Eletroforese em Agarose Geral

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1 Eletroforese em Agarose Geral Compilado pelo Controle de Qualidade Bioquímica Outubro de 99 CELM - Cia. Equipadora de Laboratórios Modernos Alameda Amazonas, Alphaville - Barueri - SP CEP Fone: (0XX11) Fax: (0XX11) Fax Vendas: (0XX11) SACC: Visite nossa home page sacc@celm.com.br

2 CELMGEL Filme de Agarose Geral Proteinograma Lipidograma Alb. α1 α2 β γ (β1+β2) α Pré-β β

3 ÍNDICE PROTEINOGRAMA 4 Fracionamento de proteínas 4 Zona Pré-Albumina 6 Zona Albumina 6 Interzona Albumina-Alfa-1 6 Zona Alfa-1-Globulina 6 Zona Alfa-2-Globulina 7 Zona -Globulina 7 Zona Gama 8 Interpretação do Traçado Eletroforético 9 Processo inflamatório: 10 Agudo 10 Crônico 10 Hepatites e Cirrose hepática: 11 Perdas Protéicas: 11 Síndrome Nefrótica: 12 Alterações das globulinas 12 Hipogamaglobulinemias 12 Gamopatias monoclonais 13 Gamopatias policlonais 13 LIPIDOGRAMA 14 Introdução 14 Hiperlipoproteínemias hereditárias 16 Eletroforese de lipoproteínas 19 REFERÊNCIAS 24 Página 3

4 PROTEINOGRAMA Fracionamento de proteínas A análise de quadro protéico-plasmático é de particular interesse em bioquímica clinica, devido aos importantes progressos acumulados nos últimos anos sobre as características físico-químicas e estruturais das proteínas humanas. Somam-se a esses aspectos as propriedades fisiológicas e o significado clínico de numerosas proteínas plasmáticas que, devido à continua evolução metodológica de suas qualificações e quantificações, têm permitido auxiliar no diagnóstico de várias alterações patológicas que refletem no conteúdo das proteínas plasmáticas. Entre os métodos de qualificação e quantificação dessas proteínas destaca-se a eletroforese, que se tem tornado um importante meio auxiliar de diagnóstico na maioria dos laboratórios clínicos. A eletroforese permite uma avaliação aproximada das concentrações de várias proteínas importantes, cujas alterações estruturais, seja de regulação de suas sínteses, ou de seu maior consumo, podem refletir nas suas mobilidades eletroforéticas ou nas suas concentrações. Entre os meios disponíveis para o fracionamento das proteínas nos laboratórios clínicos, podemos citar as eletroforeses em acetato de celulose e em agarose. Os meios que incluem eletroforese em papel de gel de amido não são mais empregados na rotina laboratorial, devido à pouca sensibilidade analítica do papel, ou à dificuldade da preparação do gel, além do excessivo tempo de corrida. As eletroforeses em gel de poliacrilamida e as de altas resoluções ainda apresentam muitas dificuldades na interpretação de leitura de suas inúmeras frações. Dessa forma, consideramos apenas os dois primeiros meios. A eletroforese em agarose produz melhor resultado no processo de fracionamento que o acetato de celulose. Ambos os meios permitem que proteínas com peso molecular acima de 10 6 daltons se movam livremente de acordo com sua carga. Convencionalmente, a eletroforese de proteínas dos fluídos biológicos é realizada entre ph 8,5 e 9,5 que, com exceção das imunoglobulinas, migram para o ânodo (pólo positivo). A mobilidade catódica das gama-globulinas se deve a um fluxo do tampão, na direção do ânodo para o cátodo (pólo negativo), que ocorre no próprio suporte de separação. Este fenômeno denominado eletroendosmose, depende sobretudo da carga fixada pelo suporte e da composição iônica do tampão. O desenvolvimento tecnológico dos meios de suporte em agarose e acetato de celulose tem permitido a elaboração de materiais com alta sensibilidade de fracionamento, que podem ser agrupados em três níveis de qualidade técnica, classificados de 1 a 3. O nível 1 é a tradicional separação microzonal, adequado a determinação quantitativa por densitometria das cinco zonas classificadas por albumina, alfa 1, alfa 2, beta e gama-globulina (Fig. 1). O nível 2 é dotado de uma maior capacidade resolutiva devido a uma melhor exploração densitométrica que, por meio da projeção televisiva de imagens bidimensionais, permite evidenciar diversas proteínas que fazem parte das cinco zonas eletroforéticas. O nível 3, por fim, é obtido por tecnologia altamente desenvolvida para uma peculiar propriedade resolutiva de determinado tipo de acetato de celulose, o sistema Hi-Phore, elaborado pela Gelman Sciences. Esse sistema possibilita a identificação de doze proteínas plasmáticas: pré-albumina, albumina, alfa-lipoproteína, alfa-1-antitripsina, alfa-1-antiquimiotripsina, alfa-2-macroglobulina, haptoglobina, globulina insolúvel, transferrina, complemento C-3, fibrinogênio e imunoglobulina (Fig. 2). O nível 3, entretanto, é usado exclusivamente nas interpretações qualitativa e semiquantitativa conjuntamente, e deve ser associado aos métodos específicos de imunoquímica para as dosagens quantitativas. Todos esses três procedimentos descritos representam muito bem o momento de transição tecnológica da atualidade e oferecem condições técnicas adequadas às diferentes interpretações fisiopatológicas conforme a exigência de cada centro médico. Página 4

