Proteínas plasmáticas - Introdução

Transcrição

1 Proteínas plasmáticas - Introdução As proteínas estão presentes em todos os fluídos do nosso corpo. Analisa-se as proteínas plasmáticas com a finalidade de serem utilizadas como auxiliares de diagnóstico. Mais de 100 proteínas têm função fisiológica no plasma. Funções das proteínas plasmáticas FUNÇÃO Transporte Imunidade humoral Manutenção da pressão osmótica Enzimas Inibidores da protease Tampão EXEMPLO globulina de ligação à tiroxina (hormonas da tiróide) apolipoproteínas (colesterol, triglicerídeos) transferrina (ferro) imunoglobulinas todas as proteínas, particularmente a albumina renina factores de coagulação α 1 -antitripsina (actua nas proteases) todas as proteínas Proteínas plasmáticas - Introdução Quantitativamente a proteína mais importante é a albumina. As outras proteínas designam-se colectivamente por globulinas. Alterações na concentração das diferentes proteínas podem fornecer informações úteis para o diagnóstico. Causas: -alteração da taxa de síntese das proteínas - alteração na taxa de remoção das proteínas - alteração no volume de distribuição A concentração das proteínas é afectada pela postura: aumento de 10 a 20% durante os 30 minutos após o levantar da cama, devido a um aumento da difusão de fluídos do compartimento vascular para o intesticial. Aumento num curto espaço de tempo (e não recebeu proteínas por via endovenosa) - devido a uma diminuição do volume de distribuição (desidratação) Diminuição acelerada da concentração proteica - devida a um aumento do volume plasmático.

2 Proteínas plasmáticas - Introdução A determinação das proteínas plasmáticas fornece informações sobre o estado de hidratação do paciente. Causas de alteração da concentração das proteínas plasmáticas totais AUMENTO DIMINUIÇÃO Hipergamaglobulinemia Paraproteinemia Aumento da síntese proteica Má nutrição e má absorção Doença hepática Imunodeficiência humoral Diminuição da síntese proteica - Artefacto Hemoconcentração devido à estase do sangue durante a punção Hiper-hidratação Aumento da permeabilidade capilar Aumento do volume de distribuição - Desidratação Diminuição do volume de distribuição Estado de perda de proteínas Estado catabólico Aumento da excreção/ catabolismo Proteínas plasmáticas - Principais proteínas plasmáticas Principais proteínas plasmáticas CLASSE Albumina PROTEÍNA MASSA MOLECULAR (D) CONCENTRAÇÃO SÉRICA APROXIMADA (g/l) Pé Préalbumina ,25 Albumina α 1 -globulina α 1-antitripsina α 1 -glicoproteína ácida ,9 1,0 α 2 -globulina β-globulina Haptoglobulina α 2 -macroglobulina Ceruloplasmina ,0 2,6 0,35 Transferrina ,0 Lipoproteínas de baixa densidade ,0 Componentes do complemento (C 3 ) ,0 Proteína C reactiva ,01 γ-globulina IgG IgA IgM Ig D IgE ,0 3,5 1,5 0,03 vestígios

