METABOLISMO DESIODATIVO EM RATAS DESNUTRIDAS DURANTE A LACTAÇÃO E EM SUA PROLE NA IDADE ADULTA.

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1 UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO CENTRO BIOMÉDICO FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS METABOLISMO DESIODATIVO EM RATAS DESNUTRIDAS DURANTE A LACTAÇÃO E EM SUA PROLE NA IDADE ADULTA. SHEILA CRISTINA POTENTE DUTRA Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade do Estado do Rio de Janeiro para obtenção do grau de Mestre em Fisiopatologia Clínica e Experimental RIO DE JANEIRO 2002

2 UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO CENTRO BIOMÉDICO FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS METABOLISMO DESIODATIVO EM RATAS DESNUTRIDAS DURANTE A LACTAÇÃO E EM SUA PROLE NA IDADE ADULTA. SHEILA CRISTINA POTENTE DUTRA Rio de Janeiro 2002

3 FICHA CATALOGRÁFICA Dutra, Sheila Cristina Potente Metabolismo desiodativo em ratas desnutridas durante a lactação e em sua prole na idade adulta. / Sheila Cristina Potente Dutra xix, 78 p. Orientador: Egberto Gaspar de Moura. Dissertação (Mestrado) Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Faculdade de Ciências Médicas. 1. Restrição Protéica. 2. Função tireóidea 3. Metabolismo desiodativo. 4. Teses. I. Moura, Egberto Gaspar. II. Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Faculdade de Ciências Médicas. III. Título.

4 UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO CENTRO BIOMÉDICO FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS METABOLISMO DESIODATIVO EM RATAS DESNUTRIDAS DURANTE A LACTAÇÃO E EM SUA PROLE NA IDADE ADULTA. Sheila Cristina Potente Dutra Orientador: Prof. Dr. Egberto Gaspar de Moura Co-Orientador: Profª. Drª. Magna Cottini da Fonseca Passos Aprovada em 02 de Agosto de 2002, pela banca examinadora: Profª. Drª. Ana Luiza Maia Prof a. Dr a. Vânia Correa da Costa Prof a. Dr a. Celly Cristina A. Nascimento Saba RIO DE JANEIRO 2002

5 Este trabalho foi realizado no Laboratório de Fisiologia Endócrina do Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes da Universidade do Estado do Rio de Janeiro, sob orientação do profº. Egberto Gaspar de Moura, com apoio financeiro concedido pela CAPES, CNPq e FAPERJ.

6 Tomei um caminho... tomei vários caminhos: a profissão, a conquista de mim mesma, o serviço do próximo... Quantas partidas marcaram minha vida, partidas na alegria, no entusiasmo, no propósito de chegar! Pus-me a caminho... Mas na terra todo caminho é uma ascensão. É também depressa conheci a estafa das subidas... a rigidez das trilhas... a força do vento contrário... E o quanto é bom chegar e perceber que ainda se tem muito para caminhar (Ludovic Giraud)

7 Aos meus pais, que me ensinaram com amor e dignidade a lutar pelos meus sonhos e ideais. Espero ser sempre motivo de orgulho para eles. e Ao Edson Branco pelo amor, carinho, compreensão e estímulo constante.

8 AGRADECIMENTOS Ao Professor Egberto Gaspar de Moura pela orientação, dedicação e pelas críticas, que me fizeram amadurecer e aprender muito ao longo desses dois anos, e me estimularam a buscar o saber mais e mais... Uma excelente referência como chefe, professor e pesquisador. À Professora Magna Cottini da Fonseca Passos pelo carinho, dedicação, amizade, estímulo e orientação, fundamentais para a minha iniciação na carreira científica, e principalmente, por acreditar em mim. É um referencial como profissional, professora e pesquisadora dentro da minha área de formação, Nutrição. À Professora Patrícia Lisbôa pela grandiosa ajuda em todas as etapas deste trabalho, pelo estímulo e otimismo, pelos ensinamentos em desiodação e pela revisão criteriosa da tese. A Professora Carmen Pazos de Moura, do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da UFRJ, pelas críticas e opiniões durante a realização deste trabalho e por colocar a infraestrutura de seu laboratório à disposição, sempre que necessário para a realização desta tese. À Coordenação de Pós-Graduação em Fisopatologia Clínica e Experimental pelo auxílio financeiro através da compra de material necessário para realização deste trabalho. À Professora Celly Cristina A. Nascimento Saba pela manutenção da infra-estrutura do Departamento, permitindo a execução de nossos trabalhos. À doutoranda e amiga Regina Santos pela presença marcante e companheirismo desde a sua chegada ao nosso laboratório e pela grandiosa ajuda nos experimentos e ensaios enzimáticos. À amizade das recém-mestres, Patrícia Dias de Brito e Cristiane de Oliveira Cravo, pelo carinho e por partilharem comigo as dúvidas e angústias desde o início e, principalmente pelas palavras amigas e de estímulo quando algo errado ocorria.

