UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

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1 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO PATRÍCIA SILVA Influência do Orifício Piloto nos Parâmetros Histomorfométricos da Interface Implante-Osso Ribeirão Preto-SP 2012

2 PATRICIA SILVA Influência do Orifício Piloto nos Parâmetros Histomorfométricos da Interface Implante-Osso Tese apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde Aplicadas ao Aparelho Locomotor da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências. Área de Concentração: Ciências da Saúde Aplicada ao Aparelho Locomotor Opção: Reabilitação Orientador: Prof. Dr. Helton Luiz Aparecido Defino Ribeirão Preto-SP 2012

3 Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte. Silva, Patrícia Influência do orifício piloto nos parâmetros histomorfométricos da interface implante-osso. Ribeirão Preto, f. 74: il. 23; 30 cm Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pósgraduação em Ciências da Saude Aplicadas ao Aparelho Locomotor da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP. Área de concentração: Ciências da Saúde Aplicada ao Aparelho Locomotor Opção: Reabilitação. Orientador: Defino, Helton Luiz Aparecido 1. Estudo Histomorfométrico 2. Coluna. 3. Parafuso Pedicular

4 FOLHA DE APROVAÇÃO Nome: Patrícia Silva Título: Influência do Orifício Piloto nos Parâmetros Histomorfométricos da Interface Implante-Osso. Tese apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde Aplicadas ao Aparelho Locomotor da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências. Área de Concentração: Ciências da Saúde Aplicadas ao Aparelho Locomotor Opção: Reabilitação. Aprovado em: Banca Examinadora Prof. Dr. Instituição: Assinatura: Prof. Dr. Instituição: Assinatura: Prof. Dr. Instituição: Assinatura: Prof. Dr. Instituição: Assinatura: Prof. Dr. Instituição: Assinatura:

5 DEDICATÓRIA Dedico este trabalho à minha família, representada pelos meus pais, irmãos e avós. Pelo apoio incondicional, amor, educação, incentivo nos momentos de desânimo, exemplo de vida e empenho em todos os projetos de minha vida..

6 AGRADECIMENTO ESPECIAL Ao Prof. Dr. Helton L. A. Defino, exemplo de pesquisador e orientador, pelo privilégio de ser sua aluna, confiança em mim depositada, ensinamentos, orientações e, principalmente, pelo exemplo de dedicação, sabedoria, serenidade e profissionalismo.

7 AGRADECIMENTOS caminho. A Deus, por permitir serenidade nos meus pensamentos e iluminar meu Ao Prof. Dr. José B. Volpon, Departamento de Biomecânica, Medicina e Reabilitação do Aparelho Locomotor, por disponibilizar as dependências do Laboratório de Bioengenharia, pelos ensinamentos e orientações. Ao Prof. Dr. Antônio Carlos Shimano, Departamento de Biomecânica, Medicina e Reabilitação do Aparelho Locomotor, pela amizade e ensinamentos. Ao Prof. Dr. Luiz A. Salata, Faculdade de Odontologia, por disponibilizar o Departamento de Cirurgia e Traumatologia Buco-maxilo-facial e Periodontia.. Ao Prof. Dr. Francisco José Albuquerque de Paula e Marcello Henrique Nogueira-Barbosa, Departamento de Clínica Médica, pela participação na banca de qualificação e sugestões indispensáveis. Aos doutores Fabiano Canto e Maximiliano Aguiar Porto, pela parceria imprescindível na realização dos experimentos desta pesquisa. Ao doutor Rodrigo César Rosa, pela amizade, parceria imprescindível e disponibilidade em transmitir experiências. Aos funcionários do Laboratório de Bioengenharia Luiz Henrique A. Pereira, Francisco C. Mazzocato, Reginaldo Trevilato e Maria Terezinha de Moraes, pela experiência transmitida e parceria sempre solícita. À funcionária Rose Brittes, pela contribuição inestimável na qualidade de apresentação gráfica. Às funcionárias Fátima Feitosa de Lima, Elisângela Bernardi e Rita de Cássia S. Cossalter pela prestatividade na transmissão de informações. À funcionária Daiane Roza, do CEMEQ, Centro de Métodos Quantitativos, por todo apoio nas análises estatísticas sem poupar esforços. À Adriana Luisa Gonçalves de Almeida, do laboratório de análise de imagens microscópicas da Faculdade de Odontologia, pela parceria neste estudo, amizade e ensinamentos. Ao Thiago Bisinoto Ferreira, pelo apoio nos momentos difíceis, dedicação, ajuda e paciência. Aos Amigos de Doutorado, pela amizade, apoio e ajuda. Aos Amigos do Centro Integrado de Reabilitação do Hospital Estadual, pelos conselhos, atenção, apoio e ajuda.

8 EPÍGRAFE A mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao seu tamanho original. Albert Einstein

9 RESUMO SILVA, P. Influência do Orifício Piloto nos Parâmetros Histomorfométricos da Interface Implante-Osso f. Tese (Doutorado) Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, Objetivo: Estudo experimental in vivo destinado avaliar a influência do diâmetro de perfuração do orifício piloto (igual ou menor que o diâmetro interno do implante) na interface osso-implante na fase aguda e oito semanas após a inserção do parafuso pedicular na coluna lombar por meio de análise histomorfométricas. Métodos: Dez carneiros deslanados da raça Santa Inês foram operados e os parafusos pediculares inseridos bilateralmente no pedículo de L1e L3. O orifício piloto foi perfurado por meio de broca e sonda com diâmetro menor (2,0mm) que o diâmetro interno do parafuso no lado esquerdo do pedículo e igual (2,8mm) ao diâmetro interno do parafuso no lado direito do pedículo. Os animais foram sacrificados imediatamente ou oito semanas após a inserção do parafuso pedicular. As amostras foram incluídas em metacrilato de metila, seções foram obtidas e corados com vermelho de Alizarina e Azul Stevenel para avaliação histomorfométrica em microscopia de luz. Os parâmetros histomorfométricos do estudo incluiram: contato osso-implante, área óssea no interior da rosca do parafuso e área óssea foram do passo de rosca. Resultados: A percentagem de contato osso-implante com a perfuração por meio de broca e sonda foi de 40,81 ± 12,87 e 23,20 ± 11,63 imediatamente após a inserção do parafuso e 62,49 ± e 51,35 ± 7,76 oito semanas após a inserção do orifício piloto menor que o diâmetro interno do parafuso; valores de 6,15 ± 2,69 e 16,05 ± 8,40 imediatamente após a inserção e 16,38 ± 9,42 e 71,55 ± 14,51 oito semanas após a inserção do orifício piloto igual ao diâmetro interno do parafuso, respectivamente. A área de osso no interior da rosca era 37,40 ± 5,68μm 2 e 42,77 ± 6,58 μm 2 imediatamente após a inserção e 58,47 ± 4,68 μm 2 e 50,86 ± 11,29 μm 2 oito semanas após a inserção do orifício piloto menor que o diâmetro interno do parafuso; valores de 14,22 ± 3,85 μm 2 e 32,72 ± 8,21 μm 2 imediatamente após a inserção e 41,33 ± 9,84 μm 2 e 53,82 ± 8,26 μm 2 oito semanas após a inserção de orifícios piloto igual ao diâmetro interno do parafuso. A área de osso fora da rosca era de 33,67 ± 7,59μm 2 e 43,28 ± 16,19 μm 2 imediatamente após a inserção e 61,67 ± 9.85 μm 2 e 62,11 ± 7,02 μm 2 oito semanas após a inserção do orifício piloto menor que o diâmetro interno do parafuso; valores de 23,51 ± 5,97 μm 2 e 35,32 ± 7,41μm 2 imediatamente após a inserção de 45,15 ± 6,52 μm 2 e 62,27 ± 15,30 μm 2 oito semanas após a inserção de orifícios piloto igual ao diâmetro interno do parafuso. Os parâmetros histomorfométricos foram significativamente maiores para o orifício piloto menor que o diâmetro interno do parafuso. Conclusão: A perfuração por meio de broca do orifício piloto com diâmetro menor que o diâmetro interno do parafuso melhorou o contato da interface osso-implante imediatamente e oito semanas após a inserção do parafuso pedicular Palavras-chave: Estudo histomorfométrico; Coluna; Parafuso pedicular