5 Pólo positivo Pólo negativo Figura 1 - Fracionamento eletroforético das proteínas séricas em gel de agarose, tampão tris-glicina ph 9,5. Separação das frações de albumina, alfa-1, alfa-2, beta e gama, do pólo positivo para o negativo. Notar a divisão da fração beta em duas subfrações distintas. Figura 2 - Representação esquemática da separação de proteínas plasmáticas por sistema Hi-Phore (Gelman Sciences). Fracionamento em doze bandas. Cerca de 100 tipos diferentes de proteínas plasmáticas foram identificadas até o presente utilizando-se técnicas sofisticadas e de alta sensibilidade. Entretanto, somente 10 a 12 tipos podem ser detectados pelas técnicas dos níveis 2 e 3, constituindo mais de 90% do conteúdo protéico do plasma - e por isso denominadas componentes determinantes das zonas do traçado eletroforético. Se empregarmos procedimentos de separação suficientemente resolutiva, estes componentes são evidenciáveis de tal forma que permitem o seu reagrupamento nas cinco ou seis zonas de traçado clássico. O aspecto mais importante da evolução desse estudo, acumulado nestes últimos anos, constituem em arranjar nomes, em termos reais, dos componentes protéicos identificados por meio da separação microzonal. Todavia, não conhecendo os seus componentes, as zonas foram identificadas por símbolos: alfa-1, alfa-2, beta e gama-globulinas; que, de certa forma, refletiam os significados fisiológicos e fisiopatológicos relacionados com as alterações qualitativa e quantitativa das frações protéicas separadas eletroforeticamente. Assim, ficou por conta do progresso tecnológico e dos conhecimentos científicos a identificação da maioria dos componentes plasmáticos agrupados nestas cinco zonas. Atualmente as eletroforeses de nível 1, em meio de agarose e acetato de celulose, podem identificar de 7 a 8 zonas de componentes protéicos plasmáticos extraídas do soro, desde que as mesmas sejam realizadas com rigor técnico, drogas de boa proveniência, agarose e acetato de celulose de boa qualidade e aparelhos de boa sensibilidade. Esses componentes são identificados nominalmente em sete zonas: pré-albumina, albumina, interzona albumina-alfa-1, alfa-1-globulina, alfa-2-globulina, beta-globulina e gama-globulina. Página 5

6 Zona Pré-Albumina Esta zona se caracteriza por uma banda fraca e espalhada, com velocidade migratória maior que a albumina e é constituída de uma única proteína denominada pré-albumina. Sua concentração normal é de mg/dl e sua função é o transporte do hormônio tireóideo. O significado clínico dessa proteína não está correlacionado com a propriedade fisiológica: a sua diminuição se observa nos processos inflamatórios agudos de etiologia diversa, porém, mais interessante é a diminuição precoce e marcante que se associa à insuficiência funcional das células hepáticas. Assim, a pré-albumina é um indicador hepato-celular de mais utilidade que a albumina, cujas modificações são constantes e tardias. A diminuição da pré-albumina é facilmente evidenciável no traçado eletroforético pois se traduz no desaparecimento da fração correspondente, mesmo que esta diminuição seja de intensidade moderada, uma vez que em condição normal sua concentração já é baixa. Zona Albumina Corresponde à proteína do mesmo nome. De fato, a característica físico-química, a propriedade fisiológica e o significado clinico desta proteína são conhecidos há muito tempo. A concentração normal é 3,2 a 5,0 g/dl. As principais funções são: a atividade osmótica plasmática e a função de transporte específico do material resultante de várias substâncias endógenas e exógenas, bilirrubina, ácidos graxos, cálcio, corantes e fármacos. A união com algumas destas substâncias (bilirrubina, fármacos) modifica a carga elétrica da albumina, e isto se evidencia no traçado eletroforético por meio de um alongamento da fração em direção anódica (albumina rápida): este fenômeno, em condições de sobrecarga da função de transporte, pode causar o desdobramento da fração de albumina. Além desta alteração de migração, a análise quantitativa desta proteína tem importante significado clínico pois a sua diminuição pode estar relacionada a um defeito de sua síntese hepática (nas hepatopatias graves crônicas), ou a perdas renal (na síndrome nefrótica), intestinal (enteropatias protideodispersivas) e cutânea (queimaduras extensas). Também se observa a diminuição de albumina nos processos inflamatórios agudos, por aumento da permeabilidade capilar e em situações de subnutrição, má absorção e caquexia neoplásica. Apesar de vários fatores terem influência no metabolismo da albumina, a hipoalbuminemia é freqüentemente uma evidência tardia, especialmente nas hepatopatias. Devido à considerável intensidade da coloração da fração correspondente, a hipoalbuminemia é evidenciável no traçado eletroforético somente quando o grau de diminuição é marcante e sua concentração próxima de 2,5 g/dl. Interzona Albumina-Alfa-1 O espaço que separa a fração de albumina daquela da alfa-1-globulina não revela, em condições normais, a presença de alguma proteína, aparecendo um espaço totalmente claro. Na realidade migram nesta zona duas proteínas de importância clínica: a alfa-feto-proteína e a alfa-lipoproteína. Ambas não são visíveis em condições fisiológicas normais: a primeira, devido à sua concentração muito baixa; e a segunda, pela baixa afinidade aos corantes de proteínas utilizados correntemente. Estas proteínas quando analisadas por técnicas de nível 3, podem ser evidenciadas em determinadas condições patológicas; por exemplo: a alfa-lipoproteína está aumentada no alcoolismo crônico, na subnutrição ou nas hepatopatias graves. É importante recordar que a alfa-feto proteína está elevada fisiologicamente no soro de recém-nascidos. Zona Alfa-1-Globulina Apesar de outras proteínas migrarem nesta zona, em prática a alfa-1-antitripsina (limite normal mg/dl) é a única proteína responsável pela coloração da alfa-1-globulina. Esta proteína é o componente mais importante entre os inibidores de proteases, termo que compreende um grupo de proteínas que têm a função de neutralizar as atividades das enzimas proteolíticas, seja de natureza bacteriana ou leucocitária, durante um processo inflamatório agudo. Desta forma, sua síntese é estimulada durante a resposta inflamatória aguda. O aumento da alfa-1-antitripsina é particularmente característico das hepatopatias crônicas e agudas em fases não muito avançadas, no entanto tende à diminuição nas fases terminais da cirrose; o aumento todavia se observa nos casos de hiperestrogenismo. Por outro lado, a deficiência hereditária da alfa-1-antitripsina, que se traduz pela ausência da zona alfa-1 na eletroforese, é devido a uma variante genética caracterizada por uma concentração plasmática muito baixa na forma de homozigose: esta alteração hereditária causa graves lesões fibrosantes do tecido pulmonar (enfisema na fase de adolescência e em adultos jovens), ou cirrose hepática na infância. A forma heterozigota da deficiência hereditária de alfa-1-antitripsina se revela eletroforeticamente pelo desdobramento da fração alfa-1-globulina. Da mesma forma, como ocorre em outras alterações das proteínas plasmáticas, a eletroforese é o único meio que permite evidenciar a deficiência hereditária da alfa-1- antitripsina, que não se associa a nenhuma sintomatologia (na forma heterozigota) mas é importante sob o ponto de vista preventivo. É necessário salientar que o desdobramento da fração alfa-1 é verificado na análise visual do traçado eletroforético, uma vez que a análise por densitometria nem sempre detecta esta alteração. Página 6