9 Às alunas de iniciação científica Thaís, Luciana, Carla, Aline, Elaine, Paula Galardo, Paula Sette e Gisele, pelo carinho e atenção no cuidado com os animais e com os experimentos, os quais foram imprescindíveis para a realização deste trabalho. À mestranda Isabella Bonomo pelo convívio agradável e pela grande ajuda nos ensaios enzimáticos Às mestrandas do laboratório: Luciana Leão, Márcia Lins Clements, Cristiane Almeida e Cláudia Motta pela convivência agradável, ajuda e palavras de estímulo. À Adriana Cabanelas (aluna de Iniciação Científica - UFRJ) pela ajuda nos ensaios enzimáticos. À Profª Cristiane R. Sólon Ribeiro pelas críticas e opiniões, pela amizade e estímulo desde a Iniciação Científica. À doutoranda Cíntia Vilanova Teixeira pela amizade, estímulo e apoio, dentro e fora do laboratório. Às amigas Ana Cláudia Santos Amaral e Fabiane Pereira Toste, que compartilharam comigo, desde a Iniciação Científica, a realização deste sonho. À técnica Lauciene pela importante ajuda na descontaminação e preparo dos materiais no tempo exato, para que pudéssemos realizar os ensaios enzimáticos. Aos funcionários do laboratório de Fisiologia Endócrina: Nelcir, Andrea e Henrique pelo carinho e colaboração sempre que solicitada. Aos funcionários da pós-graduação de Biociências: Adriano, Fabio, Marcos e Mônica, pela convivência agradável e ajuda sempre que solicitados. À funcionárias Amélia da pós-graduação em Fisiopatologia Clínica e experimental pela atenção e ajuda quando solicitadas. A todos os meus familiares e amigos, que de alguma forma participaram deste momento e me incentivaram a seguir em frente, e ao amor incondicional do Nino. Muito Obrigado!

10 ix LISTA DE TABELAS Página TABELA 1 Resumo das propriedades das iodotironinas 19 desesiodases. TABELA 2 Composição da dietas normo e hipoprotéica 29 TABELA 3 Resumo da metodologia para determinação da 33 atividade D1 e D2 em ratos

11 x LISTA DE FIGURAS Página FIGURA 1 Eixo hipotálamo-hipófise-tireóidedas 7 FIGURA 2 Representação esquemática da cascata de 10 desiodação

12 xi LISTA DE GRÁFICOS GRÁFICO 1 GRÁFICO 2 GRÁFICO 3 GRÁFICO 4 GRÁFICO 5 GRÁFICO 6 GRÁFICO 7 GRÁFICO 8 GRÁFICO 9 GRÁFICO 10 Ingestão diária de ração e peso corporal de ratas lactantes desnutridas Atividade D1 no fígado e atividades D1 e D2 na tireóide de ratas lactantes desnutridas Atividades D1 e D2 na glândula mamária de ratas lactantes desnutridas Atividade D2 no tecido adiposo marrom e atividades D1 e D2 no músculo esquelético de ratas lactantes desnutridas Atividade D1 e D2 na hipófise de ratas lactantes desnutridas Concentrações séricas de TSH de ratas lactantes desnutridas Concentrações séricas de leptina e relação leptina sérica/peso corporal de ratas lactantes desnutridas Atividade D1 no fígado de animais adultos, cujas mães foram desnutridas na lactação Atividades D1 e D2 na tireóide de animais adultos, cujas mães foram desnutridas na lactação Concentrações séricas de TSH em animais adultos, cujas mães foram desnutridas na lactação Página

13 xii LISTA DE ABREVIATURAS ATG aurotioglicose BSA albumina bovina sérica C controle cdna ácido desoxirribonucleico complementar cpm contagens por minuto D1 iodotironina desiodase tipo 1 D2 iodotironina desiodase tipo 2 D3 iodotironina desiodase tipo 3 DIT diiodotirosina DNA ácido desoxirribonucléico DTT ditiotreitol EDTA ácido etilenodiamino tetracético epm erro padrão da média FSH hormônio folículo estimulante GH hormônio do crescimento H 2 O 2 peróxido de hidrogênio HTs hormônios tireóideos NIDDKD Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais 125 I radioisótopo de iodo IFN-γ interferon gama IGF-I fator de crescimento insulínico 1 IL-1β interleucina-1β Km constante de Michaelis LH hormônio luteinizante MIT monoiodotirosina NIS co-transportador de sódio e iodeto Ob gene da obesidade ptn proteína

