Superovulação e transferência de embriões em caprinos

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1 Superovulação e transferência de embriões em caprinos Prof. Adelmo Ferreira de Santana Caprinocultura e Ovinocultura 1. INTRODUÇÃO afs@ufba.br Departamento de Produção Animal Escola de Medicina Veterinária Universidade Federal da Bahia CEP Salvador Bahia A transferência de embriões é uma técnica inovadora que consiste em aumentar a produção embrionária, através do aumento do número de óvulos liberados, após a administração de hormônios, em uma fêmea geneticamente superior, dentro de um período sexual, e transferir essas estruturas para o trato reprodutivo de fêmeas de baixo valor zootécnico, para completarem a gestação (OLIVEIRA & GONZALES, 1992). Nas espécies domésticas a principal finalidade de utilização da técnica de transplante embrionário é de aumentar a multiplicação da descendência de fêmeas dentro de suas possibilidades naturais, e na espécie caprina essa técnica começou a se desenvolver na França, em 1984 sob o impulso do INRA ( CASAMITJANA & PERRIN, 1989). Para a implantação da técnica de transferência de embriões é necessário seguir um plano de trabalho, partindo da seleção de doadoras e receptoras, superovulação, sincronização do ciclo estral entre doadoras e receptoras, colheita de embriões, avaliação e transferência dos mesmos( VALLE et al, 1988). A aplicação da técnica nos pequenos ruminantes necessita de adaptações, que devem ser levadas em conta, pelas suas particularidades antômicas e fisiológicas, bem como, a avaliação e controle dos embriões transferidos, visando reduzir os riscos de transmissão de doenças (QUIRIN, 1989). Entretanto, o sucesso da transferência de embriões depende de vários fatores relacionados com o trinômio doadora/ embrião/receptora. A fertilidade depende tanto da qualidade do embrião coletado como da condição da receptora para a qual o embrião é transferido(thibier & NIBART, 1992), logo,

2 a receptora contribui com 50% para o sucesso de um programa de transferência de embriões, e o tratamento hormonal contribui para uma adequada preparação fisiológica desta fêmea, objetivando a formação de corpos lúteos de boa qualidade que possam garantir níveis elevados de progesterona circulante, pois, segundo ARMSTRONG et al (1983b) isto pode ser um fator fundamental para assegurar a sobrevivência embrionária. Em contra partida, vários fatores extrínsecos como: temperaturas elevadas, mudanças podem influenciar na fertilidade da fêmea (THIBIER & NIBART, 1992). 2. PROCEDIMENTOS A transplantação embrionária sudivide-se em quatro fases distintas que se sucedem cronologicamente. È necessário um perfeito controle de cada uma delas, para se obter uma taxa de coleta, transferência e sobrevivência dos embriões, aumentando a percentagem de produtos nascidos. 2.1 Produção de embriões A produção de embriões de boa qualidade, é o principal fator limitante da técnica. Está fase subdivide-se em seis operações sucessivas Escolha das doadoras As doadoras escolhidas para serem incluidas em um programa de transferência de embriões, devem apresentar fertilidade comprovada, serem pluríparas, idade entre 24 e 72 meses, progênie que tenha produção compatível com uma média de destaque em nossas condições e fenótipo que se enquadra nos padrões de qualidade leiteira(valle et al, 1988). Na reprodução controlada com a transferência de embrião, é de fundamental importância Ter um rigoroso esquema de seleção dos animais a serem utilizados, pois, problemas de ordem nutricional ou sanitário podem prejudicar o sucesso do trabalho, e estas fêmeas devem exteriorizar sinais de estros regulares, em média a cada 21 dias, livres de doenças do sistema reprodutor e boa aptidão leiteira (OLIVEIRA &GONZALES,1992). A qualidade da genética é fator determinante na escolha das doadoras, aliada ao estado fisiológico e sanitário que são de fundamental importância. Além disso, outros critérios devem ser considerados: como a idade, histórico reprodutivo sem problemas, devem apresentar-se em perfeito estado sanitário ao exame clínico e ginecológico que deve ser feito três meses antes do início do tratamento hormonal, respeitando um intervalo de no mínimo, cinco meses entre a última parição e o início do tratamento(vallet et al, 1991).

3 De acordo com BARIL et al (1989), somente fêmeas primíparas e/ou pluríparas devem ser utilizadas como doadores Sincronização do cio Um dos métodos de sincronização mais usado no Brasil é o de esquema curto, com 10 dias, usando-se esponjas vaginais empregnadas com progestágenos e aplicação de outros hormônios por via intramuscular. A retirada das esponjas ocorre no décimo dia e com aparecimento do estro em torno de 24 a 36 horas (OLIVEIRA & GONZALES, 1992). BARIL et al (1988), sincrocronizaram o estro de cabras com administração de 100 M g de cloprostenol (PGF 2 ), no nono dia do tratamento progestágeno com duração de 11 dias, usando esponjas vaginais empregnadas com 45 mg de FGA. GONZALEZ et al (1991) consideram a sincronização do estro uma prática auxiliar da inseminação artificial, que objetiva, essencialmente, obter ovulações síncronas em animais a serem inseminadas. Entretanto, a sincronização de estro e da ovulação, no Brasil, em especial no Nordeste, ainda tem seu uso limitado pelo elevado custo e pela pequena disponibilidade, no mercado nacional, de hormônios ou substâncias correlatas comprovada atividade gonadotrófica. Diversos tratamentos progestativos diferem entre si, pelos agentes progestágenos e a via de administração: esponjas vaginais, implantes ou injeções. As esponjas vaginais são utilizadas impregnadas com Acetato de Fluorogestona (FGA 45 mg) (ARMSTRONG & EVANS, 1983; BARIL & VALLET, 1990; VALLET et al, 1989; BARIL et al 1990 a), ou impregnadas com Acetato de Medroxiprogesterona (MAP 60 mg) (KIESSLING et al, 1986; ARMSTRONG et al, 1983 a ). As injeções intramusculares de progestágeno são realizadas, diariamente, por 17 a 22 dias na dose de 12mg / fêmea (MOORE & EPPLESTON, 1979; TERVIT et al, 1984; HERBURN, 1987). Dentre os diversos tratamentos, o mais utilizado, no momento, são as esponjas vaginais impregnadas com 45mg de FGA.Na espécie caprina, as esponjas permanecem por 11 dias (tratamento curto) e uma injeção intramuscular de 50 a 100 M g de cloprostenol (prostaglandina sintética) é efetuada no início da estimulação ovariana BARIL et al, 1990 a; BARIL & VALLET, 1990).