10 ABSTRACT SILVA, P. The influence of pilot hole on histomorphometric parameters of pedicle screw-bone interface f. Tese (Doutorado) Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, Objective: To experimentally study in vivo the influence of pilot hole diameter (smaller or equal to the internal (core) diameter of the screw) on screw-bone interface in the acute phase and eight weeks after pedicle screw insertion according to histomorphometric evaluation. Methods: Ten sheep were operated on and pedicle screws inserted in the L1 and L3 pedicles bilaterally by drill and probe. The pilot hole was smaller (2.0mm) than the internal diameter (core) of the screw on the left side pedicle and equal (2.8mm) to the internal diameter (core) of the screw on the right side pedicle. Animals were killed immediately or eight weeks after pedicle screw insertion. Specimens were embedded in methyl methacrylate; sections were obtained and stained with Alizarin red and Stevenel s blue for histomorphometric evaluation by light microscopy. Histomorphometric measurements included boneimplant contact, area of bone inside the screw thread in a measuring frame, and area of bone outside the screw thread. Results: The percentage of bone-implant contact with drilled by drill and probe was 40.81±12.87 and 23,20 ± 11,63 immediately after screw insertion of the 62.49±19.73 and 51,35 ± 7,76 eight weeks after insertion for the pilot hole smaller than the internal diameter of the screw; values were 6.15±2.69 and 16,05 ± 8,40 immediately after insertion and 16.38±9.42 and 71,55 ± 14,51 eight weeks after insertion for the pilot hole equal to the internal diameter of the screw. The area of bone inside the thread was 37.40±5.68μm 2 and 42,77 ± 6,58 μm 2 immediately after insertion and 58.47±4.68μm 2 and 50,86 ± 11,29 μm 2 eight weeks after insertion for the pilot hole smaller than the internal diameter of the screw; values were 14.22±3.85μm 2 and 32,72 ± 8,21 μm 2 immediately after insertion and 41.33±9.84μm 2 and 53,82 ± 8,26 μm 2 eight week after insertion for pilot holes equal to the internal diameter of the screw. The area of bone outside the thread was 33.67±7.59μm 2 and 43,28 ± 16,19 μm 2 immediately after insertion and 61.67±9.85μm 2 and 62,11 ± 7,02 μm 2 eight weeks after insertion for the pilot hole smaller than the internal diameter of the screw; values were 23.51±5.97μm 2 and 35,32 ± 7,41μm 2 immediately after insertion and 45.15±6.52μm 2 and 62,27 ± 15,30 μm 2 eight weeks after insertion for pilot holes equal to the internal diameter of the screw. Conclusion: Pilot diameter smaller than the internal (core) diameter of the screw improved the pedicle screw-bone interface contact immediately and eight weeks after screw placement by drill. Keywords: histomorphometric study; spine; pedicular screw

11 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 Morfologia do parafuso pedicular...20 Figura 2 Ilustração do parafuso não automacheante e do parafuso automacheante e os tipos de força que são geradas no tecido ósseo ao seu redor.21 Figura 3 Fotografia ilustrando a convergência de 30 do parafuso pedicular inserido no pedículo...24 Figura 4 Fotografia do parafuso pedicular (USSI -Synthes)...32 Figura 5 Desenho esquemático da disposição de inserção dos implantes nas vértebras lombares...34 Figura 6 - Fotografia do bloco de resina mostrando o implante após a secção Figura 7 - Fotomicrografia da interface implante-osso ilustrando a medição histomorfométrica. Linha pontilhada = porcentagem de contato osso-implante (COI). Retângulo vermelho = área intrapasso (AIP) destacada em azul. Retângulo branco = área extrapasso (AEP) destacada em verde. x = 140 µm. y = 1200 µm. (Coloração: vermelho de alizarina + azul de Stevenel. Aumento:25x)...41 Figura 8 - Fotomicrografia demonstrando a localização da área padrão de mensuração e delimitação das regiões dentro e fora dos passos de rosca (coloração: vermelho de alizarina e azul de Stevenel. Aumento:16x) Figura 9 - Fotomicrografia demonstrando a localização da área padrão de mensuração e delimitação das regiões dentro e fora dos passos de rosca. Retângulo verde = área intrapasso (AIP). Retângulo branco = área extrapasso (AEP) (coloração: vermelho de alizarina e azul de Stevenel. Aumento:25x)...43 Figura 10 - Fotomicrografia ilustra histomorfometria destacando a área óssea dentro dos passos de rosca em azul. (coloração: vermelho de alizarina e azul de Stevenel. Aumento:25x) Figura 11 - Fotomicrografia ilustra histomorfometria da área óssea fora dos passos de rosca em verde. (coloração: vermelho de alizarina e azul de Stevenel. Aumento:25x)...44 Figura 12 - Fotomicrografia ilustra histomorfometria representando a proporção do contato linear ósseo (branco) em relação à superfície total do parafuso dentro da área de mensuração. X = 140 µm. Y = 1200 µm. (coloração: vermelho de alizarina e azul de Stevenel. Aumento:25x)...44 Figura 13 - Fotomicrografia ilustra histomorfometria destacando a mensuração do contato linear osso-implante (verde) em um passo de rosca do parafuso pedicular. (coloração: vermelho de alizarina e azul de Stevenel. Aumento:100x) Figura 14 Fotomicrografias da interface implante-osso ilustrando os resultados histomorfométricos da broca de perfuração com diâmetros diferentes nas fases aguda e crônica. (A) perfuração de 2,0mm na fase aguda; (B) perfuração de 2,8mm na fase aguda; (C) perfuração de 2,0mm na fase crônica; (D) perfuração de 2,8mm na fase crônica. Coloração: vermelho de Alizarina e Azul de Stevenel. Aumento de 25x...48