7 Como foi dito no início, a zona alfa-1-globulina compreende outras proteínas alem da alfa-1-antitripsina das quais é de particular interesse clínico a alfa-1-glicoproteína ácida. Essa proteína é o principal componente da mucoproteína de Winzler, e o aumento de sua concentração (40-90 mg/dl em indivíduos normais) não contribui para elevar o nível quantitativo da zona alfa-1. Este fator decorre da fraca fixação do corante devido ao elevado conteúdo de carboidrato na sua estrutura. Esta proteína não é um inibidor das proteases, mas aumenta consideravelmente nos processos inflamatórios agudos. Um outro inibidor das proteases que também faz parte da zona alfa-1-globulina é a alfa-1- antiquimiotripsina. Esta proteína de baixa concentração em condições normais, mas que aumenta visivelmente e com muita rapidez na fase inflamatória aguda, é facilmente identificada por técnicas do nível 3. Zona Alfa-2-Globulina Essa zona é determinada por duas proteínas: a alfa-2-macroglobulina - com mobilidade maior - e a haptoglobina. Esta última proteína pode variar de posição na mobilidade eletroforética por causa de sua heterogeneidade molecular. Assim, a estrutura da haptoglobina depende de duas cadeias peptídicas de diferentes dimensões e, por isso, pode dar origem a três combinações fenotípicas diferentes: o tipo 1-1, de menor dimensão molecular, possui maior velocidade de migração sobrepondo-se, inclusive, à banda da alfa-2- macroglobulina; o tipo 2-1, de dimensão intermediária, aparece no traçado como uma banda larga e dispersa que cobre toda a área alfa-2; e o tipo 2-2, quando presente, separa-se nitidamente da alfa-2-macroglobulina. A alfa-2-macroglobulina, apesar de fazer parte dos inibidores de proteases, apresenta pouco interesse clínico nos dias atuais. A sua concentração (100 a 250 mg/dl no adulto normal) está mais elevada nos períodos infantil e senil. Seu aumento fisiológico ocorre por retenção seletiva e na síndrome nefrótica. A sua diminuição pode ser observada nas hepatopatias crônicas de fase avançada - pois sua síntese ocorre no fígado, e algumas vezes nas condições de fibrinólise por hiperconsumo. Mais interessante sob o ponto de vista clínico é a haptoglobina (limite normal de 40 a 170 mg/dl) uma vez que suas funções são bem conhecidas: a haptoglobina forma um complexo protéico com a hemoglobina livre plasmática que é removido, posteriormente, por fagocitose realizada por células retículo-endoteliais. Nas síndromes hemolíticas ocorre marcante diminuição das haptoglobinas podendo, por isso, ser utilizada como um sensível índice de hemólise. O interesse clínico das haptoglobinas não se resume as descrições acima, uma vez que esta proteína é um dos fatores da fase aguda, aumentando consideravelmente no curso dos processos inflamatórios agudos. Zona -Globulina Duas proteínas compõem esta zona no traçado eletroforético com acetato de celulose: a transferrina e o componente C-3 do sistema de complemento. A adição de cálcio à solução tampão causa nítida separação dessas duas proteínas. A transferrina ( mg/dl) é sintetizada nas células hepáticas e sua função é o transporte do ferro plasmático: o seu aumento é a expressão de um estado de carência de ferro. É importante destacar que a síntese de transferrina, embora sensível à ação dos hormônios estrogênicos, não apresenta aumento fisiológico na gravidez e no tratamento anticonceptivo. A diminuição de transferrina se observa nas hepatopatias crônicas. O significado funcional do componente C-3 do complemento ( mg/dl) é bem conhecido, pois atua como um medidor em numerosas reações imunitárias; a sua diminuição é a expressão do consumo de ativação da complexa seqüência dos fatores complementares. O C-3 participa também da resposta aos processos inflamatórios agudos, com aumento de sua concentração na fase tardia desses processos. É importante recordar que além dessas duas proteínas fundamentais pode-se observar outras proteínas, entre elas, a beta-lipoproteína, que não e evidenciada na eletroforese em acetato de celulose, devido à escassa afinidade por corantes protéicos e pela dispersão durante a migração. Finalmente, pelo fato desta zona se encontrar vizinha à zona gama, não é raro que a mesma seja encoberta pelas bandas monoclonais. Página 7