4 2.1.3 Superovulação A superovulação é definida como sendo a superestimulação ovariana, através de gonadotrofinas exógenas, permitindo a obtenção de um número de óvulos superior àquele que é normalmente produzindo em cada ciclo reprodutivo (PINEDA, 1989). Em cabra, a melhor resposta superovulatória, tem sido o FSH (Hormônio Folículo Estimulante) de origem suina ou ovina. O FSH apresenta meia curta (2 a 5 horas) e, por esse motivo a sua administração é feita de 12 em 12 horas, durante 3 a 4 dias em doses decrescentes, variando entre 12 a 18 mg nos pequenos ruminantes (AKBAR et al, 1974). Outro hormônio que vem sendo usado com resultados favoráveis como agente superovulvante em cabras, é a Gonadotrofina da Menopausa Humana (HMG), extraída da vagina da mulher em menopausa. A dose usada para a superovulação nos pequenos ruminantes, é de U.I., também administrado em doses decrescentes. Os primeiros resultados do uso do HMG como agente superovulante na Estação Experimental de Pendência (EMEPA- PB), mostraram melhores taxas com relação ao número de corpos lúteos do que o FSH nacional (OLIVEIRA et al, 1990). A superovulação realizada com o uso de FSH-P nas doses de 16 a 24 mg administradas de forma decrescente de 12 em 12 horas, a partir do oitavo ou nono dia do tratamento progestágeno, obtendo uma média de 9,5 ±7,4 ovulações. O tratamento de 4 dias de duração e de 20 mg de FSH-P é melhor que, o tratamento de 3 dias e 16 mg de FSH-P, dando uma média de 8,6 embriões viáveis (BARIL et al, 1988). A análise de resultados obtidos pela superovulação em função da variação de relação FSH/LH indica que o número de embriões transferíveis obtidos é significativamente superior quando a relação decresce, da que quando permanece constante ( COGNIÉ et al, 1986; BARIL et al, 1988). NUTI et al (1986) e BARIL et al (1988), constataram dentro de muitas raças de caprinos uma diminuição da resposta aos tratamentos de superovulação em função da repetição das mesmas. Vários trabalhos utilizando como hormônio o PMSG, foram realizados por ARMSTRONG et al (1983), onde foi estudado os efeitos do PMSG e FSH-P, sobre a superovulação dentro da espécie caprina e confirmando a superioridade do FSH-P, principalmente no que concerne o número de ovulações e produtos nascidos após a transferência de embriões (ARMSTRONG et al, 1983).

5 BARRY et al (1988) estudaram os efeitos de diferentes tratamentos superovulatórios utilizando PMSG (Gonadotrofina de Soro de Ègua Prenhe ou FSH-P, seguindo de GnRH ( Hormônio Liberador de Gonadotrofina) ou HCG (Gonadotrofina Coriônica Humana) e obtiveram resultados inferiores para o PMSG. A literatura relata uma variação da atividade em função de uma parte da origem do hormônio e de outra parte do hormônio utilizado (QUIRIN, 1989). O extrato hipofisário suino usado na maioria dos casos é o produto comercial FSH Burns Biotec (Omaha, USA) mas, alguns pesquisadores utilizam a preparação de Combarnous Y:C.Y INRA Nouzilly. As duas preparações parecem ter um efeito significativamente diferente quanto à média das ovulações observadas, com vantagem para a segunda (TORRES et al, 1984). BARIL et al (1988) utilizaram dois tipos diferentes de FSH-P (Burns Biotec, Shering ou Sanofi), e não notaram nenhuma diferença quanto à origem do hormônio empregado. Os mesmos autores descreveram, em compensação, a presença de folículos anavulatórios de tamanho superior ao normal em 20% dos casos, acompanhado de uma diminuição do número de ovulações em consequência da superovulação realizada com ajuda do FSH-P. A mesma observação foi feita em relação com o PMSG por ARMSTRONG et al (1983) que notaram por outro lado vários problemas de regressão luteal consecutivas ao tratamento superovulatório com PMSG. Esses fenômenos foram relatados depois pôr CHEMINEAU et al 1986; MOORE, 1987& TERVIT et al, KIESSLING et al (1986), usaram esponjas vaginais para sincronização do estro em dezoito cabras por um período de 16 a 18 dias. A superovulação em 6 cabras foi feita com PMSG e em 12 fêmeas com FSH. Após o estro as fêmeas foram mantidas juntas com reprodutores, sendo colhidos os embriões no quarto dia após o estro, obtendo embriões de 4 a 12 células, com média de 17± 2 para o FSH e 2 ± 2 para o PMSG. De 3 doadoras superovuladas com FSH, 36 embriões foram transferidos para 14 receptoras, das quais onze ficaram gestantes, produzindo 21 cabritos, dando em média 7 ± 2 por doadora. ARMSTRONG et al (1982), conseguiram melhores resultados em relação a taxa de ovulação, embriões colhidos e cabritos nascidos de cabras superovuladas com FSH e PMSG, obtendo melhores resultados para o FSH. TSUNODA & SUGIE (1989) obtiveram em cabras superovuladas com FSH e PMSG, a percentagem de embriões colhidos foi altamente significativa em favor do FSH, com uma média 9,4± 5,6, 5,7± 4,4 por fêmea tratada com FSH e PMSG, respectivamente.

6 SELGRATH et al (1990) testaram três tratamentos de Gonadotrofina, sendo PMSG (1000 U.I.), FSH-P (20mg) e FSH-P (24mg). Este último foi o que apresentou melhor performance em relação ao número de embriões fertilizados, enquanto o PMSG, apresentou maior taxa de oocistos não fertilizados. WALKER et al (1986) sugerem o uso de GnRH associado a PMSG ou FSH em programas de colheitas embrionárias, pois parece melhorar a sua produção ao beneficiar a taxa de fertilização. Nas doadoras, a preparação fisiológica tem por objetivo a estimulação ovariana (superovulação) capaz de produzir um número de ovócitos mais elevados que o normal, de modo que multiplique sua genética(perrin, 1987). Para a sincronização do estro das doadoras, um tratamento progestativo é administrado, e no final deste, a estimulação do crescimento folicular é provocada pela administração de gonadotrofinas com o objetivo de aumentar o número de ovulações (VALLET et al, 1991). Para estimular os ovários dois tipos de hormônios têm sido utilizados; o Hormônio Folículo Estimulante de Origem Porcina (FSHp) e a Gonadotrofina Sérica de Ègua Prenha (PMSG) (VALLET et al, 1991). O tratamento com o FSHp permite obter um maior número de ovulações e de embriões transferíveis superior ao tratamento com PMSG. A administração de FSHp é, geralmente, efetuada nos últimos dois, três ou quatro dias do tratamento progestativo. Cada fêmea recebe de 12 a 24 mg de FSHP dividido em doses decrescentes com intervalos de 12 horas (ARMSTRONG et al, 1983 a; TERVIT et al, 1984; TSUNODA & SURGIE, 1989; BARIL & VALLET, 1990). ARMSTRONG & EVANS(1983) compararam o PMSG com o FSHp na superovulação de cabras e ovelhas, obtendo uma maior taxa de ovulação, uma menor incidência de falha de ovulação e uma maior média de embriões colhidos pôr fêmea com o uso do FSHp do que com o PMSG. ARMSTRONG et al (1983b) observaram que a taxa de ovulação foi, significativamente, mais alta em cabras da raça Angorá submetidas a um tratamento com FSHp duas vezes ao dia, em doses decrescentes(18mg total), durante quatro dias, do que com uma única dose de 750 a 1250 U.I. de PMSG. A regressão prematura dos corpos lúteos é um fenômeno, geralmente, observado em cabras superovuladas, porém as causas não são ainda determinadas. Este fenômeno, no momento da coleta(seis a sete dias após o estro), tem como consequências uma baixa taxa de recuperação dos embriões