3 Proteínas plasmáticas - Albumina ALBUMINA Proteína mais abundante no plasma Proteína de fase aguda negativa Sintetizada no fígado Contribui para o equilíbrio da pressão osmótica coloidal Determina a distribuição do fluído extracelular entre os espaço vascular e extravascular Transporta: hormonas, medicamentos, ác. gordos livres, bilirrubina não conjugada e iões A interpretação das variações patológicas têm que ser cuidadosas uma vez que são muitos os processos patológicos que causam alterações nas concentrações plasmáticas. Causas de hipoalbuminemia Diminuição da síntese: má nutrição, má absorção e doença hepática Aumento do volume de distribuição: hiperhidratação, aumento da permeabilidade capilar (septicemia e hipoxemia) Aumento da excreção/degradação: síndroma nefrótico, queimaduras, hemorragia, estados catabólicos (febre, trauma, doença maligna) Proteínas plasmáticas - α 1 -globulinas Risco aumentado em deficiências Homozigóticos (ZZ) α 1 -GLOBULINAS α 1 -ANTITRIPSINA Inibidor as protease É uma proteína de fase aguda. A sua concentração aumenta em estados de inflamação aguda. Constitui cerca de 90% das α 1 -globulinas Forma activa: MM Deficiências hereditárias de α 1 -antitripsina podem originar: hepatite neonatal que se pode transformar, no adulto, em cirrose (o defeito é devido na substituição de um aminoácido por outro que leva à proteína formar agregados que não podem ser secretados do fígado e causam danificação do tecido hepático) e efisema (devido à falta do inibidor natural da enzima elastase, que resulta em mudanças destrutivas no pulmão) - risco aumentado em pessoas que fumam Estas anomalias podem ser detectadas antes do nascimento por exame do sangue fetal - focagem isoeléctrica antecedida pela PCR (pollimerase chain reaction) Valores elevados: - inflamações - gravidez - uso de contraceptivos

4 Proteínas plasmáticas - α 1 -globulinas α 1 -FETOPROTEÍNA Sintetizada pelo fígado fetal Detectada no soro materno até ao 7 ou 8 mês de gravidez Pensa-se que protege o feto do ataque imunológico materno (após o nascimento desaparece do soro. Está aumentado, por exemplo, em carcinomas) Valores elevados: - alterações do tubo neural - espinha bífida - sofrimento fetal, parto prematuro ou gémeos - tirosinose (aminoacidopatia) - doença hemolítica do recém-nascido - hepato-carcinoma - tumores das gonadas nos adultos Valores baixos: - risco do síndrome de Down (alterações no cromossoma 21) Teste de despite ( screening ): 15 a 20 semanas de gestação Proteínas plasmáticas - α 1 -globulinas α 1 -GLICOPROTEÍNA ÁCIDA Sintetizada pelo fígado (existe na membrana das plaquetas) Homologia com imunoglobulinas e haptoglobulina (podem ter resultado de uma proteína comum) Função: - interfere no metabolismo das hormonas esteróides, na coagulação e formação de colagénio - transporta hormonas esteróides Valores elevados: - inflamação - gravidez - cancro - pneumonia - artrite reumatóide Valores baixos: - problema hepático grave Banda α1-globulinas: Os seus níveis estão elevados nas doenças inflamatórias agudas e crónicas, neoplasias, após traumas ou cirurgias e durante a gravidez ou estrogenioterapia. Nos hepatocarcinomas, a elevação pode acontecer pelo aumento da alfa-fetoproteína.

5 Proteínas plasmáticas - α 2 -globulinas α 2 -GLOBULINAS HAPTOGLOBULINA Sintetizada nos hepatócitos e nas células do sistema reticuloendotelial (pequena quantidade) É constituída por dois tipos de cadeias (duas α e duas β). A cadeia β contém o local de ligação para a hemoglobina (cadeia α) Impede a perda da hemoglobina e do ferro na urina Valores elevados: - estados inflamatórios - doenças reumáticas - queimaduras - síndrome nefrótico Valores baixos: doença hemolítica do recém-nascido e após transfusões - serve para avaliar o grau de hemólise CERULOPLASMINA Sintetizada no fígado Contém 6 a 8 átomos de cobre (ligados à apoceruloplasmina) Tem actividade enzimática: histaminase, cobre e ferro oxidase As mulheres apresentam valores mais elevados Valores elevados: gravidez, estados inflamatórios, doenças malignas, contraceptivos Valores baixos: doença de Wilson (defeito na incorporação de Cu na ceruloplasmina que fica menos estável diminuíndo a sua concentração), síndrome nefrótico, dieta pobre, síndrome de má absorção Proteínas plasmáticas - α 2 -globulinas α 2 -MACROGLOBULINA Sintetizada pelo fígado Inibidor de proteases Transportador de moléculas (IL-6, IL-2, insulina, factores de crescimento) As mulheres apresentam valores mais elevados Valores elevados: - contraceptivos, lesão hepática e diabetes Níveis elevados de α2-macroglobulina associados à diminuição de albumina acontecem na síndrome nefrótica. α2-globulinas Incluem a haptoglobina, a alfa-2-macroglobulina e a ceruloplasmina. Raramente se encontram alterações nesta banda eletroforética, já que a diminuição de um componente é compensada pelos demais. Níveis elevados de alfa-2-macroglobulina associados à diminuição da albumina acontecem na síndrome nefrótica. Os níveis de haptoglobina e de ceruloplasmina podem apresentar-se elevados em numerosas situações que levam à reacção de fase aguda.

