo relacionado com a fase estacionária líquida C Em que: H altura equivalente do prato teórico fator característico do empacotamento dd diâmetro das partículas da fase estacionária fator relativo à obstrução à difusão do soluto pelas partículas da fase estacionária (relacionado com a irregularidade do empacotamento) DM coeficiente de difusão do soluto na fase móvel (gasosa) velocidade linear da fase móvel (gás arrastador) k fator de capacidade d f espessura do filme de fase líquida no suporte de fase estacionária DS coeficiente de difusão do soluto na fase estacionária Esta equação foi derivada por van Deemter para a cromatografia gás líquido, com coluna de empacotamento. A sua utilização para outros tipos de cromatografia implica reajustes nos termos considerados. Por exemplo, na cromatografia gasosa em coluna capilar não existe empacotamento, o que implica que o termo A é desprezável. 14
15 EQUAÇÃO DE VAN DEEMTER simplificada H = A + B + C As letras A, B e C correspondem a termos que se referem a: A difusão turbilhonar B difusão molecular C resistência à transferência de massa H B Representação típica da equação de van Deemter para uma coluna de cromatografia gás líquido com empacotamento C A 15
16 Termos da equação de van Deemter A difusão turbilhonar depende do tamanho das partículas e da geometria das partículas não depende da velocidade da fase móvel Ao atravessar a coluna, o soluto pode percorrer diferentes caminhos soluto mais rápido soluto mais lento Minimização: - partículas com formas regulares e de pequena dimensão - empacotamento bem compactado, sem caminhos preferenciais B difusão molecular difusão do soluto na fase móvel A difusão no sentido contrário ao do movimento da fase móvel tem mais influência que a difusão no sentido do movimento da fase móvel Arrastamento do pico Este termo depende da velocidade do fluxo, diminuindo acentuadamente com com o aumento da velocidade da fase móvel (menor tempo para a difusão ter lugar) 16
17 C resistência à transferência de massa Refere-se ao tempo necessário para se atingir o equilíbrio para a distribuição dos solutos pela fase móvel e pela fase estacionária Minimização: - utilizar filmes de fase estacionária a recobrir as partículas sólidas inertes de pequena espessura - fases estacionárias pouco viscosas - velocidade de fluxo da fase móvel lenta Os termos B e C são afetados de forma oposta pela velocidade da fase móvel Necessidade de optimização da velocidade do fluxo H B óptimo C A Como o efeito do termo B, sobre o parâmetro H, é maior que o efeito do termo C, é, em geral, preferível usar um caudal ligeiramente superior ao ótimo, para se trabalhar numa zona controlada pelo parâmetro C, de modo a que, pequenas variações das condições experimentais não afetem significativamente as condições de separação 17
18 EXEMPLOS DE CONSEQUÊNCIAS DO MODELO CINÉTICO NA EVOLUÇÃO DA CROMATOGRAFIA Cromatografia gasosa Colunas de empacotamento: Contendo um sólido finamente dividido que é recoberto por uma fina camada (0,05 a 1 m) de fase estacionária Tipicamente 1 a 6 m de comprimento Colunas capilares (tubulares abertas): não contêm empacotamento. A fase estacionária encontra-se suportada na superfície interna do tubo que constitui a coluna. Tipicamente 10 a 100 m de comprimento H Colunas capilares não existe empacotamento e a espessura da fase estacionária é pequena termos A e C pouco influentes MELHOR RESOLUÇÃO H Cromatografia líquida termos B e C pouco influentes Os líquidos têm coeficientes de difusão muito menores que os gases (entre 1000 a vezes menores) UM EMPACOTAMENTO BEM ORDENADO É CRUCIAL partículas irregulares Partículas esféricas regulares Evolução da técnica 18
19 Resolução e seletividade O objetivo da cromatografia é conseguir a separação de duas ou mais espécies de misturas homogéneas Como se pode prever se dois solutos são ou não separarados? A seletividade da separação pode ser estimada a partir da: t R2 Fator de seletividade, 2,1 = = t R1 (ou factor de separação) k 2 k 1 Permite avaliar a separação entre os centros das bandas (picos). Não permite, contudo, concluir acerca da distinção entre os picos, pois tal distinção é função da largura dos picos (eficiência de separação) EXEMPLO Distinção de picos Igual valor de Picos sobrepostos 19