8 Zona Gama Se confrontarmos os resultados da dosagem imunoquímica específica, dos componentes do traçado, com a dosagem densitométrica da zona eletroforeticamente correspondente, observa-se que a zona albumina e gama-globulina (gama-g) são as únicas zonas cujas dosagens densitométricas se relacionam satisfatoriamente com a dosagem imunoquímica da albumina e da imunogama-globulina (IgG), respectivamente. De fato, a zona gama-g, que compreende todas as classes imunoglobulínicas, é expressão da IgG. A heterogeneidade molecular que caracteriza a imunoglobulina não impede a migração na forma de uma banda compacta. Esta característica permite distinguir as bandas monoclonais as quais, ao invés de serem estruturas homogêneas, se apresentam como bandas restritas. Essas bandas se dispersam em uma zona mais ou menos ampla, que pode estender-se sobretudo pela lga, da zona gama-g até a zona alfa-2- globulina. Essa dispersão não diminui notavelmente quando a fração é corada. Portanto, na prática, a larga banda corada que se vê caracterizando a zona gama-g exprime, sobretudo, a IgG. Página 8

9 Interpretação do Traçado Eletroforético Na maior parte das condições patológicas que envolvem as proteínas plasmáticas, as alterações abrangem não apenas uma determinada proteína mas um grupo razoavelmente amplo dos componentes protéicos, dando lugar a quadros mais característicos dos processos fisiopatológicos. Assim, as análises eletroforéticas mantêm uma posição de considerável utilidade clínica oferecendo a possibilidade de uma interpretação mais correta do quadro, especialmente quando se considera conjuntamente informações clínicas adequadas. Para fazer uma correta interpretação dos resultados obtidos no traçado eletroforético é necessário ter conhecimento dos seus valores normais (Tabela 1) bem como conhecer as variações fisiológicas que ocorrem com as proteínas séricas no recém-nascido e na primeira infância (Tabela 2). Com esses valores em mãos, pode-se observar a seguir viários processos patológicos que influenciam no traçado eletroforético do proteinograma. Tabela 1 - Valores normais das concentrações de proteínas séricas. % g/dl Proteínas totais 100 6,0 a 7,8 Albumina 50 a 63,0 3,2 a 5,0 Alfa-1 2,5 a 5,7 0,2 a 0,4 Alfa-2 5,8 a 13,0 0,5 a 9,0 8,5 a 14,7 0,6 a 1,1 Gama 11,8 a 20,2 0,7 a 1,5 Tabela 2 - Variações das proteínas plasmáticas no recém-nascido e na primeira infância. Proteína Pré-Albumina Albumina Alfa-1-glicoproteína ácida Alfa-1-antitripsina Alfa-2-macroglobulina Haptoglobina Transferrina Complemento C-3 Fibrinogênio IgG lga IgM Concentração aumentado normal ou diminuído muito diminuído normal ou diminuído muito aumentado muito diminuído diminuído diminuído normal normal muito diminuído muito diminuído Página 9

10 Processo inflamatório: Agudo Observa-se um aumento nas seguintes proteínas: alfa-1-glicoproteína ácida, alfa-1-antitripsina, alfa-1-antiquimiotripsina, haptoglobina, fibrinogênio e proteína C-reativa. Há uma diminuição da albumina e da transferrina. Assim, no traçado eletroforético pode-se perceber uma diminuição na albumina, e um aumento de alfa -1 e alfa-2. Crônico Neste processo observa-se um perfil parecido com do processo agudo, porém com aumento da fração gama, à medida que ocorre a cronificação do processo. Página 10

11 Hepatites e Cirrose hepática: A proteína de fase inflamatória aguda se modifica de forma anormal nos processos inflamatórios hepáticos: na hepatite do tipo B (gráfico) não se observa aumento da proteína C-reativa, porém aumenta a alfa-1-antitripsina, enquanto a alfa-1-glicoproteína ácida permanece próxima dos valores normais e a haptoglobina diminui. Este quadro não se observa na hepatite do tipo A, onde as proteínas da fase aguda aumentam uniformemente, da mesma forma como se observa nos processos inflamatórios. Perdas Protéicas: Nestes casos, existe uma diminuição em todas as proteínas, mas a maior alteração se dá na albumina, a qual tem sua diminuição bastante pronunciada. O mesmo traçado pode ser observado em casos de queimaduras graves. Página 11

12 Síndrome Nefrótica: A perda de grande volume de albumina pelos rins é denominada síndrome nefrótica. Essa síndrome é caracterizada por: hipoproteinemia, hipoalbuminemia, edema, lipidúria, hiperlipemia e proteinúria. Esta síndrome pode ser causada por numerosas condições, incluindo diabetes mellitus, doença vascular do colágeno, doença glomerular e doença circulatória. É caracterizada, também, por perda de albumina e outras proteínas de baixo peso molecular (por exemplo: transferrina e alfa-1-antitripsina) e um aumento associado de algumas proteínas de grande peso molecular (por exemplo macroglobulina, IgM e lipoproteínas). O padrão eletroforético exprime um quadro singular a certas condições inflamatórias associadas com o aumento da globulina-alfa-2. Alterações das globulinas Hipogamaglobulinemias Observa-se uma diminuição na maioria, ou de todas as imunoglobulinas. Página 12