7 e uma má qualidade dos mesmos ( ARMSTRONG et al, 1983 a ; CHEMINEAU et al, 1986; BARIL et al, 1989). BARIL et al (1990 a) observaram uma diminuição na resposta ovariana em cabras submetidas a tratamentos repetidos com FSHp, devido à presença de anticorpos anti-fshp. Resultados preliminares com o uso do Hormônio Folículo Estimulante de Origem Caprina (FSHc) demonstraram que a ovulação pode ser induzida com o FSH homólogo. O mais importante passo será verificar se as superovulações repetidas não acarretarão o mesmo decréscimo, ocorrido com o uso de FSHp, na atividade ovariana BARIL et al (1990b) Fecundação Na prática o estro, quando o mesmo pode ser detectado em 90% dos casos, é a prova mais confiável, que revela a proximidade da ovulação. Em geral o estro é dectado três vezes por dia com a aguda de machos vasectomisados, os quais são mantidos em contacto com as fêmeas afim de determinar com precisão seus primeiros sinais (BARIL et al, 1988). O início dos cios começa entre 24 e 54 horas após a retirada das esponjas(baril et al, 1988).Os pesquisadores estimam que o número médio de corpo lúteo contado é significativamente superior nas fêmeas cujo estro começa 24 a 30 horas após a retirada da esponja, do que aquelas cabras onde o estro começa mais tarde (BARIL et al, 1988) e na ovelha(torres et al, 1987). A fecundação necessita da presença dentro do trato genital da fêmea de um número satisfatório de espermatozóides móveis no momento adequado. A ovulação é marcada pelo pico de LH (Hormônio Luteinizante) que dentro das condições naturais, ocorre em torno de 62 horas após a retirada da esponja, prazo reduzido para 56 horas, com administração de FSH-P (COG-NIÉ et al, 1970). A ovulação tem em média 25 horas após o início do estro em ovelhas superovuladas com aplicação do FSH-P (BARRY et al, 1988). TORRES et al (1984) estimam que os espermatozóides devem se encontrar dentro do útero 48 horas após a retirada das esponjas. Duas técnicas podem ser utilizadas para assegurar a fecundação das fêmeas: a monta natural e a inseminação artificial. A monta natural é

8 preconizada duas vezes no início e no meio do estro em ovelhas (BARIL et al, 1988), e 12 horas e 24 horas após os primeiros sinais de cio na cabra(barry et al, 1988). A inseminação artificial deve ser realizada duas vezes (48 e 54 horas após a retirada das esponjas) ou três vezes (30, 48 e 54 horas após a retirada) na cabra, sendo recomendado doses de 200 milhões de espermatozóides dentro do útero em cada inseminação (BARIL et al, 1988). BARIL et al (1988), observaram uma diferença da taxa de fecundação obtida segundo a técnica empregada em cabra, encontrando 71% e 60,2% para a monta natural e inseminação artificial respectivamente. O aparecimento do estro nas doadoras, geralmente ocorre 24 a 36 horas após a retirada das esponjas. As doadoras devem ser cobertas por reprodutor selecionado, sendo a monta controlada a cada 12 horas a começar do início do cio, até a não aceitação do macho pela fêmea (OLIVEIRA & GONZALES, 1992) Coleta dos embriões A coleta de embriões em caprinos pode ser realizada através de dois métodos: a) cirúrgico e b) não cirúrgico. a) Método cirúrgico O método de coleta cirúrgico de embriões varia entre os autores. Para a realização desta técnica, o animal deve ser anestesiado, contido em mesa cirúrgica própria e, devendo proceder com uma incisão de 4-5cm na linha média ventral, imediatamente à frente da inserção do úbere, permitindo a exteriorização dos cornos uterinos e ovários (OLIVEIRA & GONZALES, 1992). MOORE (1982) utilizou o método de injeção de meio no corno uterino recolhendo-o através de uma cânula de 2mm de diâmetro inserida no oviduto pela fímbria. Outra técnica usada é a introdução do meio pelo oviduto, com auxílio de uma cânula e o seu recolhimento através de catéter de Foley pediátrico introduzido próximo à biburcação do útero (ARMSTRONG et al, 1983). A técnica de lavagem dos cornos uterinos é mais utilizada do que a lavagem dos ovidutos, por apresentar a vantagem de ser menos traumática. Está técnica consiste na injeção de meio a 2-3 cm da junção útero-tubárica, através de um catéter endovenoso e recolhimento por um catéter de Foley

9 introduzido próximo à bifurcação uterina. Como este método limita-se a colheita de embriões que se encontram no útero, deve ser usado somente após o quarto dia da cobertura (OLIVEIRA & GONZALES, 1992). Está última técnica é a que provoca menos trauma e, consequentemente, menos aderências a nível de ovários e ovidutos. Está ausência de lesões é atribuída a uma mínima manipulação dos ovidutos e estruturas adjacentes (TREVIT et al, 1983). Este método pode ser feito através do auxílio de uma sonda de Foley pediátrica número oito de dupla via, também inserida próxima à bifurcação dos cornos (OLIVEIRA et al, 1990). O inconveniente da técnica de lavagem uterina é a dificuldade de recolhimento de embriões que se encontram nas extremidades dos cornos uterinos, muito estreitos, longos e tortuosos na cabra. Entretanto, a eficiência da técnica de colheita depende de livre passagem do meio ao longo da luz do útero e/ou oviduto (POTES, 1990). Para a minimização da possível ocorrência de aderências nas partes de trato genital exposto, que deve ser manipulado com cuidado e proceder uma lavagem com soro fisiológico heparinizado, durante a exposição desde no meio ambiente (OLIVEIRA & GONZALES, 1992). A laporoscopia permite a observação direta dos órgãos abdominais e pélvicos, com menos riscos cirúrgicos e de menor traumatismo para o animal. Consequentemente, tanto na clínica médico-veterinária como na pesquisa, surge como uma valiosa alternativa em relação à técnica da laporotomia. Nas espécies ovina e caprina, a laporoscopia tem sido utilizada, dentre outros objetivos, para a monitoração da atividade ovariana ao longo do ciclo estral (SEEGER & KLATT, 1980). A primeira colheita e transferência de embriões em caprinos foi realizada por WARWICH & BERRY (1949), em cabras Angorá. Os autores relataram o nascimento de um cabrito cujo embrião foi colhido e transferido na mesma doadora. As primeiras tentativas para a colheita de embriões em caprinos e ovinos foram realizadas pela técnica cirúrgica através da laparotomia por HUNTER et al (1955), sendo este método o mais difundido nos países do exterior e é o que apresenta melhores índices de recuperação de embriões. BONDURANT et al (19840, iniciaram as primeiras tentativas para a colheita de embriões pelo método cirúrgico, ou seja, através da cérvix. Os autores conseguiram recuperar 13 embriões, após a lavagem do útero realizada em duas cabras.