12 Figura 15 Fotomiografia da interface implante-osso ilustrando os resultados histomorfométricos do percentual de contato de diferentes diâmetros na fase aguda e crônica. A) perfuração de 2,0mm na fase aguda; (B) perfuração de 2,8mm na fase aguda; (C) perfuração de 2,0mm na fase crônica; (D) perfuração de 2,8mm na fase crônica. Coloração: vermelho de Alizarina e Azul de Stevenel. Aumento de 100x...48 Figura 16 Gráfico ilustrando o percentual de contato implante-osso (média e desvio padrão), comparando os orifícios piloto de 2,0mm e 2,8mm imediatamente (agudo) e oito semanas (crônico) após a inserção do parafuso pedicular com orifício piloto perfurado por meio de broca. Diferença significativa (p<0,01) foi observada nas fases aguda e crônica...49 Figura 17 - Fotomicrografias da interface implante-osso ilustrando os resultados histomorfométricos da sonda de perfuração com diâmetros diferentes nas fases aguda e crônica. (A) perfuração de 2,0mm na fase aguda; (B) perfuração de 2,8mm na fase aguda; (C) perfuração de 2,0mm na fase crônica; (D) perfuração de 2,8mm na fase crônica. Coloração: vermelho de Alizarina e Azul de Stevenel. Aumento de 25x...50 Figura 18 - Fotomicrografia da interface implante-osso ilustrando os resultados histomorfométricos da sonda do percentual de contato de diferentes diâmetros na fase aguda e crônica. A) perfuração de 2,0mm na fase aguda; (B) perfuração de 2,8mm na fase aguda; (C) perfuração de 2,0mm na fase crônica; (D) perfuração de 2,8mm na fase crônica. Coloração: vermelho de Alizarina e Azul de Stevenel. Aumento de 100x...50 Figura 19 - Gráfico ilustrando o percentual de contato implante-osso (média e desvio padrão), comparando os orifícios piloto de 2,0mm e 2,8mm imediatamente (agudo) e oito semanas (crônico) após a inserção do parafuso pedicular com orifício piloto perfurado por meio de sonda. Diferença significativa (p<0,01) foi observada nas fases aguda e crônica...51 Figura 20 Gráfico ilustrando a área óssea intrapasso (média e desvio padrão), comparando os orifício piloto de 2,0mm e 2,8mm imediatamente (agudo) e oito semanas (crônico) após a inserção do parafuso por meio de broca. Diferença estatística (p < 0,01) foi observada na fase aguda e crônica Figura 21 - Gráfico ilustrando a área óssea intrapasso (média e desvio padrão), comparando os orifício piloto de 2,0mm e 2,8mm imediatamente (agudo) e oito semanas (crônico) após a inserção do parafuso por meio de sonda. Diferença estatística (p < 0,01) foi observada na fase aguda e crônica Figura 22 - Gráfico ilustrando a área óssea extrapasso (média e desvio padrão), comparando os orifícios piloto de 2,0mm e 2,8mm imediatamente (agudo) e oito semanas (crônico) após a inserção do parafuso por meio de broca. Diferença estatística (p < 0,01) foi observada na fase aguda e crônica Figura 23 - Gráfico ilustrando a área óssea extrapasso (média e desvio padrão), comparando os orifícios piloto de 2,0mm e 2,8mm imediatamente (agudo) e oito semanas (crônico) após a inserção do parafuso por meio de sonda. Diferença estatística (p < 0,01) foi observada na fase aguda e crônica....55

13 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS AEP: área extrapasso (área fora dos passos de rosca do parafuso) AIP: área intrapasso (área dentro dos passos de rosca do parafuso) COI: Contato osso-implante DBMRAL: Departamento de Biomecânica, Medicina e Reabilitação do Aparelho Locomotor EGG: Éter Gliceril Guaiacólico et al. : colaboradores NaOH: Hidróxido de sódio ph: Potencial hidrogeniônico : marca registrada SP: São Paulo ±: mais ou menos USP: Universidade de São Paulo vs: versus x: vezes % : porcentagem

14 LISTA DE UNIDADES C Graus Celsius cm Centímetros g - Gramas h - hora Kg - quilogramas L - litro m - metro min - minutos mg Miligramas ml Mililitros mm Milímetros mm 2 Milímetros quadrados µm Micrômetros U.I. Unidades Internacionais.

15 SUMÁRIO 1 1 INTRODUÇÃO SISTEMA DE FIXAÇÃO VERTEBRAL E IMPLANTE PARAFUSOS PEDICULARES ORIFICIO PILOTO TÉCNICAS DE INSERÇÃO DO PARAFUSO PEDICULAR INTERFACE IMPLANTE-OSSO OBJETIVOS MATERIAL E MÉTODOS ANIMAL DO ESTUDO VÉRTEBRAS IMPLANTES PREPARO DO ORIFÍCIO PILOTO MODELO EXPERIMENTAL PROCEDIMENTOS DA CIRURGIA EXPERIMENTAL CUIDADOS PERIOPERATÓRIOS PREPARO DA AMOSTRA PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO Fixação Análise Histomorfométrica ANÁLISE ESTATÍSTICA RESULTADOS PORCENTAGEM DE CONTATO ÓSSEO (COI) Broca Sonda De acordo com: Diretrizes para apresentação de teses e dissertações da USP. São Paulo: SIBi/USP

16 4.2 ÁREA ÓSSEA DENTRO DO PASSO DE ROSCA (ÁREA INTRAPASSO - AIP) Broca Sonda ÁREA ÓSSEA FORA DO PASSO DE ROSCA (ÁREA EXTRAPASSO - AEP) Broca Sonda DISCUSSÃO CONCLUSÃO...63 REFERÊNCIAS...65