14 xiii PTU RNA RNAm RC RP rpm RSH rt 3 SNC T 2 T 3 T 4 TAM TBG TCA TNF-α TPO TRE TRH TSH TTR UCP 6n-propil-2-tiouracil ácido ribonucléico ácido ribonucléico mensageiro restrição calórica restrição proteica rotações por minuto grupamento sulfidrila reduzido 3,3,5 -triiodotironina reversa sistema nervoso central diiodotironina 3,5,3 - triiodotironina 3,5,3,5 - tetraiodotironina (tiroxina) tecido adiposo marrom globulina ligadora de tiroxina ácido tricloroacético fator de necrose tumoral α peroxidase tireóidea (tireoperxidase) elemento responsivo ao hormônio tireóideo hormônio liberador de tireotrofina tireotrofina transtirretina proteína desacopladora

15 xiv ÍNDICE Lista de tabelas Lista de figuras Lista de gráficos Lista de abreviaturas Índice Resumo Abstract Introdução Relevância 2 Hormônios tireóideos 4 Metabolismo desiodativo dos hormônios tireóideos 8 Iodotironina desiodase tipo 1 (D1) 10 Iodotironina desiodase tipo 2 (D2) 14 Iodotironina desiodase tipo 3 (D3) 18 Função tireóidea na lactação 20 Leptina e lactação 22 Desnutrição e alteração da função tireóidea na gestação e/ou lactação 22 Desnutrição na lactação e alteração da função tireóidea na vida adulta 25 Objetivos 28 Materiais e Métodos Modelo experimental 29 Avaliação do estado nutricional 31 Determinação da atividade das desiodases 31 Página ix x xi xii xiv xvi xviii

16 xv Determinação das concentrações séricas hormonais 35 Análise estatística 35 Resultados Avaliação do estado nutricional de ratas desnutridas durante a lactação 36 Atividade das enzimas D1 e D2 em diferentes tecidos de ratas 36 desnutridas durante a lactação Concentrações séricas hormonais de ratas desnutridas durante a 43 lactação Atividade desiodase hepática e tireóidea e TSH sérico de ratos aos seis 46 meses de idade cujas mães foram desnutridas durante a lactação Discussão 49 Conclusões 60 Referências 61

17 RESUMO

18 xvi Analisamos o efeito da desnutrição durante a lactação sobre o metabolismo desiodativo dos hormônios tireóideos, a fim de investigar o mecanismo responsável pelo aumento na concentração de T 3 no soro e no leite de ratas desnutridas, assim como investigar a programação do metabolismo desiodativo em ratos adultos cujas mães foram desnutridas. Estudamos também o possível papel regulatório da leptina no metabolismo desiodativo. Ratas Wistar (3 meses) foram divididas em 3 grupos no dia do nascimento da ninhada: controle (C)- ração com 23% de proteína; restrição protéica (RP)- ração com 8% de proteína; restrição calórica (RC)- ração com 23% de proteína, restrita à quantidade ingerida pelo grupo RP. A atividade das iodotironinas desiodases, tipos 1 e 2 (D1 e D2) no fígado, tireóide, hipófise, glândula mamária, músculo esquelético e tecido adiposo marrom (TAM) nas mães, bem como as concentrações séricas de TSH e leptina foram avaliadas nas ratas aos 4, 12 e 21 dias da lactação. Nas proles desmamadas aos 21 dias e realimentadas com dieta normal, a atividade desiodase tireóidea e hepática e o TSH sérico foram avaliados aos 180 de idade. A atividade desiodase foi quantificada através da liberação de 125 I a partir 125 I-rT3, utilizando condições de ensaio apropriadas para cada enzima e tecido. Ambas as dietas, hipoprotéica e hipocalórica, promoveram redução (p<0,05) no peso corporal das ratas. Ratas RP consumiram 40% menos ração que o grupo C, a partir do 6º dia da lactação. A atividade D1 hepática não está alterada aos 4 e 21 dias da lactação nos dois grupos tratados, estando diminuída no 12º dia nas ratas RP. Ratas RP não apresentaram alteração na atividade D1 tireóidea, enquanto que ratas RC apresentam menor atividade desta enzima aos 4 e 21 dias da lactação e maior atividade aos 12 dias. Detectamos aumento da atividade D2 tireóidea em ambos os grupos desnutridos em todos os períodos da lactação, sugerindo que esta enzima contribui para o aumento de T3 sérico. As atividades D1 e D2 no tecido mamário estão diminuídas no 4º dia da lactação nas ratas RP, enquanto que nas ratas RC há um aumento da atividade D1 período da lactação. A atividade D2 mamária encontra-se elevada nas ratas RP aos 21 dias. A atividade D2 no TAM está aumentada nas ratas RP em todos os períodos da lactação, sendo significativa somente aos 4 dias da lactação, sugerindo que esta atividade enzimática também contribui para o aumento de T3 sérico nesses animais. Ratas RC apresentaram queda da D2 no TAM no 12º e 21º dia da lactação. As ratas RP apresentam aumento na atividade da D1 muscular ao final da lactação. O grupo RC não apresenta diferença na atividade D1 neste tecido, mas