20 sinal do detector A separação dos picos deve ser avaliada através do parâmetro de retenção mas, também, através de um parâmetro relacionado com o alargamento dos picos (ou seja, o parâmetro relativo à eficiência da separação) Resolução, Rs 2 (tr2 tr1) Rs = tr (considerando w1 w2) w1 + w2 w t r2 w largura de pico na base, considerando tratar-se de um pico gaussiano t r1 injecção w1 tempo w2 Atendendo à definição de número de pratos teóricos, a relação que define a resolução pode ser reescrita em função de parâmetros de retenção, seletividade e eficiência. seletividade retenção eficiência Rs = 2 (tr2 tr1) w1 + w2 Rs = k 1 + k N 1/2 k1 + k2 sendo k = e = 2 k2 k1 Da relação acima pode-se concluir que: resolução N Aumentar a coluna para o dobro aumenta a resolução 2 20
21 EXEMPLO Soluto t R, min w, min ar 1,5 benzeno 7,45 2,10 tolueno 10,6 2,90 Cálculo da resolução entre o pico do ar e do tolueno (assumindo uma largura de pico na base média de 2,0 min) Rs = t w 10,6 1,50 = = 4,55 2,0 entre o pico do benzeno e do tolueno Rs = ttolueno tbenzeno wtolueno - wbenzeno 2 = 10,6 7,45 = 1,26 2,10 + 2,90 2 separação quantitativa Que valor de Rs corresponde a separação satisfatória de picos? Em geral Um valor de Rs = 1 corresponde a uma separação de picos da ordem de 94% Um valor de Rs = 1,5 corresponde, em geral, a uma distinção completa dos picos (em análise quantitativa é necessário obter tal desiderato) 21
22 EXEMPLOS DE VALORES DE Rs E SEPARAÇÃO DE PICOS CROMATOGRÁFICOS 22
23 Na cromatografia planar a resolução é obtida atendendo à separação entre o centro das manchas e a largura longitudinal das manchas Rs (planar) = 2 (dr2 dr1) w1 + w2 (em que w representa a largura longitudinal das manchas) Rf2 A retenção relativa,, será dada por: 2,1 = = Rf1 dr2 dr1 EXEMPLO Classifique os cromatogramas seguintes quanto à eficiência e à resolução da separação a) boa resolução má eficiência b) má resolução má eficiência e seletividade c) boa resolução boa eficiência e seletividade 23
24 Análise qualitativa e quantitativa por cromatografia ANÁLISE QUALITATIVA CROMATOGRAFIA técnica de separação de misturas e não de identificação de compostos Os parâmetros de retenção são característicos dos compostos (se estiverem garantidas condições de repetibilidade nas condições cromatográficas) A caracterização dos compostos pode ser feita com base nos parâmetros de retenção Comparação entre a retenção de um padrão e a espécie desconhecida Na cromatografia líquida é possível testar o efeito da natureza da fase móvel sobre a separação, no sentido de reforçar a identificação dos compostos com base na retenção em diferentes condições de fase móvel. Na cromatografia gasosa o gás arrastador deve ser inerte e portanto, essas alterações não são possíveis Na cromatografia gasosa a identificação de compostos desconhecidos exige o recurso a detetorescom capacidade de análise estrutural. Ex: FT-IR; MS; UV-Vis, DAD; etc. 24
25 amostra amostra EXEMPLO Identificação de compostos em cromatografia planar COND. DESENVOLVIMENTO A COND. DESENVOLVIMENTO B C B A Compostos puros Compostos puros ANÁLISE QUANTITATIVA DETETOR CROMATOGRÁFICO sinal analítico REGISTADOR INTEGRADOR COMPUTADOR resposta, em geral, proporcional à concentração do soluto quantificação, em geral, baseada no uso de soluções padrão 25
26 Que informação quantitativa se retira dos cromatogramas? Em geral: área quant. soluto se volume da amostra for constante área concentração É então necessário medir a área dos picos cromatográficos. Como? Em geral recorre-se a processos automáticos baseados no uso de integradores ou computadores Aspectos importantes: Inj. definir o início do desenvolvimento do cromatograma definir os máximos dos picos, t ret definir os pontos de início e fim dos picos definir a linha de base MÉTODOS DE QUANTIFICAÇÃO Adição de padrão Padrão interno Curva de calibração Fator de resposta do detetor métodos internos à amostra métodos externos à amostra 26