6 Proteínas plasmáticas - β-globulinas β-globulinas TRANSFERRINA Sintetizada pelo fígado, sistema reticuloendotelial (em pequena quantidade), contém dois iões férricos Proteínas de fase aguda negativa Tempo de semi-vida de 7 dias Funções: - transporte de ferro - para os locais que armazenam ferro (apoferritina-ferritina) e para a medula óssea (hemoglobina) - impede a perda do ferro pelo rim - impede a deposição de ferro nos tecidos Diagnóstico diferencial das anemias e monitorização do tratamento Um aumento de ferro ligado à transferrina hemocromatose Valores baixos: inflamação, doenças malignas Valores elevados: anemia por deficiência em ferro Proteínas plasmáticas - β-globulinas PROTEÍNA C REACTIVA Sintetizada pelo fígado Proteínas de fase aguda Não é detectável em indivíduos saudáveis Na electroforese aparece entre a região da γ lenta e a β Pode iniciar a opsonização, fagocitose e lise celular como resposta à reacção inflamatória Valores elevados: - febre reumática - infecções bacterianas COMPLEMENTO Conjunto de proteínas que participam na reacção imune Circulam na forma de precursores não funcionais Valores elevados: estados inflamatórios Valores baixos: - má nutrição - lupus eritomatoso - coagulopatias intravasculares disseminadas Beta-lipoproteínas (LDL)

7 Proteínas plasmáticas - β-globulinas B-globulinas Composta pelas beta-lipoproteínas (LDL), transferrina, C3 e outros componentes do complemento, beta-2-microglobulina e antitrombina III. A redução dessa banda não é frequente. Está frequentemente elevada nos casos de icterícia obstrutiva e menos frequentemente em alguns casos de hepatite. Quase sempre, está elevada nos casos de cirrose hepática. Nesses casos, pode aparecer junto com sobreposição ou fusão das bandas beta e gama pelo aumento de IgA, que ocorre nas cirroses hepáticas, infecções de pele ou trato respiratório e na artrite reumatóide. Elevações causadas provavelmente pelo aumento dos componentes do complemento podem ocorrer em hipertensão maligna, doença de Cushing, poliarterite nodosa e carcinomas. A anemia por deficiência de ferro leva ao aumento da transferrina. O hipotireoidismo, a cirrose biliar, as nefroses e alguns casos de diabetes mellitus podem se evidenciar pelo aumento de colesterol e consequente aumento das beta-lipoproteínas (LDL). Proteínas plasmáticas - γ-globulinas IMUNOGLOBULINAS Ig A, Ig G, Ig E, Ig M, Ig D γ-globulina Características das imunoglobulinas Classe Cadeia pesada Conc. sérica média (g/l) IgG γ 14,0 IgA α 3,5 IgM µ 1,5 IgD δ 0,03 IgE ε Vestígios Função anticorpo que existe em maior quantidade na resposta imune secundária secretado como um dímero anticorpo que existe em maior quantidade nas secreções mucosas (ex.:saliva, muco bronquial) secretado como um pentamero anticorpo que existe em maior quantidade na resposta imune primária presente na superfície dos linf. B anticorpo envolvido no reconhecimento antigénico? presente na superfície dos mastócitos e basófilos provável papel na imunidade contra helmintas e associado com reacções de hipersensibilidade imediata