19 xvii apresenta aumento da atividade da D2 aos 4 dias da lactação. Ratas RP não apresentam alteração na atividade D2 no músculo esquelético. O aumento das atividades D1 e D2 hipofisária nos grupos desnutridos, aos 21 dias da lactação, pode contribuir para a queda TSH sérico nestes animais. A leptina sérica se eleva aos 4 e 21 dias da lactação nas ratas RP, sugerindo que a leptina contribui para o aumento da atividade D2 na tireóide, hipófise e TAM. Ambos os grupos de animais adultos cujas mães foram desnutridas na lactação tem elevação na atividade D1 hepática e nenhuma alteração na atividade D1 e D2 tireóidea. O TSH sérico encontra-se diminuído em ambos os grupos. Concluimos que o aumento da atividade D2 na tireóide e no TAM podem contribuir para o aumento de T3 sérico e que parece existir uma mecanismo adaptativo na glândula mamária das ratas RP, a fim de transferir mais T3 para para a prole através do leite. A desnutrição materna na lactação programou a desiodação hepática na prole adulta..

20 ABSTRACT

21 xviii We studied the effect of malnutrition during lactation on the thyroid hormone deiodinative metabolism, to investigate the mechanism of serum and milk T 3 increase in malnourished lactating rats and the programing of deiodinative metabolism in adult rats whose mothers were submitted to malnutrition during lactation. We also studied the regulatory role of leptin in the deiodinative metabolism in this condition. Three months old female Wistar rats were randomly assigned to one of the following groups, on the day the offspring were born: C- control diet with 23% protein; PR- protein restricted diet with 8% protein; ER- energy-restricted, receiving the control diet in restricted quantities, which were calculate according to the mean ingestion of the PR group. We evaluated TSH and leptin serum concentrations, and type 1 (D1) and 2 (D2) iodothyronine deidinases activities in liver, thyroid, pituitary, mammary gland, skeletal muscle, brown adipose tissue (BAT) of dams on days 4, 12 and 21 of lactation. Serum TSH and liver and thyroid deiodinase activities were measuared in 180-days old rats whose mothers were malnourished during lactation. Deiodinase activity was determined by the released of 125 I from 125 I-reverse T 3. Both hypoprotein and hypocaloric diets promotes a reduction in the dams body weight. RP rats comsumed 40% less diet compared to controls since the 6 th day. Hepatic D1 activity was not altered in 4 and 21 days of lactation in both treated groups, and was lower in the 12 nd day in RP rats. RP rats did not present changes in thyroid D1 activity, while RC rats presented a lower enzymatic activity in 4 and 21 days of lactation and higher activity at 12 days. There was a higher thyroidal D2 activity in both malnourished groups during all the lactation, suggesting that this isoform contributes to the increase in serum T 3. Mammary D1 and D2 activities were lower in the 4 th day of lactation in RP dams, and D2 was higher at 21 st day, while in RC dams the only change observed was a higher D1 activity at the 4 th. BAT D2 activity was higher in RP during the 3 periods of lactation, suggesting a contribution of this deiodination to the circulating pool of T 3. By the contrary, RC dams showed lower BAT D2 activity in the 12 th and 21 st days. RP dams presented higher skeletal muscle D1 activity at the end of lactation, but no changes in D2 activitity. There was no skeletal muscle D1 changes in RC dams, but there was a higher D2 activity at the 4 th day. Higher pituitary D1 and D2 activities in both groups at the end of lactation can contribute to the lower TSH serum concentration. Serum leptin concentration was higher at 4 th and 21 st day in RP dams, suggesting that it could contribute to the increase in thyroid,

22 xix pituitary and BAT D2 activities. Both offspring groups when adults showed higher liver D1 activity, both no changes in thyroid deiodinases. Serum TSH concentrations were lower in both groups. In conclusion, the higher thyroid and BAT D2 activities may contribute for the higher serum T 3 concentrations in RP dams. It seems possible, that an adaptive mechanism provides more T 3 through the milk by a lower deiodination of T 3 to T 2 in RP dams. Finally, malnutrition during lactation programs liver deiodinase activity in the adult offspring.