17 INTRODUÇÃO

18 Introdução 17 1 INTRODUÇÃO A fixação da coluna vertebral por meio de parafusos pediculares tem sido amplamente utilizada por proporcionar estabilidade mecânica no tratamento de várias doenças, incluindo tumor, trauma, deformidades ou degenerações (AEBI et al., 1987). O sistema de ancoragem depende da capacidade de fixação do parafuso no tecido ósseo que, por sua vez, está diretamente relacionado com o desenho geométrico do implante. Apesar dos avanços tecnológicos ainda ocorrem falhas (quebra do parafuso, afrouxamento e soltura) na ancoragem dos parafusos (AEBI et al., 1987; CHO W et al., 2010; WITTENBERG et al., 1993). Está bem estabelecido na literatura que a qualidade da fixação do parafuso pedicular é influenciada pela densidade mineral óssea (CARMOUCHE et al., 2005), geometria do parafuso (ABSHIRE et al., 2001; KWOK et al., 1996; LILL CA et al., 2000; ERKAN S et al., 2010; LIM TH et al., 2001) e a técnica de inserção seguida pelo cirurgião (CARMOUCHE et al., 2005; DAFTARI et al., 1994; PFEIFFER et al., 2006; STERBA W et al., 2007). A literatura atual mostra ainda que melhores resultados de ancoragem do parafuso pedicular são influenciados pelo tamanho e a técnica de preparo do orifício piloto (CARMOUCHE et al., 2005; DAFTARI et al., 1994; PFEIFFER et al., 2006; DEFINO et al., 2009; CHATZISTERGOS et al., 2010b; CHO W et al., 2010). Para os parafusos pediculares cilíndricos auto-macheantes, a redução do diâmetro do orifício piloto em relação ao diâmetro externo do parafuso aumentaria a resistência ao arrancamento do parafuso (CHATZISTERGOS et al., 2010a). As publicações que abordam a força de arrancamento dos parafusos pediculares têm usado como corpo de prova, na sua maioria, ossos autopsiados (COE et al., 1990; COOK et al., 2000; DEFINO, VENDRAME, 2001) ou material sintético (CHEN et al., 2003; DAFTARI et al., 1994; HSU et al., 2005). No osso vivo, a força de ancoragem do parafuso está relacionada com o tecido ósseo ao redor do implante que é o elemento mais frágil da interface osso-parafuso (SCHATZKER et al., 1975; SCHATZKER et al., 1975; SCHATZKER et al., 1975). A força de arrancamento do parafuso é proporcional a qualidade e quantidade de tecido ósseo entre os passos de rosca. A força de fixação não é dependente apenas do desenho geométrico do parafuso, mas também das alterações induzidas

19 Introdução 18 no osso pelo trauma do procedimento cirúrgico para inserção do implante pelas reações do osso ao redor do implante, pela reabsorção e remodelação, assim como pelo resultado da cicatrização (CHO et al., 2010; SCHATZKER et al., 1975). A literatura estabelece que a força de arrancamento do parafuso é proporcional ao volume de osso entre as roscas e que a qualidade e quantidade de osso entre as roscas são fatores importantes na resistência ao arrancamento. Para tal avaliação o teste de arrancamento é o método mais comumente utilizado para avaliar as propriedades mecânicas da interface osso-implante. Contudo, os estudos histomorfométricos podem confirmar os estudos biomecânicos e avaliar a osteointegração (PORTO et al., 2011b; SANDEN et al., 2001; SU et al., 2009). 1.1 Sistema de Fixação Vertebral e Implante Os sistemas de fixação vertebral são compostos por diferentes componentes de ancoragem (parafusos, ganchos, fios de cerclagem), componentes longitudinais (hastes e placas), conectores transversais e acessórios (arruelas e porcas) (CHEN et al., 2003; DEFINO et al., 2007). Os parafusos são componentes de ancoragem do tipo penetrante e atuam como ponto de fixação dos sistemas implantados nas vértebras influenciando no desempenho biomecânico. Os ganchos e os fios de cerclagem são componentes do tipo não penetrante (BENZEL, 2001; BROWNER et al., 2003). A fixação por meio de parafusos ganhou popularidade durantes as duas últimas décadas e é atualmente o padrão ouro no tratamento de deformidades, fraturas traumáticas e tumores da coluna vertebral. Os parafusos pediculares apresentam numerosas vantagens em relação aos outros sistemas de fixação da coluna vertebral (ZEILLER et al., 2005). A instrumentação da coluna vertebral com parafusos pediculares tornou-se um método de rotina em cirurgias da coluna vertebral durante as últimas décadas. Vários estudos clínicos mostram que a taxa de artrose aumenta quando a instrumentação é realizada com parafusos pediculares em comparação com outras técnicas (SANDEN et al., 2001; ZDEBLICK et al., 1993).

20 Introdução 19 O material utilizado na fabricação dos parafusos é o aço inoxidável e o titânio, os quais apresentam alto índice de biocompatibilidade tecidual (BENZEL, 2001; BUHLER et al., 1998). A ancoragem do sistema de fixação por meio de parafusos fixados sobre as vértebras é de fundamental importância para o desempenho biomecânico dos implantes aplicados na coluna vertebral. Falhas na ancoragem do sistema de fixação resultam na soltura do implante e podem estar relacionadas com a falha mecânica do implante ou do tecido ósseo da vértebra (BENZEL, 2001; HIRANO et al., 1997; LILL et al., 2006; ZDEBLICK et al., 1993). Tecido ósseo com baixa densidade mineral óssea não proporciona ao implante a resistência necessária para a fixação dos parafusos e a sustentação de forças que são aplicadas sobre os mesmos, ocorrendo frequentemente a soltura dos implantes com consequente perda da função biomecânica de correção ou de estabilização (BENZEL, 2001; BRANTLEY et al., 1994; BROWNER et al., 2003; COE et al., 1990; HIRANO et al., 1997; LILL et al., 2006; PITZEN et al., 2004; ZDEBLICK et al., 1993). 1.2 Parafusos Pediculares Os parafusos possuem diferentes partes: corpo, cabeça, haste, diâmetro externo, diâmetro interno, rosca, passo de rosca e diâmetro do corpo (Figura 1). O diâmetro externo é o maior diâmetro entre as bordas externas das roscas do implante. O diâmetro interno (alma) é o diâmetro do corpo do parafuso sobre o qual as roscas estão fixadas. O diâmetro do corpo do parafuso é o diâmetro da parte do parafuso que não apresenta rosca. O diâmetro do corpo e o diâmetro interno, em alguns implantes, são iguais (BENZEL, 2001; BROWNER et al., 2003; CHO et al., 2010).