8 Proteínas plasmáticas - γ-globulinas IMUNOGLOBULINAS (cont.) As imunoglobulinas são constituídas por duas cadeias H (pesadas) e duas L (leves) ligadas por pontes dissulfureto. Diferenças na cadeia H - IgA, IgG, IgE, IgM e IGD As cadeias leve são só de dois tipos: K, λ o recém-nascido não sintetiza IgG, mas esta atravessa a placenta IgA é mais elevada nos homens IgM e IgG são mais elevadas nas mulheres IgE depende da condição alérgica do indivíduo As imunoglobulinas derivadas da proliferação de um único clone designase por imunoglobulina monoclonal Proteínas plasmáticas - γ-globulinas IMUNOGLOBULINAS (cont.) HIPOGAMAGLOBULINEMIA - causas fisiológicos: à nascença a concentração de IgA e IgM é baixa e a IgG diminui (IgG maternos) - causas patológicas: deficiências congénitas (doença de Bruton); deficiências adquiridas (doenças hematológicas, ex.: leucemias linfática crónica; estados de perda de proteínas, ex.: síndroma nefrótico) HIPERGAMAGLOBULINEMIA - causas fisiológicos: infecção aguda ou crónica - causas patológicas: doenças autoimunes (doença reumatóide e lupus eritomatoso sistémico) e doenças hepáticas graves (algumas tendo por base uma doença autoimune) PARAPROTEÍNAS É uma imunoglobulina produzida por um único clone de células da série dos linfócitos (normalmente plasmócitos). São moléculas idênticas (aparece um pico discreto na electroforese)

9 Proteínas plasmáticas - γ-globulinas IMUNOGLOBULINAS (cont.) PARAPROTEÍNAS (cont.) Aparece, por exemplo: - Mieloma múltiplo - proliferação maligna disseminada de células plasmáticas (IgG e IgA) - Leucemia linfática crónica (IgM) - Fisiológico - aumenta com a idade PESQUISA LABORATORIAL - Electroforese de proteínas: essencial para a detecção de paraproteínas - Pesquisa na urina: 20% dos mielomas, o tumor produz apenas as cadeias leves que são rapidamente excretadas para a urina (não detectadas no soro) - proteínas de Bence Jones - As proteínas de Bence Jones precipitam a 45-60ºC, mas redissolvem-se pela ebulição Proteínas plasmáticas - Análise quantitativa e semiquantitativa Muito complicado e demorado Mais usado

10 Proteínas plasmáticas - Análise quantitativa e semiquantitativa Valores de referência para as proteínas sérica: g/l Proteínas plasmáticas - Análise quantitativa e semiquantitativa

11 Proteínas plasmáticas - Análise quantitativa e semiquantitativa Proteínas plasmáticas - Análise quantitativa e semiquantitativa

12 Proteínas plasmáticas - Técnicas de separação de proteínas Técnicas de separação de proteínas ELECTROFORESE Há separação das proteínas num suporte sólido (normalmente acetato de celulose e agarose), de acordo com as suas características de carga eléctrica. No final temos 5 fracções: Albumina (fracção mais negativa), α 1 -globina, α 2 -globina, β-globina e γ-globina (fracção menos negativa) preparação da tira de acetato de celulose Colocar uma tira num recipiente com tampão (ph=9). Deve-se deixar embeber lentamente a tira e depois mergulha-la no tampão durante, no mínimo, 10 minutos. preparação da tina de electroforese Colocar em cada recipiente da tina (marcados com + e -) cerca de 150 ml de tampão. preparação do aplicador e aplicação Numerar, em primeiro lugar, de 1 a 8 as referências de trabalho. Encher os poços base do aplicador da direita para a esquerda, fazendo coincidir a sua numeração com a numeração da lista de trabalho. O soro 1 é então colocado no 1º poço do lado direito. Encher cada um dos 8 poços da base do aplicador com cerca de 18 µl de soro, de cada um dos pacientes. Proteínas plasmáticas - Técnicas de separação de proteínas ELECTROFORESE (cont.) Retirar a tira do tampão e coloca-la suavemente entre duas folhas de papel de filtro de forma a retirar o excesso de tampão. Depois, colocar a tira, bem estirada, na ponte. aplicação e migração Colocar a ponte com a tira na Tina de electroforese (migração: - +). Colocar o aplicador na base que tem os soros. Premir o botão suave e lentamente para que os pentes mergulhem nas amostras. Esperar durante segundos. Levantar lentamente o botão para permitir que o soro em excesso caia dos pentes. Fazer a aplicação na tira premindo o botão durante 10 a 15 segundos, levantando-o lentamente ao fim desse tempo. Fazer esta aplicação 2 vezes. Atenção: a aplicação é feita no lado negativo. Colocar a tampa da Tina e ligar a fonte de alimentação regulando-a para 225 V durante 20 minutos. Vai ocorrer amigração e a separação das proteínas. Lavar de imediato o aplicador (para o soro não secar nos pentes) mergulhando os pentes na água do recipiente de lavagem e fazendo 5 a 10 aplicações em papel absorvente ou lavar os pentes com água corrente e depois com água destilada. Deixar secar à temperatura ambiente. Lavar a base com os soros com água destilada e secar com uma toalha.