23 INTRODUÇÃO

24 2 RELEVÂNCIA A desnutrição tem sido reconhecida como um problema econômico-social que atinge populações do mundo inteiro. A OMS define desnutrição energético-protéica como uma gama de condições patológicas que aparece por defeciência de aporte, transporte ou utilização de nutrientes pelas células do organismo, associadas quase sempre a infecções, ocorrendo com maior frequência em lactentes e pré-escolares (Sistema de Vigilância Alimentar e Nutricional, 1991). Estima-se em 240 milhões o número de crianças menores de cinco anos com comprometimento em seu crescimento físico em decorrência da desnutrição energéticoprotéica. Grande parte dessas crianças estão nos países subdesenvolvidos da África e Ásia. A América Latina também aparece de forma importante, porém com taxas menores do que as dos países africanos, enquanto no primeiro mundo praticamente não existe desnutrição (Unicef, 1994). A desnutrição na infância, indicada pelo comprometimento severo do crescimento linear e/ou pelo emagrecimento extremo da criança, constitui um dos maiores problemas enfrentados por sociedades em desenvolvimento, seja por sua elevada freqüência, seja pelo amplo espectro de danos que se associam. Estima-se que 38,1% das crianças menores de cinco anos que vivem em países em desenvolvimento, apresentam comprometimento severo do crescimento e 9,0% emagrecimento extremo (WHO, 1997). Na América do Sul a desnutrição e/ou o baixo-peso ao nascimento, estão presentes em 57% dos óbitos em menores de cinco anos de idade (Sawaya, 1997). No Brasil, o último inquérito nacional realizado pela Pesquisa Nacional de Saúde e Nutrição (PNSN,1990), constatou em 1990 a existência de 5 milhões de crianças, menores de cinco anos, com algum grau de desnutrição. Em relação às diferentes regiões do país, observou-se que no Norte e no Nordeste, a desnutrição é pelo menos duas vezes maior do que na região Centro-Oeste e quatro vezes maior que na região Sul/Sudeste (Batista Filho, 1994). Em função da importância epidemiológica da desnutrição, bem como das alterações estruturais, metabólicas, endócrinas e funcionais, que esta promove, em todo organismo, torna-se relevante a realização de trabalhos experimentais, a fim de avaliar suas conseqüências sobre os diversos sistemas orgânicos.

25 3 Dentre as alterações provocadas pela desnutrição encontram-se uma grande variedade de alterações hormonais. Concentrações séricas aumentadas ou diminuídas de vários hormônios, tais como, GH, IGF-I, TSH, HTs, FSH, LH, prolactina e insulina têm sido relatadas em seres humanos (Brow & Brasel, 1990). As concentrações anormais desses hormônios podem estar relacionados a quantidade reduzida de substratos para sua síntese e também à alterações em suas taxas de liberação, metabolização e transporte (Brow & Brasel, 1990). Recentemente evidenciamos um processo de adaptação da função tireóidea e da glândula mamária de ratas submetidas à desnutrição protéica durante a lactação (Ramos et al., 2000; Passos et al., 2001a; Passos et al., 2001b). Observamos que nestes animais há aumento da concentração sérica de T 3 durante toda a lactação e maior secreção deste hormônio para o leite, já no ínicio da lactação até o meio desta (Passos et al., 2001a), bem como diminuição de T 4 e aumento na secreção de iodeto no leite, ao final da lactação (Passos et al., 2001b). A restrição calórica também estava associada com maior conteúdo de T 3 no leite, porém num período mais tardio da lactação. Estas alterações são sugestivas de um processo adaptativo que permitiria a maior transferência, através do leite, de iodo e de T 3 para os filhotes, a fim de minimizar a gravidade de alterações neurológicas decorrentes de um hipotireoidismo neonatal. Não sabemos ainda, os mecanismos responsáveis pelo aumento de T 3 sérico e no leite nas ratas com desnutrição protéica, visto que Ramos et al (2000) observaram que ao final da lactação, a atividade da enzima iodotironina desiodase tipo 1 (D1) tireóidea e hepática não estavam aumentadas nas ratas com desnutrição protéica. Nas ratas com desnutrição calórica, observaram uma diminuição da D1 na tireóide e nenhuma alteração na hepática. Portanto, o aumento de T 3 no soro e no leite neste período, não poderia ser atribuído a um aumento na atividade da D1 nesses tecidos. Surgiu então, a hipótese de que uma maior desiodação do T 4 possa estar ocorrendo em outros tecidos, tais como glândula mamária, músculo esqulético, tecido adiposo marrom e outros. É provável também que a iodotironina desiodase tipo 2 (D2), esteja contribuindo para a geração de T 3 circulante, visto que estudos recentes sugerem que esta enzima, sob determinadas condições metabólicas, pode fornecer T 3 para a circulação (Iglesias et al., 1987; Diano et al., 1998; Wu, 1990). Demonstramos recentemente que a desnutrição protéica e calórica durante a lactação causa alterações na função tireóidea e no peso corporal da prole na idade adulta. Observamos que a prole de ratas em desnutrição protéica, após a realimentação, apresentram