27 Curva de calibração As soluções padrão devem ter concentração rigorosamente conhecida dos solutos a quantificar (pode-se, em certos casos utilizar soluções padrão contendo misturas de solutos - padrões mistos) A gama de concentração dos solutos nos padrões deve compreender a concentração dos solutos nas amostras a analisar A matriz das soluções padrão deve ser o mais parecida possível com a da amostra As condições de análise dos padrões devem ser similares às da amostra O volume de amostra injectado deve ser repetível (só assim é válida a relação: área do pico concentração) Padrão interno Consiste em adicionar, à amostra e às soluções padrão, uma substância que originalmente não deve existir na amostra, que se denomina padrão interno O padrão interno deve estar presente na mesma quantidade em todas as soluções injetadas Deve ser estável e ter elevada pureza, não interferir com a análise, ter tempo de eluição e ter resposta no detecor similar aos outros componentes da amostra, no entanto deve ter um pico distinto dos outros componentes no cromatograma; não deve estar presente na amostra original Este método permite corrigir a variabilidade experimental devidas, por exemplo: variações do volume injetado; variações na resposta do detetor, alterações nas condições cromatográficas, etc Assume-se que as variações na área do pico do padrão interno refletem as variações nas áreas dos picos dos restantes componentes como resultado da variabilidade experimental 27
28 EXEMPLO: As alterações experimentais podem ser corrigidas da seguinte forma, recorrendo ao padrão interno: (1) Processo sem padrão interno 1º ensaio A amostra = K 1 c amostra 2º ensaio A padrão = K 2 c padrão Sendo: K 1 = K 2 (assume-se que as condições experimentais se mantêm entre ensaios) A amostra, A padrão, c padrão - valores conhecidos c amostrav - valor a determinar Fazendo a razão entre as expressões para ensaio 1 e 2 : c amostra = A amostra x c padrão A padrão (2) Processo com padrão interno 1º ensaio 2º ensaio A amostra = K 1 c amostra A pi = K 1 c pi A padrão = K 2 c padrão A pi = K 2 c pi Sendo: K 1 K 2 e K 1 K 2 (as condições experimentais podem variar entre ensaios) Assumindo que: K 1 A pi, A amostra, A padrão, c padrão - valores conhecidos c amostra - valor a determinar = K 1 K 2 K 2 Fazendo a razão entre as expressões para ensaio 1 e 2 : c amostra = A amostra x A pi2 A padrão x A pi1 x c padrão 28
29 EXEMPLO Uma série de quatro soluções padrão foram preparadas por forma a conterem diferentes concentrações do composto A e concentração constante do padrão interno PI. Procedeu-se à análise dessas soluções por cromatografia gasosa, tendo-se obtido os cromatogramas 1, 2, 3 e 4. Preparou-se a amostra com concentração de A desconhecida, por forma a conter a mesma concentração de PI que os padrões. Da análise dessa solução resultou o cromatograma 5. Dos cromatogramas foram extraídos os dados da tabela abaixo. cromatograma A, M PI, M área A área PI área A área PI 1 5,6 23,4 13,1 31,6 0, ,3 23,4 35,0 45,8 0, ,2 23,4 23,1 20,5 1, ,1 23,4 43,8 29,4 1,49 5?? 23,4 36,1 30, Calcule A na amostra. 29
30 área A / área PI área A Resolução: (1) Sem atender ao padrão interno Representação de área A = f ( A ) A, um Esta representação só é aceitável se se pudesse garantir que as condições cromatográficas eram repetíveis, em particular o volume injectado Área A é proporcional à quantidade de A e não à concentração de A (só se volume injetado for constante) (2) Atendendo ao padrão interno Representação de área A = f ( A ) área PI 2 1,5 y = 0,0743x - 0,001 y = 0,0743 x - 0,001 como y = 1,17 1 0, então 1,17 = 0,0743x 0,001 x = 15,8 M A, um 30
1.Com relação à cromatografia a gás, cite três grupos de compostos orgânicos que podem ser analisados por esta técnica.
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