21 Introdução 20 Fonte: Modificado de Cho, Cho e Wu (2010) Figura 1 Morfologia do parafuso pedicular Os parafusos têm a capacidade de resistir às forças de arrancamento, cisalhamento e encurvamento (KRAG, 1996). Essas propriedades mecânicas estão relacionadas com as suas dimensões e geometria dos componentes, assim como com a qualidade do tecido ósseo nos quais são implantados (BROWNER et al., 2003; RYKEN et al., 1995; ZDEBLICK et al., 1993). O diâmetro interno do parafuso é a dimensão mais importante do parafuso quando considerado a sua resistência à fadiga, estudos mostram que acrescimento de 27% no diâmetro interno aumentou 104% a resistência a fadiga (CHO et al., 2010; LIU et al., 1990). Os parafusos podem ser classificados como não automacheantes e automacheantes em relação à extremidade dos parafusos (Figura 2). Os parafusos não automacheantes apresentam extremidades cortantes, não sendo capazes de moldar um espiral no tecido ósseo receptor. Para a implantação do parafuso não automacheante é necessário o macheamento do orifício piloto com outro instrumental (macho). Os parafusos automacheantes promovem a confecção do espiral com a sua geometria da ponta do implante durante a sua inserção no orifício piloto (GOELZER et al., 2010; HITCHON et al., 2003; ZDEBLICK et al., 1993).

22 Introdução 21 Fonte: Modificado de Mazzocca et al. apud Browner et al., Figura 2 Ilustração do parafuso não automacheante e do parafuso automacheante e os tipos de força que são geradas no tecido ósseo ao seu redor Diferentes desenhos de parafusos têm sido desenvolvidos na tentativa de melhores resultados biomecânicos de ancoragem dos implantes, como por exemplo, os parafusos de núcleo duplo no qual o diâmetro interno espessado aumentaria a resistência à fadiga (LAW et al., 1993; LILL et al., 2006; ZDEBLICK et al., 1993). 1.3 Orifício Piloto Para a inserção do parafuso no interior da coluna vertebral é necessário o preparo do local no qual o implante será inserido, denominado orifício piloto. O preparo do mesmo consiste na produção de um espaço no interior do local anatômico da vértebra escolhido para a inserção do parafuso, como por exemplo, o pedículo, o corpo vertebral e o processo transverso (DAFTARI et al., 1994; DEFINO et al., 2009; DEFINO et al., 2007; FOLEY et al., 1990; ZDEBLICK et al., 1993). O orifício piloto pode ser realizado por meio de broca, sonda ou curetas e o seu diâmetro de perfuração deve ser considerado em relação ao diâmetro interno do parafuso a ser fixado. Essas variáveis, diâmetro e modo de preparo do orifício piloto, estão relacionados com a qualidade da ancoragem do sistema de fixação vertebral, interferindo diretamente na ancoragem do parafuso na vértebra e são temas de vários estudos (DAFTARI et al., 1994; DEFINO et al., 2009; DEFINO et al., 2007;

23 Introdução 22 FOLEY et al., 1990; ÖKTENOGLU BT et al., 2001; PFEIFFER et al., 1996; SANDEN et al., 2001; ZDEBLICK et al., 1993). Além da perfuração por brocas, os parafusos do tipo cortical necessitam do preparo das paredes do trajeto de implantação de suas roscas, este processo é denominado macheamento (tapping). A perfuração e macheamento do orifício piloto promovem remoção de tecido ósseo (BENZEL, 2001; BROWNER et al., 2003; CHAPMAN et al., 1996). A literatura recomenda que o macheamento seja realizado com instrumental que possua diâmetro externo 1 mm maior que o diâmetro interno do parafuso para garantir igual força de arrancamento do orifício piloto não macheado (CARMOUCHE et al., 2005; ZDEBLICK et al., 1993). O excesso de manipulação - inserção, retirada e reinserção - resultaria na diminuição do torque e da força de arrancamento (DEFINO et al., 2009; YUKSEL et al., 2007). A confecção do orifício piloto por meio de broca remove o tecido ósseo. Além disso, a alta velocidade de perfuração do orifício piloto por meio de broca poderia resultar na necrose térmica do osso adjacente remanescente. O uso da sonda promoveria a compactação do tecido ósseo nas paredes adjacentes do trajeto do orifício piloto e não levaria a necrose térmica. Essa compactação resultaria na melhor qualidade de fixação dos implantes do sistema de fixação vertebral (ABSHIRE et al., 2001; BENZEL, 2001; BRANTLEY et al., 1994; GEORGE et al., 1991). A técnica de perfuração do orifício piloto depende do tipo de osso (cortical ou esponjoso) e do tipo de parafuso utilizado (BENZEL, 2001). O diâmetro de perfuração do orifício piloto em relação ao diâmetro interno do parafuso pedicular interfere diretamente na fixação do parafuso pedicular. A perfuração com diâmetro menor que o diâmetro interno do implante promoveria uma maior compactação do tecido ósseo dentro dos passos de rosca durante a fixação do parafuso pedicular, o que resultaria no maior torque de inserção e maior força de arrancamento. Ensaios biomecânicos, ainda controversos, relatam que tais desempenhos mecânicos são reduzidos à medida que o diâmetro de perfuração do orifício piloto aumenta em relação ao diâmetro interno do parafuso pedicular (DEFINO et al., 2009; DEFINO et al., 2007; GEORGE et al., 1991; ÖKTENOGLU et al., 2001; STERBA et al., 2007; YUKSEL et al., 2007). O torque de inserção do parafuso pedicular é clinicamente importante. A força de implantação do parafuso no interior do orifício piloto é uma variável dependente

24 Introdução 23 do cirurgião que deve utilizar-se da prática clínica para quantificar a força aplicada. Força manual excessiva poderá resultar em excessiva tensão no tecido ósseo, levando a respostas absorventes, ou seja, inserção do parafuso com valores mais elevados de torque pode proporcionar forças prejudiciais sobre o parafuso. No entanto, valor ideal de torque de inserção do parafuso pedicular permanece desconhecida (TOGNI et al., 2011). 1.4 Técnicas de inserção do parafuso pedicular A morfologia do pedículo afeta a resistência ao arrancamento do parafuso. Hirano et al (1997) mostrou que a inserção do parafuso na região do pedículo apresenta maior resistência ao arrancamento quando inserido no corpo vertebral. Aproximadamente 60% da força de arrancamento do implante e 80% da rigidez longitudinal dependem do pedículo, em vez do corpo vertebral (HIRANO et al., 1997). Peculiaridades anatômicas do pedículo e suas variações fazem da instrumentação pedicular um constante desafio aos cirurgiões. Para que variáveis aleatórias não prejudiquem a instrumentação é necessária a padronização do instrumental e o conhecimento das diferenças entre os níveis vertebrais, ângulo do eixo do pedículo em relação ao plano sagital e axial, distâncias das estruturas nervosas, diâmetro do pedículo, tamanho do pedículo e distância entre os pedículos de cada vértebra (HIRANO et al., 1997; INCEOGLU et al., 2006; KIM et al., 2004; KRAG et al., 1988; ZDEBLICK et al., 1993; ZEILLER et al., 2005; ZINDRICK et al., 1986). A aplicação incorreta da técnica resulta na soltura do implante ou falha na estabilidade do sistema de fixação vertebral (ABSHIRE et al., 2001; KIM, LENKE, 2005; ZDEBLICK et al., 1993). Cho, Cho e Wu (2010) relatam que a convergência de parafusos pediculares de 30 graus (Figura 3) no plano coronal pode aumentar a força de arrancamento em 28,6%. Contudo, a inserção do parafuso pedicular sem convergência é mais estável em termos de ligação longitudinal.