10 No Brasil está técnica de transferência de embriões está sendo usada há pouco menos de dez anos, sendo que a maioria dos trabalhos foram realizados através da técnica cirúrgica(oliveira & GONZALES, 1992). Seis a oito dias após o início do estro os embriões são colhidos por cirurgia ou sob controle laporoscópico. Por estes dois métodos, a técnica consiste em introduzir uma sonda no corno uterino da doadora que é posicionada e mantida no local com ajuda de um Ballonete, para permitir a lavagem dos cornos uterinos por meio de injeções e recuperação repetidas do meio de cultura(pbs suplementado com soro fetal bovino).cada corno uterino é perfusado separadamente com cerca de 40 e 50 ml de PBS BARIL et al, 1989; VALLET et al, 1991). Sob controle laparoscópico, a taxa de coleta é menor do que pelo método cirúrgico (62% vs 85%) mas, cada doadora pode ser coletada mais de sete vezes sem problemas graves de aderências (BARIL et al, 1989). b) Método não cirúrgico ( através da cérvix) Embora a técnica de colheita de embriões em caprinos venha sendo utilizada com bons índices de recuperação, apresenta o inconveniente de limitar o seu uso doadores pôr no máximo 2 a 3 vezes, devido aos traumas cirúrgicos, aderências pós-operatórias, custos elevados e exigência de mão-deobra especializada (OLIVEIRA & GONZALES, 1992). Visando minimizar os traumas e diminuir a relação custos-benefício da técnica cirúrgica, procurou-se adaptar ao caprino a técnica de colheita pela via cervical, utilizada com êxito nos bovinos. Todavia, uma das dificuldades no uso desta técnica é o diâmetro estreito do canal cervical da cabra, restringindo a passagem do catéter. Várias técnicas vêm sendo usadas com o objetivo de facilitar este processo (OLIVEIRA & GONZALES, 1992). Um dos métodos utilizados e que apresenta bons resultados é a fixação da cérvix com auxílio do dedo indicador na vagina, onde foi obtido sucesso em 42% dos casos (COONROD et al, 1986). Outra tentativa de colheita via cervical bem sucedida, foi realizada por NAGASHIMA et al, (1987) que, utilizando um catéter metálico de dupla via, tiveram êxito em 51,4% dos animais, obtendo 69 estruturas. Para a realização desta técnica, os animais também devem ser anestesiados e contidos em mesa cirúrgica própria. Através de um espéculo com fonte luminosa, visualiza-se a cérvix é, após o processo de tracionamento e fixação desta, introduz-se uma sonda de aço inoxidável de dupla via no canal cervical, inicia-se a lavagem uterina com o meio adequado pôr uma das vias e,

11 o seu recolhimento pela Segunda via em um recipiente esterilizado (OLIVEIRA et al, 1990). A primeira coleta não cirúrgica de embriões em pequenos ruminantes foi reportada por BONDURANT et al (1984) que obtiveram blastocistos de caprinos leiteiros não cirurgicamente com auxílio de Luminaria japonica para dilatação da cérvix. Recentes estudos de transferência de embriões em pequenos ruminantes, produzidos pôr procedimentos não cirúrgico e por laparoscópio, ambos relativamente atraumático; produzem resultados que são competitivos com os métodos cirúrgicos (KRAEMER, 1989) Avaliação dos embriões Após Ter deixado sedimentar os embriões dentro do líquido de coleta, estes são avaliados em lupa binocular afim de observar sua viabilidade sobre os critérios morfológicos em função do dia de coleta (KILLEN, 1981). BARIL et al (19880 utilizaram uma classificação dos embriões segmentados em degeneradores ou normais. Os embriões normais são classificados em mórula, blastocistos desenvolvidos, blastocistos recém liberados. Foi observado a este nível a existência de uma diferença do estágio de evolução dos embriões colhidos no sexto dia segundo a espécie ovina e caprina. MARTINEZ et al (1985), observaram uma proporção de 35% de blastocistos jovem em ovelhas aos seis dias, enquanto BARIL et al (1988) relataram uma proporção de embriões no mesmo estágio de 16% em cabras. Existe por outro lado diferenças intraespecíficas importantes, estas que ocasiona as dificuldades de seleção dos embriões a transferir ou congelar. ARMSTRONG (1983) constatou uma diminuição da taxa de mórulas recolhidas com o aumento da taxa de ovulação, enquanto que TORRES (1984) estabeleceu uma correlação crescente entre dois parâmetros. A avaliação dos embriões, após a coleta, é um pré-requito para qualquer manipulação futura como: microcirurgia, congelação e transferência (WHITTINGHAM, 1978). Sob condições de campo, a viabilidade da preimplantação de embriões é, geralmente, estimada com base na sua aparência morfológica e na sua habilidade para continuar o desenvolvimento in vitro durante o tempo de armazenamento entre a coleta e a transferência (MEINECHE & MEINECKE TILLMANN, 1990). O aspecto morfológico do embrião é, atualmente, o único critério de apreciação capaz de avaliar a sua viabilidade. Assim, no sétimo dia, o estádio característico é de mórula, ao oitavo dia é de blastocisto. Além da