13 Gamopatias monoclonais Pode-se observar um pico homogêneo na região beta-gama. Um importante representante deste grupo é o mieloma múltiplo. Gamopatias policlonais Essa forma de alteração das proteínas plasmáticas representa um estado patológico secundário, caracterizado por um largo e difuso aumento na fração gama-globulina no processo eletroforético. Página 13

14 LIPIDOGRAMA Introdução As lipoproteínas do plasma sangüíneo são complexos macromoleculares de proteínas e lipídeos polares e triglicerídeos, como colesterol e seus ésteres. Os triglicerídeos e o colesterol não polares são encontrados no interior de uma camada de segmentos hidrofílicos, solúveis em água, das cadeias polipeptídicas e das regiões polares das moléculas de fosfolipídeos. Essa capa externa de natureza hidrofílica confere solubilidade em água a estas estruturas ricas em lipídeos. As lipoproteínas são bem adaptadas ao transporte dos lipídeos no sangue, do intestino aos depósitos de gorduras e tecidos em geral. A classificação das lipoproteínas plasmáticas é feita de acordo com as suas densidades, o que reflete o conteúdo lipídico. Quanto maior o conteúdo de lipídeos, menor será a densidade. a) Quilomícrons - São as maiores lipoproteínas e constituem gotículas quase puras de triglicerídeos, envolvidas por uma camada muito fina de proteína. Os quilomícrons transportam as gorduras e os esteróis do intestino delgado, onde são absorvidas durante a digestão, ate os depósitos de gorduras. A composição dos quilomícrons e algumas de suas características físicas são dadas na tabela 3. Eles são ricos em triglicerídeos e contêm geralmente menos de 2% de proteínas. As proteínas dos quilomícrons são encontradas na seguinte proporção: apoproteínas A (apo A-I e apo A-II) 12%; apoproteínas B 22%; apoproteínas C (apo C-I, apo C-II e apo C-III) 66%. Os quilomícrons sofrem a catabolização mais rápida de todas as lipoproteínas, sendo que nos seres humanos os seus triglicerídeos são removidos da circulação em menos de uma hora, em duas fases principais: hidrólise em regiões tissulares periféricas pela ação da lipase lipoprotéica presente no endotélio capilar; remoção, pelo fígado, das partículas restantes (vestígios de quilomícrons ricos em colesteril ésteres). b) Lipoproteínas de densidade muito baixa (VLDL) - Os triglicerídeos sintetizados endogenamente entram na circulação vindos do fígado (principal órgão de síntese de VLDL) e intestino (fonte secundária). As lipoproteínas de densidade muito baixa (VLDL) se assemelham aos quilomícrons na riqueza em triglicerídeos e na densidade inferior a 1,006 g/ml, mas diferem dos mesmos em relação à composição protéica bem rica e de menor tamanho. Assim como os quilomícrons, a VLDL libera os seus triglicerídeos para o tecido adiposo por uma interação com a lipase lipoprotéica na superfície endotelial. A composição das VLDL depende do tamanho das partículas. A proporção dos triglicerídeos e das apo-c é maior nas partículas grandes, enquanto nas partículas menores as proporções de fosfolipídeos e apo-b são maiores. O destino da partícula residual formada no catabolismo da VLDL, através de seu principal componente protéico, a apoproteína B, é a lipoproteína de baixa densidade (LDL) encontrada no plasma. c) Lipoproteínas de densidade intermediária (IDL) - Atualmente, as lipoproteínas que eram confundidas com as LDL constituem uma classe distinta que em ultra centrifugação analítica aparecem como uma região pequena, com pico diferente da LDL. Os lipídeos correspondem a 85% do peso das IDL, e o colesterol é o componente lipídico mais abundante. Embora apresente pequenas quantidades de apo-c e apo-e, a principal proteína da IDL é a apo-b. Ainda não se sabe se o processo de degradação das IDL ocorre no endotélio ou no fígado, mas os estudos metabólicos indicam que as lipoproteínas de densidade intermediária resultam do catabolismo de lipoproteínas ricas em triglicerídeos. Página 14

15 d) Lipoproteínas de baixa densidade (LDL) - Embora se saiba que a LDL seja do catabolismo da VLDL, acredita-se que ela também possa ser sintetizada pelo fígado. Os lipídeos que as LDL transportam, especialmente o colesterol, podem ser usados para a síntese da membrana plasmática. As lipoproteínas de baixa densidade são tidas como removidas irreversivelmente pelos tecidos periféricos. As LDL são menores que os quilomícrons e VLDL, mas a sua densidade é maior que a de 00ambas. As partículas de LDL são mais ricas em proteínas e mais pobres em triglicerídeos que os quilomícrons e VLDL. e) Lipoproteína de alta densidade (HDL) - São as lipoproteínas que apresentam a maior proporção de proteínas, em peso (cerca de 50%) e a menor proporção de triglicerídeos (cerca de 3%). O seu diâmetro é o menor encontrado nas lipoproteínas, mas a sua densidade é a maior. A composição lipídica das lipoproteínas de alta densidade (HDL) é formada por fosfolipídeos (42 a 51%), colesterol (30 a 40%) e triglicerídeos (6 a 12%). As apoproteínas A (apo A-I e apo A-II) correspondem a cerca de 90% do total, em peso, das proteínas componentes de HDL. As apoproteínas C constituem cerca de 5% e as apolipoproteínas D e outras compreendem os 5% restantes. A HDL liberada pelo fígado contém apoproteínas A e C recém sintetizadas, enquanto o intestino parece produzir apoproteína A. Possivelmente as HDL devem desempenhar um papel intermediário em conjunto com a enzima plasmática lecitina-colesterol acil-transferase (LCAT) na distribuição do colesterol para os tecidos. Tabela 3 - Composição química e características físicas de diferentes tipos de lipoproteínas. Composição Química Características Físicas TIPOS Proteínas (%) Triglicerídeos (%) Fosfolipídeos (%) Colesterol (%) Densidade (g/ml) Posição da migração eletroforética Quilomícrons 1,6 96 0,8 1,6 0,92 a 0,96 Local de aplicação da amostra VLDL ,95 a 1,00 Pré- LDL ,00 a 1,06 HDL ,06 a 1,21 Alfa-1 Página 15