25 Introdução 24 Fonte: Modificado de Cho, Cho e Wu (2010) Figura 3 Fotografia ilustrando a convergência de 30 do parafuso pedicular inserido no pedículo A inserção do parafuso pedicular seguindo a trajetória lateralmente direcionada do osso cortical apresenta as mesmas características biomecânicas da tradicional trajetória medial. Contudo, essa trajetória lateral para a inserção do parafuso pedicular tem sido eficaz para ossos com baixa densidade mineral óssea devido aos bons resultados biomecânicos (SANTONI et al., 2009). Outros autores preconizam que a trajetória do parafuso pedicular deve ser paralela à linha média sagital em vez de ao longo do eixo do pedículo (CHO W et al., 2010; STERBA W et al., 2007). A manutenção da integridade do pedículo vertebral, diminuição do risco de lesões e a estabilidade da fixação devem ser um dos principais objetivos do cirurgião durante a instrumentação da coluna vertebral. A falta de integridade do pedículo acarreta na diminuição da estabilidade do sistema de fixação vertebral (KRAG, 1996; REITMAN et al., 2004). A integração da interface osso-implante é o fator de extrema importância e prediz o sucesso ou a falha do sistema de fixação (CHO et al., 2010; GEORGE et al., 1991; KRAG et al., 1986; KRAG, 1996; STERBA et al., 2007). George et al. (1991) observaram que pedículos que apresentavam comprometimento da parede cortical perdem a capacidade de fixação em 11%. Defino e Vendrame (2001) relatam que quando o parafuso atinge a parede cortical do pedículo ocorre lesão do

26 Introdução 25 mesmo e que o parafuso pedicular tem sua ancoragem basicamente em osso trabecular. A integridade do pedículo vertebral é de fundamental importância para preservar a qualidade da ancoragem do sistema de fixação vertebral (CHATZISTERGOS et al., 2010b; CHEN et al., 2003; COOK et al., 2000). A baixa densidade mineral óssea é um dos fatores significantes na soltura dos implantes. Vários métodos são aplicados na tentativa de melhorar a fixação quando presente a osteoporose severa como, por exemplo, o cimento ósseo, os ganchos adicionais e os fios, parafusos de salvamento, parafusos expansíveis e o revestimento com hidroxiapatita (COOK et al., 2000; MORONI et al., 1996; RENNER et al., 2004; SANDEN et al., 2001). 1.5 Interface Implante-Osso A estabilidade mecânica do sistema de fixação vertebral está diretamente relacionada com a qualidade da fixação do parafuso no tecido ósseo, ou seja, da interface implante-osso. A qualidade da interface implante-osso pode influenciar biomecanicamente o sistema de fixação vertebral, interferindo no sucesso do tratamento proposto (HADJIPAVLOU et al., 1997; LEE JH et al., 2011; SANDEN et al., 2001; ZHANG et al., 2006). A artrodese vertebral por meio de parafusos fixados na região do pedículo tornou-se prática clínica rotineira nas últimas duas décadas com o objetivo de correções de deformidades, tratamento de fraturas e tumores (GREENFIELD, III et al., 1992; ZEILLER et al., 2005). Contudo, a soltura do implante tem sido relacionada com a quebra do implante, perda do alinhamento vertebral e aumento da incidência de pseudoartrose. Esse afrouxamento tem sido particularmente evidente durante a instrumentação dos corpos vertebrais com baixa densidade mineral óssea (UPASANI et al., 2009; WEINSTEIN et al., 1988). As falhas na fixação têm sido relacionadas com a técnica imprópria de implantação: posicionamento do parafuso incorreto, quebra do pedículo, tamanho e comprimento inadequado do parafuso (DAFTARI et al., 1994; DEFINO et al., 2007; LEI, WU, 2005). Para minimizar as falhas na fixação dos parafusos vertebrais é necessário o conhecimento sobre a interface implante-osso. A literatura existente não é

27 Introdução 26 suficientemente esclarecedora sobre a interface implante-osso (ABSHIRE et al., 2001; ALDINI et al., 2002; CHO et al., 2010; LEE et al., 2011; PORTO et al., 2011b; SANDEN et al., 2001; UPASANI et al., 2009; XUE et al., 2010). Estudos histomorfométricos têm sido realizados com intuito de avaliar a interface implante-osso. Silva et al. (2008) realizaram avaliação histomorfométrica da interface osso-implante de parafusos cervicais expansíveis e não expansíveis e relata maior compactação do tecido ósseo esponjoso adjacente aos implantes expansíveis. Porto (2011) avaliou a porcentagem de contato-osso, área óssea dentro e fora do passo de rosca dos novos desenhos de parafusos cervicais. Upasani et al., (2009) realizaram estudo comparando os ensaios biomecânicos com as análises histomorfométricas para avaliar a qualidade da interface parafuso-osso de parafusos pediculares revestidos com hidroxiapatita e titânio inseridos no pedículo vertebral. Xue et al (2010) estudaram a influência do alendronato na qualidade da interface implante-osso. A falha na fixação do parafuso pedicular é um dos fatores importantes na não fusão espinhal e no fracasso da correção de deformidades. A interface implanteosso tem sido apontada como o elo mais fraco do parafuso pedicular. A força de ancoragem da interface implante-osso é dependente da área total de crescimento do osso na superfície da rosca. Osteólise na interface implante-osso foi encontrada com a principal razão para a soltura do implante. O afrouxamento é a mais comum causa de falha da fixação do implante (LEE JH et al., 2011; PORTO et al., 2011b; SANDEN et al., 2001; SILVA LS et al., 2008; TOGNI et al., 2011; UPASANI et al., 2009; XUE et al., 2010). Avaliar a força de arrancamento tem sido um método utilizado para predizer a qualidade da fixação do parafuso pedicular. A fim de melhorar as características da interface implante-osso mudanças no desenho da rosca, forma do parafuso, geometria e modificações na superfície externa dos parafusos tem sido realizada. No entanto a fixação da interface implante-osso ainda não é ideal (DECOSTER et al., 1990; KWOK et al., 1996; WITTENBERG et al., 1991; ZINDRICK et al., 1986). O conhecimento disponibilizado na literatura parece não responder aos questionamentos: 1) o diâmetro do orifício piloto em relação ao diâmetro interno do parafuso influencia no contato implante-osso?; 2) quais são as características da interface implante-osso na fase aguda e crônica de inserção do parafuso pedicular?; 3) a compactação do tecido ósseo altera a área óssea fora do passo de rosca?. Uma

28 Introdução 27 das hipóteses é que alterações do diâmetro do orifício piloto devem ser acompanhadas por alterações histomorfométricas na interface implante-osso após a inserção do parafuso pedicular.