12 diferença entre estes dois estádios, isto é, desenvolvimento mais ou menos pronunciado da blastocele e início de formação do botão embrionário, os embriões que não apresentam este tipo de arranjo celular são considerados mortos ou degenerados, ou em via de degeneração. Somente os embriões julgados, pelo menos, de boa qualidade devem ser utilizados (PERRIN, 1987). Com base na morfologia, os embriões são classificados como: degenerados, retardados ou mórulas compactas, blastocistos, blastocistos expandidos ou fora da zona pelúcida. Entre estas estruturas, somente são aproveitadas aquelas que apresentarem as qualidades requisitadas: homogeneidade celular e integridade da zona pelúcida (BARIL et al, 1989; VALLET et al, 1991). 2.2 Conservação dos embriões Após ter selecionado os embriões transferíveis, vem uma segunda fase também importante da técnica de transferência de embriões: a conservação destes embriões, que pode ser de curta ou de longa duração(quirin, 1989) Conservação de curta duração Os embriões selecionados são conservados dentro de meio próprio sob atmosfera e temperatura controlada (5%CO 2, 5% O 2, 90% N 2 ) (MARTINEZ et al, 1985). Após a conservação é recomendado que os embriões sejam transferidos dentro de um espaço de duas horas seguintes a sua coleta, sem ultrapassar das quatro horas(baril et al, A viabilidade embrionária tem que ser preservada desde a colheita até a transferência dos embriões. Vários tipos de meios são utilizados, entretanto, o mais comum é facilmente encontrado no comércio, associado a melhores resultados é o Dulbecco Salino fosfato tamponado (PBS) enriquecido com soro fetal bovino, ovino ou caprino (5-10%) e antibióticos (OLIVEIRA & GONZALES, 1992) Conservação de longa duração Importantes progressos foram efetuados dentro do domínio de congelamento dos embriões dos pequenos ruminantes (QUIRIN, 1989). COCERO et al (1988) retomando os trabalhos de TERVIT et al (1983), demonstraram que o etileno glicol ( 1,5 M ), assegura uma melhor crioproteção para os embriões de ovelhas do que o glicerol ( 1,4 M ), utilizado correntemente até o presente. O mesmo crioprotetor foi estudado em cabras por HEYMAN et al (1987).

13 O método consiste em colocar os embriões previamente conservados dentro do PBS + 20 % de soro fetal bovino em contacto sucessivamente com três soluções contendo o etileno-glicol ( A: 0,5 M por 10 minutos; B: 1,0 M por 10 minutos; C: 1,5 M também por 10 minutos respectivamente), em temperatura ambiente. Depois os embriões são colocados em paillettes (IMV France) e submetidas a um resfriamento conduzindo ao congelamento (CASAMITJANA & PERRIN, 1989). BILTON & MOORE (1976) coletaram embriões de caprinos de 5 a 7 dias após o estro in vitro a 37 o C por 2 dias, ou armazenados a 5 o C por 1 ou 2 dias, e quando cultivados por 2 dias ou armazenados em nitrogênio líquido (-196 o C) por 2 a 4 semanas. Após a cultura alguns foram transferidos para fêmeas receptoras. Os embriões foram conservados em PBS enriquecido com 25% de soro caprino, adicionado com 1 M de glicerol ou 2M de dimetilsulfóxido (DMSO) no congelamento. Apenas os embriões de qualidade excelente devem ser congelados dentro de um prazo que não ultrapassa duas horas após a coleta. Os embriões são passados em banhos sucessivos de PBS, adicionado de glicerol a uma concentração inicial de 0,7 M (10 minutos) e depois a uma concentração de 14 M (10 minutos) ou de etilenoglicol de 0,5 M (5 minutos), 1 M (minutos) e 1,5 M (5 minutos).os embriões em seguida, são acondicionados em pailletes finos (0,25 ml) e congelados progressivamente, à razão de 1 o C/minuto até 7 o C. Neste estágio, a cristalização é reduzida, depois o congelamento prossegue à razão de 0,3 o C/minuto, até atingir em média 28 a 30 o C. o congelamento lento permite a desidratação progressiva das células embrionárias. Após quinze minutos os pailletes são mergulhados em nitrogênio líquido (-196 o C), sendo a conservação do embrião neste estágio, a priori ilimitada (BARIL et al, 1989; VALLET et al, 1991). LI et al (1990) coletaram embriões de cabras mestiças Cachemira x Angorá de cinco, seis e sete dias após a ovulação, usando glicerol ou dimetilsulfóxido (DMSO) como crioprotetor, obtendo melhores resultados com o último, e quando os embriões eram coletados no sétimo dia, no estádio de blastocisto com o desenvolvimento da blastocele Descongelamento dos embriões O descongelamento faz-se colocando os paillettes em contacto com a água a 37 oc. Na continuação desta operação de reaquecimento, é necessário retirar o crioprotetor, introduzindo-os dentro de uma solução de PBS + 20 % de soro fetal bovino e 0,25 M de glicose durante 10 minutos, sendo este mesmo processo usado quando se utiliza o glicerol como crioprotetor (CASAMITJANA &PERRIN, 1989).

14 Toda vez que os embriões forem descongelados e o crioprotetor retirado, é necessário que se faça uma nova avaliação, observando-se em lupa binocular. Os resultados obtidos com o etileno-glicol são de 62,5% de embriões sobreviventes após 24 horas de cultura(cocero et al, 1988). Outros agentes crioprotetores são utilizados; DMSO ( WILLADSEN et al, 1976) glicerol + solução de glicose (MERRY et al, 1984) mas dão resultados mais baixos quanto ao número de embriões sobreviventes. BARIL et al (19890 e VALLET et al (1991) estabeleceram que o descongelamento seja realizado com a imersão dos pailletes durante 30 segundos em banho-maria a 37 o C. Os embriões são, sucessivamente, passados em três a quatro banhos de PBS, adicionado de crioprotetos. A concentração decrescente de etilenoglicol (1,0 M 0,5 M. OM) ou gliceral (1 M 0,7 M 03 M OM) permite, desta forma, a reidratação progressiva das células embrionárias. A qualidade dos embriões e novamente avaliada, pois, os embriões danificados durante as operações procedentes são eliminados. 2.3 Transferência dos embriões Escolha das receptoras A escolha da fêmea que se portará como receptora tem a mesma importância do que a doadora de embriões, visto que a mesma deve apresentar boas condições para levar a gestação até o seu final. Os critérios a serem considerados para a escolha das fêmeas são baseadas nos seguintes pontos: 1) as fêmeas devem exteriorizar sinais de estros regulares, em média a cada 21 dias; 2) os animais devem encontrar-se em bom estado sanitário e nutricional; 3) livres de doenças do sistema reprodutor; 4) boa habilidade materna, ou seja, não serem predispostas à rejeição da cria; 5) boa aptidão leiteira, isto é, capazes de alimentar e criar os produtos (OLIVEIRA & GONZALES, 1992). As receptoras são fêmeas que deverão assegurar a sobrevivência e o desenvolvimento embrionário. O valor genético destas pouco importa. Todavia, devem ser selecionadas com os mesmos critérios estabelecidos para as doadoras (PERRIN, 1987). O estado sanitário do rebanho de origem das receptoras é de grande importância e os programas de transferência não devem ser conduzidos em rebanhos que não estejam incluidos em um programa de controle sanitário. A