16 Hiperlipoproteínemias hereditárias As hiperlipoproteinemias hereditárias foram descobertas, inicialmente, por uma de suas manifestações secundárias, a xantomatose (depósito de lipídeos na pele e tendões) e constituem um grupo de seis alterações que produzem aumento de colesterol do plasma ou da concentração de triglicerídeos. Acredita-se que cada uma dessas alterações tenha um mecanismo de herança monogênica. Contudo, a constatação de elevação do nível plasmático de lipídeos (hiperlipidemia) por si só não é suficiente para o diagnóstico de uma hiperlipoproteinemia (aumento da concentração de lipoproteínas) familiar. As deficiências genéticas de lipase lipoprotéica, hipercolesterolemia e hiperlipoproteinemia tipo 3 são, geralmente, caracterizadas nas anomalias clínicas e bioquímicas, dispensando a quantificação dos níveis de lipídeos e lipoproteínas do plasma. Por outro lado, a hipertrigliceridemia, hiperlipidemia combinada e hiperlipoproteinemia tipo 5 não apresentam manifestações clínicas e características bioquímicas exclusivas. Para distinção de hiperlipidemia de etiologia multifatorial e para o diagnóstico de uma alteração monogênica, precisa ser demonstrado: a) que a hiperlipidernia em questão é de origem hereditária; b) que a segregação entre os parentes afetados seja consistente com um padrão mendeliano. A combinação dos níveis do colesterol total do plasma, concentração de triglicerídeos e o aspecto do plasma após a incubação a 4 o C, por 18 horas ou mais (para detectar uma camada de aspecto cremoso, indicativa da presença de quilomícrons), pode ser sugestiva de um dos seis principais padrões lipoprotéicos anormais. Embora os padrões de lipoproteínas possam ser reduzidos pelos elementos indicativos da tabela 2, é útil a determinação do nível de colesterol LDL, após isolamento da LDL do plasma total por ultracentrifugação, quando o nível da VLDL do plasma se mostra elevado. A eletroforese do plasma total não tem se mostrado de utilidade geral na determinação dos diferentes padrões de lipoproteínas, mas a ultracentrifugação do plasma total, associada à eletroforese da fração de VLDL isolada, permite a identificação da VLDL (migração beta), característica de indivíduos com padrão lipoprotéico tipo 3. A figura 3 e a tabela 4 resumem as principais características dos cinco tipos de lipoproteinemias, cujos detalhes bioquímicos e genéticos são descritos a seguir: a) Deficiência Hereditária de Lipase Lipoprotéica Tipo 1 A lipase lipoprotéica (LLP) dos portadores desta síndrome rara tem a sua atividade catalítica diminuída, acarretando deficiência na remoção extra-hepática de lipoproteínas ricas em triglicerídeos do sangue. Os indivíduos portadores desta alteração mostram padrão lipoprotéico tipo 1, com quilomicronemia maciça acompanhada de níveis diminuídos de outras lipoproteínas. A ocorrência de hiperlipoproteinemia tipo 1 é muito rara, provavelmente com freqüência menor que um por um milhão. Ao ingerir uma dieta sem restrições, o paciente com a deficiência hereditária de lipase lipoprotéica (LLP) mostra hiperlipoproteinemia tipo 1, que não é marcador específico de uma única doença genética. A melhor forma de detecção da hiperlipoproteinemia é o aspecto do plasma após 18 horas ou mais a 4 o C. Os quilomícrons correspondem a uma película branca superior e a camada logo abaixo mostra-se clara devido ao aumento não considerável da VLDL. As concentrações de LDL e HDL estão, geralmente, abaixo do normal. Os triglicerídeos estão bastante aumentados (2.500 a mg/dl) e o colesterol não excede aos limites superiores da normalidade. A deficiência hereditária da lipase lipoprotéica ocorre geralmente em ambos os sexos e em mais de um membro da família, em caucasóides, negróides e mongolóides, e os dados acumulados sugerem um padrão de herança autossômica recessiva. Página 16