29 OBJETIVOS

30 Objetivos 29 2 OBJETIVOS O objetivo do presente estudo foi verificar, por meio de parâmetros histomorfométricos, qual o melhor diâmetro de perfuração do orifício piloto (igual ou menor que o diâmetro interno do implante) para a fixação dos parafusos pediculares na coluna lombar. Para tal, foram realizadas perfurações por dois instrumentos (broca e sonda) e idealizado comparar o resultado dos diferentes diâmetros de perfurações em dois momentos: imediatamente a implantação do parafuso - fase aguda, e após oito semanas da fixação do parafuso pedicular - fase crônica.

31 MATERIAL E MÉTODOS

32 Material e Métodos 31 3 MATERIAL E MÉTODOS Todos os experimentos foram conduzidos estritamente de acordo com o Instituto Nacional de Diretrizes para o Bem-Estar dos Animais Experimentais, sob autorização do comitê de ética em experimentação animal da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo, sob número de protocolo 011/ O estudo foi realizado no Laboratório de Bioengenharia do Departamento de Biomecânica, Medicina e Reabilitação do Aparelho Locomotor da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo e no Laboratório de Análise de Imagens Microscópicas do Departamento de Cirurgia e Traumatologia Buco-maxilo-facial e Periodontia da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. 3.1 Animal do estudo Foram utilizados dez carneiros machos castrados adultos jovens, da raça Santa Inês deslanada. Os animais apresentaram massa corporal média de 35,7±4,8 kg. Foram adquiridos em criadouros da região e mantidos nas pastagens do Biotério Central do Campus USP Ribeirão Preto. As vértebras de carneiros possuem características e propriedades anatômicas semelhantes as vértebras lombares de humanos. Além disso, a utilização desses animais permite a padronização da raça, do peso, da idade levando a redução do número de animais do experimento, por reduzir de maneira importante a variabilidade da amostra. A literatura reconhece o carneiro como modelo experimental biomecânico e histológico adequado. Durante a realização do experimento o animal se mostrou dócil e de fácil manuseio, o que tornou possível a utilização dos mesmos para o experimento.

33 Material e Métodos Vértebras Foram selecionados para o estudo os seguimentos da primeira a quarta vértebra lombar. 3.3 Implantes Foram utilizados 80 parafusos pediculares cilíndricos e auto-macheante composto de titânio (USSI -Synthes,Paoli, PA, USA), além do instrumental adequado à manipulação dos mesmos. Os parafusos utilizados apresentaram comprimento de 30 mm, diâmetro externo de 4,0mm e diâmetro interno de 2,8mm (Figura 4). Figura 4 Fotografia do parafuso pedicular (USSI -Synthes) 3.4 Preparo do Orifício Piloto O orifício piloto foi realizado por meio de broca e sonda, tendo sido também considerado a relação entre o diâmetro da perfuração e o diâmetro interno do parafuso (núcleo).

34 Material e Métodos 33 O parafuso foi implantado nos pedículos por meio da realização do orifício piloto de 2,0mm e 2,8mm de diâmetro, que correspondia ao diâmetro menor e igual ao diâmetro interno do parafuso. As perfurações com a sonda eram feitas de forma manual e foi utilizado guia para manter o alinhamento, enquanto que as perfurações com brocas eram feitas em furadeira na velocidade de 455 rpm (baixa rotação). 3.4 Modelo experimental Os experimentos incluíram três análises histomorfométricas em tempos diferentes da implantação dos parafusos pediculares, sendo um em pós-operatório imediato (fase aguda) e outro com oito semanas de pós-operatório (fase crônica). Foram formados oito grupos experimentais, sendo quatro grupos para a fase aguda e quatro grupos para a fase crônica. Cada grupo estudou os diferentes diâmetros perfuração e meio de preparo do orifício piloto nos diferentes tempos do experimento (agudo e crônico). Para cada grupo experimental foram testados dez implantes. 3.5 Procedimentos da Cirurgia Experimental Para a realização do procedimento cirúrgico os animais foram inicialmente sedados com uma dose de indução anestésica composta por: acepromazina 0,1 mg/kg (Acepram, Univet, São Paulo, São Paulo, Brasil), ketamina 2mg/kg (Ketamina, Agener União Saúde Animal, São Paulo, São Paulo, Brasil) e xilazina 0,5 mg/kg (Dopaser, Calier, Barcelona, Catalunya, Espanha) por via intramuscular. Após a indução anestésica do animal, este foi posicionado em decúbito dorsal sobre uma canaleta em formato de V. Em seguida foi realizada a tricotomia elétrica e degermação manual para manter os padrões de assepsia e anti-sepsia. A manutenção anestésica foi feita com uma solução de 1 g de ketamina, 100g de xilazina e 50 g de Éter Gliceril Guaiacólico (Quimibrás, Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brasil) em 1 litro de soro fisiológico, e aplicados via endovenosa na proporção de 3 ml/kg/h durante todo o procedimento cirúrgico (ALDINI et al., 2002).

35 Material e Métodos 34 Em seguida foi realizada a exposição da coluna lombar através de incisão cirúrgica longitudinal posterior sobre os segmentos de L1 até L4 com o auxílio de eletrocoagulação. Após incisão da pele e tecido subcutâneo, a musculatura foi desinserida dos elementos vertebrais posteriores, permitindo assim o acesso ao pedículo vertebral, e sequencialmente a inserção dos implantes. Após a exposição da coluna lombar, os pedículos da primeira a quarta vértebra foram manipulados da seguinte maneira: pedículo direito do corpo vertebral de L1 e L3 foi inserido o parafuso USS1 após a perfuração por broca de 2,0 mm acoplada a trépano elétrico a baixa rotação sem irrigação simultânea do orifício produzido. No pedículo esquerdo, foi inserido o parafuso USS1 após a perfuração previa por broca de 2,8 mm. O procedimento foi repedido para as vértebras lombares L2 e L4, contudo a perfuração foi realizada por meio de sonda (Figura 5). B 2,0mm B 2,8mm L1 S 2,0mm S 2,8mm L2 2,0mm 2,8mm B B L3 2,0mm 2,8mm S 2,0mm S 2,8mm L4 Figura 5 Desenho esquemático da disposição de inserção dos implantes nas vértebras lombares Ao final da inserção dos implantes nas vértebras lombares os animais da fase aguda (cinco animais) foram eutanasiados com dose excessiva (90 mg/kg) Tiopental