13 Proteínas plasmáticas - Técnicas de separação de proteínas ELECTROFORESE (cont.) coloração e transparentização Após 20 minutos de separação, desligar a fonte de alimentação e seguir os seguintes passos: Coloração: colocar a tira num recipiente com corante, deixando embebe-la primeiro na superfície e depois mergulha-la durante 10 minutos. Lavagem: efectuar 3 lavagens sucessivas da tira com solução de lavagem. Deixar ficar cerca de 2 minutos + 2 minutos + 3 minutos em cada recipiente de lavagem. Transparentização: colocar a tira num recipiente com o transparentizador durante 3 minutos. Secagem: colocar a tira sobre uma lâmina de vidro, usando as mãos protegidas com umas luvas. Com outra lâmina de vidro passar sobre a primeira para retirar bolhas de ar e fixar melhor à lâmina, usando-a também para cortar o excesso de tira. Levar à estufa a 80ºC durante 5-10 minutos. Depois de retirar a lâmina da estufa, deixar arrefecer à temperatura ambiente. Não por os dedos nem encostar nada às zonas de migração. Qualquer mancha provoca erros de leitura. Proteínas plasmáticas - Técnicas de separação de proteínas Valores de referência: Percentagem (%): Valor absoluto (g/l): Albumina: Alfa-1: 2,5 5,0 1 4 Alfa-2: 7,0 13, Beta: 8,0 14, Gama: 12,0 22,0 5 16

14 Proteínas plasmáticas - Técnicas de separação de proteínas Electroforese das proteínas no soro e correlação patológica E: - diminuição da capacidade de sintetizar albumina e aumento da excreção - compensação dada pelo aumento da gamaglobulinas (manter a pressão oncótica) - continuidade entre β e γ dada pela IgA F: - secreção feita pela proliferação monoclonal de plasmócitos - normalmente sem estar presente a quantidade normal de Ac. policlonais (células normais são substituídas por um clone maligno) Proteínas plasmáticas - Técnicas de separação de proteínas Electroforese das proteínas no soro e correlação patológica (cont.) D: - existe uma quase completa ausência da fracção gama Ex.: - ocorre normalmente em neonatais antes da maturação do sistema imune - após quimioterapia para erradicação de alguma malignidade H: - diminuição da maioria das fracções (diminuição da síntese e aumento da excreção das proteínas de baixo peso molecular) - contudo a fracção α 2 pode estar relativamente aumentada devido à coexistência de uma resposta de fase aguda (haptoglobulina) ou preferencialmente uma retenção de moléculas grandes (α 2 -macroglobulina)

15 Proteínas plasmáticas - Técnicas de separação de proteínas Outras técnicas de separação de proteínas ELECTROFORESE E IMUNOFIXAÇÃO Proteínas plasmáticas - Técnicas de separação de proteínas Outras técnicas de separação de proteínas ELECTROFORESE EM DUAS DIMENSÕES FOCAGEM ISOELÉCTRICA PRECIPITAÇÃO SEPARAÇÃO EM COLUNA