17 b) Hipercolesterolemia Hereditária Tipo 2a e Tipo 2b Apresentam elevação na concentração de colesterol plasmático, localizado na fração LDL (densidade 1,006 a 1,063 g/ml) e deposição de colesterol plasmático em alguns tecidos, como nos tendões (xantomas) e nas placas arteriais (ateromas). Os xantomas palpebrais (xantelasmas) podem ser comuns nos heterozigotos, mas são raros nos indivíduos homozigotos. Os xantomas aparecem nos heterozigotos em função da idade, demorando para se manifestar nos mesmos. No caso da hipercolesterolemia hereditária, uma única mutação gênica produz tanto o aumento na concentração de colesterol como arterosclerose. No homozigoto a evidência clínica de doença cardíaca ocorre invariavelmente antes dos 30 anos e nos heterozigotos é muito variável. Os resultados de estudos recentes mostram que a hipercolesterolemia familiar apresenta um padrão genético mendeliano autossômico dominante. Os indivíduos homozigotos são severamente afetados enquanto que os heterozigotos não. Evidências recentes sugerem a ligação do gene da hipercolesterolemia hereditária com o gene do complemento C3 e que o mesmo parece não estar muito ligado aos locus dos seguintes 14 marcadores genéticos: ABO, MN, Rh, Lutheran, Kidd, alfa 1 antitripsina, GM, Inv, haptoglobina, fosfoglicomutase, fosfatase ácida, transaminase do piruvato glutâmico e o antígeno betalipoproteína. A determinação direta da prevalência de hipercolesterolemia, na população em geral ainda não é conhecida, mas as estimativas sugerem que, no mínimo, 1 em cada 500 indivíduos caucasóides são heterozigotos para essa alteração genética. c) Hiperlipoproteinemia Hereditária Tipo 3 Caracteriza-se por apresentar lipoproteínas de composição normal, cujas principais são as beta- VLDL que diferem da VLDL normal na porção apoprotéica, além de mostrar maior proporção de colesterol, quando comparada ao triglicerídeo. A hiperlipoproteinemia hereditária do tipo 3, na forma primária tem interesse clínico porque mostra depósitos lipídicos incomuns (amarelados) nas cristas palmares e a alta tendência para as doenças vasculares. É uma forma relativamente rara de hiperlipidemia. A distinção desta alteração das outras formas de hiperlipidemia é feita classificando-se os pacientes pelos padrões lipoprotéicos. Os portadores de hiperlipoproteinemia familiar tipo 3 apresentam lipoproteínas na fração sobrenadante (densidade 1,006), com mobilidade eletroforética beta. Em eletroforese de amido, a beta- VLDL se separa da VLDL normal e a eletroforese do plasma mostra uma fração beta-larga. Nem todos os indivíduos que apresentam a fração beta-larga na eletroforese do plasma têm beta flutuante, o principal marcador de hiperlipoproteinemia familiar tipo 3. Esta alteração ainda aguarda testes definitivos para sua caracterização e de outros estudos para a elucidação do seu padrão de herança. d) Hipertrigliceridemia Hereditária Tipo 4 É uma alteração pouco compreendida em que os heterozigotos apresentam elevação do nível de triglicerídeo plasmático, de origem endógena, ligado à VLDL. Embora seja considerada como autossômica dominante, estudos adicionais devem caracterizar o padrão de herança, assim como fornecer subsídios para a identificação da hipertrigliceridemia hereditária por métodos bioquímicos e características clínicas. Algumas evidências indicam que a hipertrigliceridemia predispõe à doença coronária prematura, obesidade moderada, resistência a insulina, intolerância a glicose etc. A ingestão excessiva de álcool, ingestão de anticoncepcionais, dieta rica em carboidratos, desenvolvimento de hipotireoidismo ou diabetes mellitus, podem induzir os pacientes hipertrigliceridêmicos a exibir o padrão de lipoproteínas tipo 5, com o nível de triglicerídeos plasmáticos acima de mg/dl e partículas com a característica de flutuação dos quilomícrons. As observações têm mostrado que a expressão do gene é geralmente retardada nas crianças afetadas, até a idade de aproximadamente 20 anos. Página 17

18 e) Hiperliproteinemia Hereditária Tipo 5 Alguns indivíduos, com o padrão de lipoproteína tipo 4, podem ser induzidos por fatores ambientais como alcoolismo, stress, ingestão muito alta de carboidratos, diabetes mellitus pouco controlada, administração de estrógeno etc., a expressar o padrão de lipoproteína tipo 5. Para se considerar um paciente com hiperlipoproteinernia tipo 5, ele deve expressar o padrão típico, mesmo na ausência de qualquer fator ambiental. O padrão de herança desta alteração ainda não está completamente estabelecido. f) Hiperlipidemia Hereditária Combinada Não apresenta características clínicas bem estabelecidas, sendo a mais recente das hiperlipidemias familiares. Embora os dados disponíveis ainda sejam insuficientes, provavelmente os pacientes com hiperlipidemia hereditária combinada apresentem freqüência aumentada de obesidade, intolerância à glicose, doença coronária, hiperinsulinemia etc. A análise genética dos dados mostram consistência com um padrão de herança autossômica dominante, embora os mesmos ainda sejam insuficientes para confirmação, porque o único método disponível para se fazer o diagnóstico é encontrar vários membros afetados na mesma família. Página 18

19 Eletroforese de lipoproteínas Todas as frações lipídicas do plasma ou soro (fosfolípideos, colesterol e triglicerídeos) são transportadas pelo sangue combinadas com proteínas séricas conhecidas por Iipoproteínas. Através da eletroforese é possível separar quatro bandas principais de lipoproteínas: quilomícrons, beta, pré-beta e alfa (Fig.3). Os quilomícrons são grandes partículas de gordura (glicerídeos agrupados) que possuem um diâmetro de 100 a 1000 mµ. Numa pessoa normal, em jejum, o transporte de colesterol está principalmente a cargo das lipoproteínas beta; o transporte dos triglicerídeos ocorre por meio das lipoproteínas pré-beta. Os ácidos graxos livres circulam unidos com albumina, porém esta não é considerada uma lipoproteína. No sangue do cordão umbilical as concentrações de lipoproteínas são baixas. Como os lipoproteinogramas oferecem informações complementares para as análises químicas dos lipídeos séricos, em geral se faz ambos os métodos ao mesmo tempo. Uma vez que todas as anormalidades dos lipideos séricos produzem lipoproteinogramas séricos anormais, e tendo estabelecido correlações entre lipoproteinograma mais ou menos específicos com a cardiopatia coronária no ser humano, a técnica de eletroforese resultou em uma análise auxiliar para reconhecer casos potenciais ou reais de grave vasculopatia arterioesclerótica (hereditária e adquirida). 5. A figura 3 mostra os diferentes traçados densitométricos nas lipoproteinemias dos tipos 1, 2a, 2b, 3, 4 e Página 19