36 Material e Métodos 35 sódico (Tiopentax, Cristália, Itapira, São Paulo, Brasil) por via intravenosa. (MASSONE,1999; CONSELHO FEDERAL DE MEDICINA VETERINÁRIA DO BRASIL, 2002) Os animais destinados a avaliação crônica do experimento após a implantação dos parafusos tiveram a abertura cirúrgica lavada com soro fisiológico seguido de suturas por planos da musculatura, fáscias e tecido subcutâneo com fio absorvível de poliglactina (Vicryl Ethicon,Sommerville,NJ,USA ) e o tecido tegumentar com fio de nylon 3.0 (Mononylon Ethicon,Sommerville,NJ,USA). Posteriormente, foi aplicado curativo oclusivo com gazes estéril e realizado o enfaixamento do mesmo, visando manter a assepsia do local. 3.6 Cuidados Perioperatórios Anteriormente ao procedimento cirúrgico os animais foram submetidos a profilaxia infecciosa, sendo utilizada dose intramuscular pré-operatória de UI/kg do Pentabiótico Veterinário (FortDodge Campinas, SP, Brasil) que inclui Benzilpenicilina benzatina, Benzilpenicilina procaína, Benzilpenicilina potássica, Sulfato de Diidroestreptomicina e Sulfato de estreptomicina. Os animais permaneceram no Biotério do Laboratório de Bioengenharia da FMRP em observação por dois dias e foi ministrado o analgésico Cloridrato de Tramadol 3mg/kg (União Química, Pouso Alegre, MG, Brasil) via intramuscular. Após esse período os animais foram encaminhados para cuidados de rotina no Biotério Central do campus universitário onde foram observados em pastagens por oito semanas não apresentando nenhuma intercorrência. Ao fim das oito semanas (fase crônica do experimento) os animais foram eutanasiados e analisados seguindo o mesmo protocolo realizado nos estudos de fase aguda. 3.7 Preparo da amostra As colunas lombares foram extraídas em bloco cujas extremidades continham a primeira e a quarta vértebra. Em seguida, as partes moles adjacentes à coluna

37 Material e Métodos 36 vertebral foram cuidadosamente ressecadas por dissecção manual instrumentada com o intuito de individualizar somente o tecido ósseo contendo os implantes. Os conjuntos vértebra-implante foram identificados de acordo com o grupo experimental, sendo formado um total amostral de 40 conjuntos vértebra-implante para cada fase de avaliação, totalizando 80 conjuntos vértebra-implante. 3.8 Processamento histológico O protocolo histológico utilizado neste estudo foi baseado nas técnicas descritas por Donath e Breuner (1982). Após a obtenção de cada unidade de análise, composta por um conjunto vértebra-implante contendo dois implantes, subunidades foram produzidas com a finalidade de se adequarem ao processo de preparação histológica. Na confecção das subunidades, utilizou-se serra sagital para individualizar um bloco ósseo quadrangular de 1,5cm de lado contendo um único implante centralmente. Tal implante deveria estar totalmente circundado por tecido ósseo para permitir o estudo Fixação Para iniciação do processamento histológico, as amostras foram embebidas em uma solução de fixação. Esta foi utilizada durante dez dias, com troca da mesma a cada dois dias. A solução de fixação utilizada foi: Formalina Tamponada a 10 %: Formol ml Solução tampão ml Solução Tampão: Fosfato potássio monobásico...6,805 g Água destilada ml

38 Material e Métodos 37 Hidróxido de sódio...1,6 g Água destilada ml As soluções foram diluídas separadamente, usando o agitador magnético. Após a diluição, foram colocados 250mL de fosfato de potássio e 200mL de hidróxido de sódio. O ph foi mantido em 7,0 com hidróxido de sódio, quando necessário, e o volume foi completado para um litro de água destilada. Ao final do processo de fixação, iniciou-se o processo de desidratação (item 3.8.2) Desidratação A desidratação foi realizada em concentrações crescentes de álcoois, com troca da solução a cada dois dias. A concentração de álcoois e o período estão descritos abaixo: Álcool 70%...2 dias Álcool 80%...2 dias Álcool 96%...2 dias Álcool 100%...2 dias Álcool 100%...2 dias As peças foram agitadas todos os dias durante quatro horas, em um agitador magnético (Kline Ct150, Cientec, Cachoeirinha, RS, Brasil). Ao final do processo de desidratação iniciou-se o processo de banho em resina (impregnação) e em seguida foi realizado o processo de polimerização (item 3.8.3) Impregnação e Polimerização Para a impregnação e polimerização foi utilizada a resina de polimetilmetacrilato (LR White, London Resin Company, Berkshire, Inglaterra). O

39 Material e Métodos 38 conteúdo do frasco de resina foi misturado juntamente com o estabilizador (Benzoyl Peroxide 9,9 g) e mantido sob agitação mínima de quatro a seis horas. Em seguida, a solução foi filtrada para eliminar possíveis resíduos do pó na solução final, evitando assim falhas no processo de polimerização. Após a mistura, a resina foi mantida em descanso por 24 horas em refrigerador. Todo esse procedimento foi realizado em ambiente de temperatura controlada de 20 a 25º C. Posteriormente, as peças foram colocadas em resina acrílica sob agitação por uma hora e refrigeração (overnight). No dia seguinte, trocou-se a resina e as peças foram colocadas no vácuo por uma hora, e, em seguida, agitadas por mais uma hora, retornando ao refrigerador. Esse procedimento foi repetido por nove dias, trocando-se a resina a cada 48 horas. No 10º dia, as peças foram incluídas em formas de teflon com nova resina e levadas a estufa a uma temperatura de 60º C (overnight), para que ocorresse a polimerização da resina Microtomia O processo de microtomia foi realizado com auxílio de uma serra de precisão (Microslice 2, Ultratec Inc., Santa Ana, CA, EUA) do Laboratório de Histologia do Departamento de Cirurgia, Traumatologia Buco-maxilo-facial e Periodontia da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto USP. As peças foram fixadas na máquina por meio de uma cera específica (cera de abelha e breu) em um braço móvel, que permite a aproximação das peças com a lâmina. Um disco diamantado medindo 15,2cm x 0,5mm (Isomet Buehler Ltda, Lake Bluf, IL, EUA) foi acoplado à serra de precisão onde foi iniciado o processo de corte. Os cortes foram realizados no centro dos blocos no sentido longitudinal aos parafusos (Figura 6). As faces onde se encontravam os implantes foram desgastadas e polidas, utilizando-se lixas e feltros de polimento, segundo procedimento descrito no item Em seguida, os blocos foram colados à lâmina de vidro por meio de uma cola específica (Epoxy Bonder, Tecroc, Atherstone, Inglaterra). A partir daí, foram realizados novos cortes com espessuras que variaram entre 100 a 200µm, e que passaram novamente pelo processo de lixamento e polimento até atingirem uma espessura menor (entre 70 a 80µm).