26 4 menor peso corporal, elevada captação de iodo pela tireóide e alta concentração sérica de T 3 aos 6 meses de idade, enquanto a prole de ratas em desnutrição calórica apresentaram maior peso corporal e aumento de T 3 sérico (Passos et al., 2002). Estes resultados reforçam dados epidemiológicos e experimentais que sugerem que a desnutrição precoce, está associada a várias alterações endócrino-metabólicas na vida adulta, afetando a predisposição à doenças, tais como obesidade, diabetes e hipertensão (Barker, 1994; Barker, 1995; Lucas, 1994; Martin et al., 1998; Barker, 1998; Godofrey & Barker, 2000; Levin, 2000; Harding et al., 2001). Entretanto, poucos trabalhos (Passos et al., 2002) avaliaram os efeitos da desnutrição materna durante a lactação, sobre a função tireóidea da prole na idade adulta. Ainda não conhecemos os mecanismos responsáveis pelas alterações na função tireóidea dos animais, cujas mães foram desnutridas durante a lactação. É provável que o aumento de T 3 sérico seja devido à maior desiodação de T 4. Dessa forma, faz-se necessário à avaliação da atividade das desiodases nesses animais, uma vez que não há relatos na literatura sobre a atividade dessas enzimas em animais adultos cujas mães foram desnutridas durante a lactação. Neste estudo analisamos os efeitos da restrição protéica ou calórica durante a lactação sobre a atividade das desiodases D1 e D2 em diversos tecidos das ratas em diferentes períodos da lactação e nas proles com 180 dias de idade, com o objetivo de identificar um dos mecanismos responsáveis pelas alterações séricas de hormônios tireóideos encontradas nestes animais. HORMÔNIOS TIREÓIDEOS: A tireóide é uma das principais glândula do sistema endócrino humano, sendo responsável por elaborar, armazenar e secretar os hormônios triiodotironina (T3) e tetraiodotironina ou tiroxina (T 4 ), que exercem papel essencial na regulação do metabolismo corporal, sendo críticos para o crescimento e desenvolvimento normais. A glândula tireóide é composta por uma série de folículos de tamanhos variáveis, que são formados por uma única camada de células epiteliais que circundam o colóide, um material glicoprtéico onde os hormônios tireóideos ficam armazenados. Estas células exibem uma superfície basolateral voltada para membrana basal, espaço intersticial e

27 5 leito capilar, e uma superfície apical voltada para o colóide conhecida como interface célula/colóide (De Groot et al, 1996). Os hormônios tireóideos, T 4 e T 3, são derivados iodados do aminoácido tirosina, sendo sintetizados e secretados pela glândula tireóide sob estímulo da tireotrofina (TSH) hipofisária (De Groot et al., 1996). A biossíntese dos hormônios tireóideos depende fundamentalmente, da entrada de iodo na glândula, da presença da enzima peroxidase tireóidea (TPO), de cofatores para produção de peróxido de hidrogênio e da proteína aceptora do iodo, denominada tireoglobulina (De Groot et al., 1996). A tireoglobulina é uma glicoproteína (~660 kda), que serve como suporte molecular para síntese de T 4 e T 3 na interface célula/colóide e armazenamento de hormônio e iodeto (De Groot et al., 1996). O iodo é elemento essencial para a síntese dos hormônios tireóideos, estando presente principalmente em alimentos como frutos do mar, derivados do leite e pão. Devido à sua importância na biossíntese hormonal, estabeleceu-se a adição de iodeto de potássio ao sal de cozinha, assegurando um consumo de iodo adequado para a população (Bianco & Kimura, 1998). A primeira etapa da biossíntese hormonal é o transporte de I - através da membrana basolateral da célula folicular tireóidea. Este transporte ocorre por um processo ativo promovido pelo co-transportador de sódio e iodeto, o NIS (Na + /I - symporter), sendo sua atividade dependente da Na + / K + ATPase (Carrasco, 1993; Daí et al., 1996). A eficiência de captação de iodeto (I - ) é de cerca de 0,2, ou seja, aproximadamente 1/5 de todo o iodeto que perfunde a tireóide é captado a cada passagem pela glândula. O iodeto na forma livre tem uma vida muita curta (10-20 minutos). Ao entrar na célula folicular ele migra em direção à membrana apical, onde se liga a um transportador iodeto/cloreto, uma proteína codificada pelo gene pendrina, sendo então, rapidamente oxidado e organificado na molécula de tireoglobulina, formando os radicais mono e diiodotirosina (MIT e DIT), que se acoplam dando origem aos hormônios tireóideos (Taurog, 1996). Os processos de oxidação do iodeto, iodação da tireoglobulina e acoplamento das iodotirosinas são mediados pela TPO, que requer como cofator peróxido de hidrogênio, sintetizado pela enzima NADPH-oxidase (Carvalho et al., 1996; Dunpuy et al., 1999). A secreção hormonal é dependente de um processo de endocitose da tireoglobulina, seguida de proteólise. O T 4 é produzido somente pela glândula tireóide,