20 Alfa Pré- Quilomícron Lipoproteinemia do tipo 1 Deficiência hereditária de lipase lipoprotéica Alfa Pré- Lipoproteinemia do tipo 2a Hipercolesterolemia hereditária Alfa Pré- Lipoproteinemia do tipo 2b Hipercolesterolemia hereditária Alfa Pré- Lipoproteinemia do tipo 3 Hiperlipoproteinemia hereditária Alfa Pré- Alfa Pré- Quilomícron Lipoproteinemia do tipo 4 Hipertrigliceridemia hereditária Lipoproteinemia do tipo 5 Hiperlipoproteinemia hereditária Figura 3 Traçados densitométricos das frações de lipoproteínas alfa, pré-beta e beta nas lipoproteinemias dos tipos 1, 2a, 2b, 3, 4 e 5, (traçados tracejados), em comparação com o traçado normal. Página 20

21 Tabela 4 Características dos diferentes tipos de hiperlipoproteinemias. Hiperlipoproteinemia Tipo 1 Origem Hiperlipidemia exógena devido à deficiência de lipase lipoproteína Definição Gordura hereditária induzida por hiperlipidemia Idade Geralmente abaixo de 10 anos Aspecto do plasma Cremoso Colesterol sérico Normal ou discretamente aumentado Triglicerídeos sérico Aumentado, acima de 2000 mg/dl Eletroforese Figura 3 Quilomícron Aumento acentuado Normal ou diminuído Pré-beta Normal ou diminuído Alfa Diminuído Outros dados Sangue com aspecto de "creme de tomate" Lipemia retinal Hepatoesplenomegalia Xantomas Dor abdominal Relação triglicerídeos/colesterol 8 Prevalência Raríssima Hiperlipoproteinemia Tipo 2a Origem Indefinida Definição Hiperbetalipoproteinemia (hipercolesterolemia) Idade Ainda não está bem estabelecida Aspecto do plasma Claro Colesterol sérico Aumentado, entre 300 e 600 mg/dl Triglicerídeos sérico Normal Eletroforese Figura 3 Quilomícron Ausente Aumentado Pré-beta Normal Alfa Normal Doenças principais Mixedema Nefrose Doença hepática obstrutiva Stress Porfiria Anorexia nervosa Hipercalcemia idiopática Relação triglicerídeos/colesterol 1 Prevalência Relativamente comum Página 21

22 Tabela 4 Continuação Hiperlipoproteinemia Tipo 2b Origem Tolerância aumentada à lipidemia Definição Hiperlipidemia combinada, ou mista Idade Ainda não está bem estabelecida Aspecto do plasma Claro para turvo Colesterol sérico Aumentado, entre 300 e 600 mg/dl Triglicerídeos sérico Aumentado, maior ou igual a 400 mg/dl Eletroforese Figura 3 Quilomícron Ausente Aumentado Pré-beta Aumentado Alfa Normal Doenças principais As mesmas do tipo 2a Relação triglicerídeos/colesterol Variável Prevalência Relativamente comum Hiperlipoproteinemia Tipo 3 Origem Indefinida Definição Hipergliceridemia carboidrato-induzida, com hipercolesterolemia Idade Acima de 25 anos Aspecto do plasma Claro, turvo ou leitoso Colesterol sérico Aumentado, entre 300 e 1000 mg/dl Triglicerídeos sérico Aumentado, entre 200 e 1000 mg/dl Eletroforese Figura 3 Quilomícron Ausente Aumentado (ligado à pré-beta) Pré-beta Aumentado Alfa Normal Doenças principais Mixedema Disgamaglobulinemia Doença hepática Relação triglicerídeos/colesterol 2 Outros dados Hiperglicemia Tolerância à glicose: anormal Aumento do ácido úrico Prevalência Rara Página 22

23 Tabela 4 Continuação Hiperlipoproteinemia Tipo 4 Origem Hiperlipidemia endógena Definição Hipergliceridemia carboidrato-induzida sem hipercolesterolemia Idade Adultos e, ocasionalmente, em crianças Aspecto do plasma Claro, turvo ou leitoso Colesterol sérico Normal ou discretamente aumentado Triglicerídeos sérico Aumentado, entre 500 e 1500 mg/dl Eletroforese Figura 3 Quilomícron Ausente Normal; pode ter aumento Pré-beta Aumentado Alfa Normal Doenças principais Síndrome nefrótica Hipertireoidismo Alteração no armazenamento de glicogênio Relação triglicerídeos/colesterol 1 a 5 Outros dados Ocorrência de hiperlipoproteinemia na gravidez Ácido úrico aumentado Tolerância à glicose: anormal Prevalência Muito comum Hiperlipoproteinemia Tipo 5 Origem Hiperlipidemia mista, de causas endógena e exógena (combinação dos tipos 1 e 4) Definição Hipergliceridemia carboidrato-induzida Idade Adultos jovens Aspecto do plasma Muito turvo e cremoso Colesterol sérico Aumentado, entre 250 e 500 mg/dl Triglicerídeos sérico Aumentado, entre 500 e 1500 mg/dl Eletroforese Figura 3 Quilomícron Aumento acentuado Normal ou discretamente aumentado Pré-beta Aumentado Alfa Normal Doenças principais Mieloma Macroglobulinemia Nefrose Relação triglicerídeos/colesterol 5 Outros dados Tolerância à glicose: anormal Ácido úrico geralmente aumentado Prevalência Rara Página 23

24 REFERÊNCIAS Naoum, P.C. Eletroforese Técnicas e Diagnósticos, 2 a ed. São Paulo - Livraria Santos Editora, Página 24