15 receptora deve Ter atividade cíclica regular, além de uma boa condição física (com nenhuma perda de peso recente) e livre de qualquer doença, incluindo, qualquer desordem reprodutiva (NIBART, 1991). As fêmeas devem Ter idade, no mínimo, sete meses e pesar entre 30 a 35 Kg. As nulíparas são bem recomendadas, pois os resultados de fertilidade obtidos são superiores, em torno de 10% sobre as pluríparas (VALLET et al, 1991). Num programa de transferência de embriões em qualquer que seja a espécie, nenhum tratamento (antiparasitário, descorna, limpez dos cascos etc.) deve ser realizado três semanas antes da sincronizaçção (BROADBENT et al, 1991). Mas, segundo VALLET et al (1991) desde três meses antes das operações e até a parição, os diversos tipos de stress, como os de origem alimentar, traumática e sanitária devem ser evitados. È fundamental que os animais selecionados se integrem ao rebanho, ou sejam transferidos para um mesmo local, pelo menos três meses antes do início do tratamento hormonal, período necessário para uma boa adaptação. Em adição, as mudanças bruscas no clima, como o calor intenso, contribuem negativamente na taxa de prenhez (EVANS & MAXWEL, 1990; BROADBENT et al, 1991) Sincrronização do Cio A utilização de prostaglandinas e esponjas vaginais permitem a difusão da progesterona, induzindo o ciclo a uma data determinada, sendo usado uma aplicação de PMSG no dia da retirada da esponja (CASAMITJANA & PERREIN, 1989). Uma das condições para que haja um perfeito funcionamento da técnica da transferência de embriões, é a existência de uma perfeita sincronia entre a fase de desenvolvimento embrionário e o estado correspondente ao trato genital da receptora no momento da transferência. Desta forma, é necessário que as receptoras estejam em estro, simultaneamente, ou com uma diferença de no máximo 12 horas em relação às doadoras (OLIVEIRA & GONZALES, 1992). Um dos métodos de sincronização mais usado no Brasil, é o do esquema curto, com 10 dias, usando-se esponjas vaginais impregnadas com progestágenos, e aplicação de outros hormônios por via intramuscular. A retirada das esponjas ocorre no décimo dia, com aparecimento do estro em torno de 24 a 64 horas. Está variação é menor nas doadoras (24-36 horas). Isto deve-se às altas doses de hormônios que promovem o aumento na produção de óvulos, desencadeando um processo de sincronização mais preciso nas doadoras(oliveira & Gonzales, 1992).Considerando-se a maior variação no período de exteriorização do estro nas receptoras, recomenda-se a

16 retirada das esponjas vaginais 24 horas antes das doadoras(torres et al, 1987). MGONGO (1988) utilizando doses de prostaglandina diferentes por via intramuscular e intravulvar subcutânea, observou que mesmo em pequenas doses a via vulvar é tão eficiente quanto a intramuscular. Existe hoje, como tratamento de sincronização na espécie caprina, uma série de métodos que conduzem à aferição de diferentes resultados. Uma gama enorme de hormônios e drogas utilizadas desde as protaglandinas, que não oferecem bons resultados na espécie caprina GONZALEZ et al(1974 e 1979), aos progestágenos sintéticos, com resultados variados dependendo das vias de aplicação e duração dos tratamentos (CORTEEL, 1975). Atualmente, na França excelentes resultados são obtidos empregando-se sincronização do estro com esponjas intravaginais impregnados com acetato de fluorogestona associado a protaglandinas (NUNES, 1985). O primeiro tratamento utilizado com esponjas consistia em colocar na porção craneal da vagina da cabra uma esponja impregnada com 45 mg de Acetato de fluorogestona(fga) pôr vinte e um dias, aplicando-se dois dias antes da retirada da esponja, uma injeção de 400 U. I. de PMSG (CORTEEL, 1975). Recentemente, emprega-se um tratamento conhecido como curto, que consiste na permanência de esponjas na porção craneal da vagina apenas onze dias, com aplicação de 400 U. I. de PMSG e 100 M g de cloprostenol por via intramuscular, sendo que o tratamento longo (vinte e um dias), evidenciou uma fertilidade mais baixa, em comparação com o primeiro (CORTEEL, 1975). Diferentes fertilidades também foram obtidas dentro de cada tratamento, quando se variou o local de deposição do sêmen: Cérvix ou útero, constatando-se inseminação intrauterina, sempre, uma maior fertilidade, independendo do tipo de tratamento (curto ou longo). No entanto, com o tratamento curto obteve-se melhores resultados de fertilidade(corteel, 1975). A cabra, sendo sincronizada através de esponjas vaginais, em um tratamento curto de dez dias, com aplicação de 200 U. I. de PMSG e 100 M g de cloprostenol, mostra um pique de estro 24 horas após a retirada da esponja (SILVA & NUNES, 1984). Os mesmos autores, utilizando a endoscopia, determinaram que o momento exato da ovulação, está em torno de 38 a 40 horas após a retirada da esponja.

17 Adicionalmente, em função das condições climáticas da região do globo terrestre, a fêmea ovina e caprina poderão apresentar estro e ovular ou não, ao longo de todo o ano (THIMONIER, 1981). No momento os progestágenos mais utilizados para sincronização do estro em ovinos e caprinos, são o acetato de medroxiprogesterona (MAP) e o acetato de fluorgestona (FGA), na dosagem de 60 e 45 mg respectivamente, ministrados por via vaginal, através de esponjas de poliuretano (CHEMINAU & COGNIÉ, 1991). Em função da duração do período que a fêmea é exposta ao progestágeno, o tratamento é classificado como curto (10 a 11 dias) ou longo (12 a 18 dias) (PINEDA, 1989). GONZALEZ-STAGNARO (1974) admite a possibilidade de que, administrando apenas gonadotrofinas para a sincronização do estro, estas possam provocar ovulação sem que o animal apresente sinais clínicos de estro, aspecto este que cria problema de manejo quando a inseminação é feita somente naqueles indivíduos que apresentam estro. A esponja vaginal parece ser o método de eleição no controle da ovulação, se tivermos em conta as limitações impostas pela administração diária da progesterona e a ausência de resposta às prostaglandinas nas cabras em anaestro ou nas cíclicas que se encontrem nos primeiros 4-5 dias depois do estro (MOORE & EPPLESTON, 1979). No fim do diestro o útero segrega Prostaglandina F 2 responsável pela regressão natural do corpo lúteo, o que se traduz numa quebra da concentração progesterônica. Está baixo progesteronemia serve como estímulo, ou melhor desbloqueia o hipotálamo, e a hipófise passando está a liberar FSH e LH. O ciclo ovárico pode portanto, ser controlado pela administração de um agente luteolítico que encurte a vida útil do corpo lúteo, provocando a sua regressão em 24 a 72 horas e o aparecimento do estro e ovulação. CORTEEL et al (1984) reportando-se a um trabalho de rotina onde foram utilizadas 5363 cabras e em que comparam um tratamento longo de 21 dias pôr meio de esponjas vaginais de FGA com um tratamento curto de 11 dias e uma injeção de cloprostenol, concluiram que o tratamento curto se mostrou mais eficiente tendo obtido uma fertilidade de 54,1% VS 56,9% no tratamento longo. A PGF 2 só exerce a sua ação sobre o corpo lúteo funcional, pelo que, a fêmea a tratar, não só deve estar cíclica mas também encontrar-se ainda entre o quinto e o décimo nono dia do ciclo. Fora deste período o corpo lúteo é refratário, ou não tem receptores, à sua ação luteolítica (CORTEEL et al, 1982).