28 6 enquanto o T 3 é secretado em menor quantidade pela tireóide, sendo a maior parte proveniente da desiodação do T 4 em diferentes tecidos. Pode ocorrer também, reutilização do iodo pela desiodação de MIT e DIT, assim como desiodação intratireóidea de T 4 a T 3 pelas enzimas iodotironina-desiodases tipos 1 e 2 (Larsen & Ingbar, 1992; De Groot et al., 1996), que serão detalhadas posteriormente. Em condições normais a proporção da secreção tireóidea diária de T 4 e T 3, em humanos é de aproximadamente 14:1 e em ratos de 5,7:1, sugerindo que em murinos, a contribuição tireóidea para a taxa de produção diária de T 3 é mais importante do que no homem (Larsen & Ingbar, 1992; Chopra, 1996; Escobar-Morreale et al., 1996). Chanoine et al (1993 a,b) estimaram que 55% de todo o T 3 na circulação do rato provém da tireóide. A maior parte dos hormônios tireóideos circula acoplada a proteínas transportadoras, que são: a TBG (globulina ligadora de tiroxina), a TTR (transtirretina) e a albumina. No homem aproximadamente 70% de T 4 e T 3 estão ligados a TBG, 10% do T4 é ligado à TTR e 15% são carreados pela albumina. Enquanto uma pequena fração de T 3 plasmático encontra-se ligado à TTR e cerca 25% à albumina (Utiger, 1996). Em ratos, a TTR é a principal carreadora dos hormônios tireóideos, sendo responsável por 55% do transporte de T 4 ; já a TBG garante o transporte de 18% e a albumina de 15% (Davis, 1970). Todas as etapas de biossíntese dos hormônios tireóideos são estimuladas pelo TSH, hormônio glicoprotéico secretado pelas células tireóficas da adeno-hipófise. Este promove importantes efeitos no crescimento, morfologia e vascularização da tireóide, além de aumentar a captação de I -, a atividade TPO, a síntese de tireoglobulina, a geração de H 2 O 2, a captação de glicose, lipídeos e aminoácidos, o metabolismo energético, a síntese de DNA, RNA e proteínas estruturais tireóideas. O TSH é regulado principalmente pela interação do controle neural exercido pelo hipotálamo, através do TRH (hormônio liberador de tireotrofina), e pela retroalimentação (feedback) negativa, realizada pelos hormônios tireóideos (Utiger, 1996). O feedback negativo dos hormônios tireóideos sobre a secreção de TSH é exercido de várias formas. Pode atuar bloqueando a produção de TRH ou reduzindo a expressão de seus receptores de membrana no tireotrofo (Reichlin, 1992; Kakucska, 1992); pode também estimular a secreção de outras substâncias hipotalâmicas que tem efeito inibitório sobre o TSH, tal como a somatostatina (Scalon, 1991). Contudo, a regulação mais importante é a inibição da secreção de TSH produzida por ação direta de T 3 no tireotrofo (Shupnik et al., 1986), sendo este T 3 proveniente principalmente da desiodação intra-

29 7 hipofisária do T 4 circulante. Portanto, as concentrações circulantes de T 4 se correlacionam melhor com as concentrações de TSH do que com as de T 3 (Thorner et al., 1998). noradrenalina opiácios + Hipotálamo T4 T3 TRH + dopamina somatostatina Hipófise T4 T3 glicocorticóides + estrógenos TSH + Tireóide T4 T3 Figura 1: Eixo hipotálamo-hipófise-tireóide. Adaptada de Nunes MT (1999). Outros fatores neurais, neuro-hormonais, humorais e locais podem influenciar, direta ou indiretamente, a liberação normal de TSH, dentre eles: glicocorticóides, estrogênio, testosterona, GH, noradrenalina, colecistocinina, neuromedina B, GRP, serotonina, neurotensina, substância P (Morley, 1981; Arisawa et al., 1989; Riechilin, 1992; Santos et al., 1995; Moura et al., 1999; Ortiga et al., 1996; Pazos-Moura et al., 1996 ).