18 A posologia do PMSG recomendada por (CORTEEL et al, 1984 a) para manter na espécie caprina uma fertilidade próxima de 63% após um tratamento curto de progestágeno + cloprostenol é variável não só com a raça ( a raça Saanen mostrou-se menos fértil que a Alpina), mas também com a produção de leite e período de tratamento. O PMSG pode também ser útil na indução de um leve efeito superovulatório benéfico em algumas raças menos prolíferas. RITAR et al (1984) confirmaram que foi necessária a administração de PMSG, para estimular, uma resposta ovulatória satisfatória em cabras em lactação ou secas, tanto na estação reprodutiva como no anaestro sazonário. Concluiram que houve uma antecipação da ovulação e do pique pré-ovulatório de LH quando a gonadotrofina foi administrada 48 horas antes da remoção das esponjas. Um dos fatores para o sucesso da transferência de embriões é a adequada sincronização entre o embrião e a receptora(thibier & NIBART, 1992).É fundamental que, no momento da transferência, a receptora esteja em estado fisiológico reprodutivo idêntico ao da doadora (ARMSTRONG et al, 1983 b; PERRIN, 1987). As fêmeas receptoras são submetidas ao mesmo tratamento progestativo que as doadoras. O tratamento de estimulação ovariana, com PMSG, é idêntico `aquele utilizado nos trabalhos de sincronização do estro para a inseminação artificial. Os diversos tratamentos utilizados diferem pelos progestágenos empregados e pela via de administração: esponjas vaginais, implantes ou injeções (VALLET et al, 1991). ARAÙJO (1994) observou em cem fêmeas caprinas pluríparas sincronizadas pelo método CHRONOGET, 96 (96%) destas apresentaram estros entre 12 a 48 horas após a retirada das esponjas, sendo 49 (98%) pertencentes ao sistema de manejo intensivo e 47 (94%) ao sistema semiintensivo. FONSECA et al (19870 utilizaram cabras (SRD), cíclicas e lactantes com o objetivo de comparar a eficiência de esponjas impregnadas com 50mg de MAP, associadas a 200 ou 400 U. I. de PMSG e a 0,05 ou 0,125 Mg de cloprostenol na sincronização do estro e observaram uma maior prolificidade quando foram usados closes de 400 U. I. de PMSG, independente das doses de cloprostenol. A sincronização do estro em cabras nulíparas e cíclicas pode ser realizada com resultados satisfatórios com a aplicação de esponjas impregnadas com 50mg de MAP, associadas a 200, 400 0u 750 U. I. de PMSG e a 0,05 M g de

19 cloprostenol, sendo que a prolificidade tende a ser maior quando se utiliza a dose de 400 U. I. de PMSG (ESPESCHIT et al, 1987) Transferência Em caprinos, o método de transferir o embrião mais comumente usado é o cirúrgico. Os procedimentos para este método são iguais aos utilizados para a colheita cirúrgica. O animal é submetido à anestesia e contido em mesa cirúrgica. Uma incisão na linha média ventral (4-5cm) é feita para exteriorização do útero e observação da presença de corpos lúteos nos ovários. O embrião é depositado no corno uterino correspondente ao corpo lúteo a 3-4cm da junção útero-tubárica. A transferência pode ser feita com uma seringa de volume de 1ml acoplada a uma agulha de ponta romba ou um tubo de hematócrito, inseridos na luz do útero previamente perfurado com agulha ou estilete (OLIVEIRA & GONZALES, 1992). Quando os embriões são coletados recentemente, recomenda-se não ultrapassar de 2 horas antes da sua utilização. Quando eles forem congelados, deve ser feita uma nova avaliação antes da colocação no útero da receptora (MARTINEZ et al, 1985). TORRES & SEVELEC (19870, mostraram que a posição do corpo lúteo não influência sobre a taxa de gestação quando um embrião está localizado em cada corno uterino em ovelhas. O diagnóstico de gestação pode ser realizado por dosagem de progesterona no décimo sexto dia na ovelha e no vigésimo primeiro dia do ciclo na cabra ou após 45 dias pôr ecotomografia (MARTINEZ et al, 1985). BILTON & MOORE (1976), de 15 embriões cultivados sem armazenamento prévio, 13 desenvolveram durante 2 dias, sedo transferidos para nove receptoras e destas cinco pariram, cada um cabrito. As operações de transferência devem ser realizadas o mais rápido possível após a coleta (menos de quatro horas) ou após o descongelamento(menos de quarenta minutos).dois ou três embriões são colocados em um catéter ou em uma pipeta de vidro, contendo 5 a 20 ml de PBS e são transferidos, por laparotomia ou pôr controle laparoscópico, no terço superior do corno uterino ipsilateral ao ovário que apresente, pelo menos, um corpo lúteo funcional (BARIL et al, 1989). A identificação do ovário portador de corpo lúteo funcional é importante por ter sido demonstrado que a transferência para o corno uterino ipsilateral ao corpo lúteo leva a melhores resultados (NEWCOMB & ROWSON, 1980),

20 embora estes autores preconizam que a disposição do embrião ocorra na extremidade do corno uterino epsilateral, mas PERRIN (1987) relata que a deposição a 10 cm adiante da bifurcação é a mais adequada. A sobrevivência embrionária foi significativamente melhorada quando dois embriões foram transferidos. Cerca de 60% das receptoras com dois embriões tiveram uma prenhez a termo com, aproximadamente 2 / 3 destes com partos duplos. Em receptoras que receberam dois embriões, a sobrevivência foi melhorada pela transferência de ambos embriões para o mesmo oviduto (70%) do que quando transferidos para cada oviduto (62%) (ARMSTRONG et al, 1983 b). Comparando a eficiência das técnicas de transferência para laparotomia e por laparoscopia, a maioria dos autores afirma que a taxa da sobrevivência embrionária e de parição são sempre mais baixas após transferência por laparoscopia com resultados em torno de 40% ou menos (ARMSTRONG & EVANS, 1983; HEPBURN, 1987; BARIL et al, 1989). BARIL et al (19890 concluiram que a transferência de embriões sob o controle laparoscópio era, ainda, inadequada, sendo necessário melhorar esta técnica que parece ser a mais rápida e menos traumática que a cirúrgica. Entretanto, VALLET et al (1989) avaliando as duas técnicas, concluiram que a técnica de laparoscopia quando comparada com a laparotomia, para transferência de embriões em caprinos, mostra que não existem diferenças significativas com relação à sobrevivência embrionária e a taxa de parição. Porém, a laparoscopia permite, em condições de campo, evitar contaminação do trato genital, além de hemorragias internas e aderências, sedo uma técnica mais rápida ( 5 vs 15 ) que a laparotomia. 2.4 Avaliação dos resultados obtidos BESSOUDO et al (1988 a ), obtiveram embriões colhidos de 336 fêmeas Angorá, dos quais 149 degenerados, com uma média de 9, 47, 7, 34 e 11, 32 pelos métodos não cirúrgico sem laparoscopia, não cirúrgico com laparoscopia e cirúrgico respectivamente. BESSOUDO et al (1988b) transferiram embriões, obtendo o nascimento de cabritos (46, 52%). OLIVEIRA et al (1992) transferiram embriões para 23 receptoras, das quais 11 pariram produzindo 16 produtos. A situação da transferência de embriões no Exterior e no Brasil segundo o método utilizado e a taxa de recuperação: Pelo método cirúrgico no Exterior: CALL et al (1987), 54, 3, NUTI et al (1987) 67, 0, HOLM et al (1990) 92,0 e POTES (1990) 48,0%.Não cirúrgico no Exterior: COONROD et al (1986) 74, 0

21 , NAGASHIMA et al (1987) 51,4 e BARRY & VAN NIEKERK (1990) 54,0%.No Brasil, CHOW et al (1986) 100,00 LIMA (1989) 48,4 e OLIVEIRA et al (1992) 40,0% pelo método cirúrgico PEREIRA et al (1991) 89,6 e OLIVEIRA et al (1992) 30, 6% pelo método não cirúrgico. ARAÙJO (1994) transferindo 154 embriões, sendo 84 embriões em receptoras submetidas ao sistema de manejo intensivo e 70 embriões em receptoras no sistema semi-intensivo, obteve 31 e 14 produtos nascidos respectivamente Atualmente o controle da reprodução caprina é possível, aplicando técnicas que têm demonstrado a sua eficiência. Desde da monta natural com utilização sistemática do efeito macho, até os métodos de diagnósticos de gestação, passando pelos métodos de indução do estro, da ovulação, da inseminação artificial e transplantes de embriões, é possível programar a data do parto e o número de cabritos nascidos com uma precisão razoável(chemineau et al, 1993). Em explorações mais tecnificadas, o controle do estro e da ovulação são ferramentas utilizadas com outros fins prioritários tais como: difusão de genótipos selecionados em conjunto com a inseminação artificial, programação da época de nascimento mais favoráveis para sobrevivência das crias, melhorar a eficiência reprodutiva e preparar fêmeas doadoras e receptoras, para o desenvolvimento da técnica de transferência de embriões(gonzàlesz- STAGNARO, 1993). 3. ASPECTOS SANITÁRIOS DA TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES As três maneiras de realizar mudanças nos genes, visando o melhoramento genético é através do animal vivo, sêmen e o embrião. Esta última é sem dúvida o meio mais simples e mais eficaz do ponto de vista genético, Entretanto, deve ser considerado também em relação ao aspecto sanitário, pois os agentes infecciosos são totalmente diferentes daqueles do sêmen da inseminação artificial. O embrião possui um certo número de proteções contra os agentes patógenos ( o corpo da mãe, cavidade uterina, a zona pelúcida e em fim a membrana trofoblástica) (THIBIER, 1989). Ele está sujeito a dois tipos de riscos: aquele que se apresenta antes da coleta in vivo e aquele da transferência e as operações que acompanham in vitro (THIBIER, 1989). Certas recomendações técnicas mais precisas, apoiam-se sobre trabalhos científicos que permitem eliminar estes riscos, ao ponto que, o embrião seja atualmente a forma de troca de matéria viva mais segura.

22 Nos pequenos ruminantes, os trabalhos têm demonstrado a ausência de transmissão de vírus da Língua Azul CHEMINEAU et al (1986) concluiram que há um risco mínimo na transmissão do vírus após a lavagem dos embriões. Para evitar os riscos de transmissão de agentes infecciosos, a regulamentação francesa não autoriza a transferência de embriões que não apresentam a zona pelúcida, verdadeira barreira entre o embrião e o mundo exterior, intacta e sem restos celulares periféricos, fonte de contaminação residual. Eles devem ser submetidos pelo menos a dez lavagens sucessivas (THIBIER, 1989). Todas as medidas necessárias devem ser tomadas, e parece que a transferência de embriões é a forma mais segura de permuta de genes do ponto de vista sanitário, quer seja de um estado para outro de um continente a outro. Assim, esta técnica permite contornar a proibição de importação de animais vivos dentro de numerosos países THIBIEER & NIBART, 1986). 4. INTERESSES DA TRANSPLANTAÇÃO EMBRIONÁRIA 4.1 Transplantação embrionária e genética a) Melhoramento genético e difusão O primeiro interesse, evidente para todo mundo, é aumentar o número de produtos nascidos por fêmeas, por unidade de tempo durante a sua vida produtiva. O crescimento da qualidade de produtos nascidos é importante quando a fêmea considerada apresenta um ou mais caracteres excepcional dentro de sua raça. A transplantação embrionária depende da inseminação artificial, com a utilização de sêmen de reprodutores de qualidades reconhecidas. A técnica utiliza a superovulação da doadora, sendo coletado um número de embriões superior àqueles que a fêmea poderia produzir até ao final, e isto é que justifica a sua coleta (QUIRIN, 1989). A coleta dos embriões libera assim o útero da mãe e permite que a gestação seja completada por fêmeas de valor genético inferior, liberando a fêmea doadora para um novo tratamento superovulatório. Este objetivo permite gerar e explorar os melhores estoques de ovácitos de um animal julgado excepcional, estoque este, que não se renova durante a vida reprodutiva, o que acontece com os espermatozóides do macho os quais a produção é permanente depois de puberdade até a morte (CASAMITJANA & PERRIN, 1989). Um segundo objetivo da transferência de embriões é mais difícil de perceber e de ser mensurado que é o melhoramento genético. SMITH (1988) estime que a diminuição do intervalo entre gerações é o fator mais importante