30 8 O T 3 é considerado o hormônio tireóideo metabolicamente ativo, pois interage 10 a 15 vezes mais avidamente com o receptor nuclear que o T 4, considerado um próhormônio. O T 3 age através de sua interação com receptores específicos localizados no núcleo ou na mitocôndria das células alvo. O complexo hormônio-receptor liga-se a regiões específicas do DNA, conhecidas como TRE (elemento responsivo aos hormônios tireóideos) aumentando a transcrição gênica (Utiger, 1996). Além disso, sugere-se que uma série de efeitos rápidos dos hormônios tireóideos ocorram pela atuação destes na membrana celular, sendo predominantemente exercidos pelo T 4 (Davis & Davis, 1997; Leonard & Farwell, 1997). Tais ações não genômicas parecem envolver proteínas cinases dependentes de cálcio e AMPc (Wondisford et al., 1994). Os hormônios tireóideos, através destes mecanismos, exercem múltiplas funções no organismo, destacando-se seus efeitos sobre o crescimento corporal e desenvolvimento do sistema nervoso central, bem como o controle de várias funções homeostáticas, incluindo a termogênese e a manutenção do metabolismo basal. Dessa forma, alterações em suas concentrações, principalmente em períodos críticos para o estabelecimento dessas funções, podem trazer conseqüências graves aos vários sistemas orgânicos relacionados direta ou indiretamente com os hormônios tireóideos. METABOLISMO DESIODATIVO DOS HORMÔNIOS TIREÓIDEOS Desde a década de 70 ficou bem estabelecido que a maior parte do T 3 e do rt 3 circulantes era proveniente da desiodação do T 4 (Pitt-Rivers et al., 1955; Lassiter & Stanbury, 1958; Sterling et al., 1970). Em indivíduos eutireóideos, a principal via de metabolização dos hormônios tireóideos é a desiodação. Aproximadamente 80% do T 4 circulante é desiodado para gerar T 3 ou rt 3. O restante sofre degradação não desiodativa (Larsen, et al., 1998). Nos tecidos, o T 3 ligado a receptores nucleares pode ser proveniente, em proporções distintas, da circulação ou da produção local (Silva et al., 1982). Estudos realizados em hipófise, cérebro e tecido adiposo marrom de ratos, demonstraram que a desiodação intracelular de T 4 contribui em cerca de 50% ou mais para o pool de T 3 ligado aos receptores nucleares nestes tecidos (Larsen et al., 1981; Crantz et al., 1982; Silva et al., 1982).

31 9 A monodesiodação de T 4 consiste na redução do átomo de iodo do anel externo (fenólico) na posição C5 ou C3, ou do anel interno (tirosílico) na posição C5 ou C3. Estudos fisiológicos e bioquímicos levam a duas reações distintas de desiodação: a desiodação do anel fenólico ou 5 -desiodação, que converte T 4 à T 3 e rt 3 à T 2, sendo conhecida como via bioativadora, pois é a única que gera T 3 ; e a desiodação do anel tirosílico ou 5-desiodação, conhecida como via bioinativadora, pois gera rt 3 (hormônio biologicamente inativo) e T 2, a partir da catálise de T 4 e T 3 respectivamente (Köhrle, 1999). As reações de desiodação são catalisadas por um grupo de enzimas denominadas iodotironinas desiodases. Os estudos têm identificado três isoenzimas diferentes: tipos 1 (D1), 2 (D2) e 3 (D3). A 5 -desiodação é catalisada pela D1 e D2, enquanto a 5-desiodação é caltalizada pela D1 e D3 (St. Germain, 1997). Estas isoenzimas contém em seu sitío ativo uma selenocisteína e diferem entre si, por suas características cinéticas, substratos preferenciais, seletividade da reação que catalisam e por sua susceptibilidade à inibição por compostos, tais como o 6-propil-2-tiouracil (PTU) e o aurotioglicose (ATG) (Larsen et al., 1998). O metabolismo desiodativo dos hormônios tireóideos tem sido estudado in vitro em diferentes tecidos, levando-se em consideração as propriedades específicas das desiodases, sendo requerido a presença de compostos como o 2-mercaptoetanol, o 2,3 dimercapropanol e o ditiotreitol (DTT), que por possuirem um grupo sulfidrila livre, agem como cofatores para a reação enzimática (Köhrle, 1996). Algumas observações sugerem que, in vivo os cofatores variam de acordo com o tecido e também com o tipo de desiodase (Kacsoh, 2000). O glutation reduzido, fornecendo radicais sulfidrilas, parece ser o cofator necessário para a atividade D1 in vivo (Leonard & Visser, 1986). A homeostasia dos hormônios tireóideos no plasma e nos tecidos depende da atividade coordenada das desiodases nos diferentes tecidos. As concentrações plasmáticas de T 4 e T 3 são constantes para que todos os tecidos sejam igualmente expostos aos hormônios livres. Entretanto, as concentrações de T 3 nos tecidos variam de acordo com a quantidade de hormônio transportado e com a atividade das desiodases. Estas últimas podem aumentar ou diminuir o T 3 e, consequentemente, os complexos T 3 -receptor, independentemente dos níveis plasmático dos hormônios tireóideos (Larsen et al., 1981; Bianco et al., 2002). Dessa forma, alterações nas atividades desiodase em tecidos específicos podem alterar o efeito hormonal, principalmente em tecidos onde os efeitos sejam predominantemente devido ao T 3 gerado localmente (Köhrle, 1999).

32 10 I I NH 2 3' 3 HO O CH 2 -CH-COOH 5' 5 I I Tiroxina (T 4 ) I I NH 2 HO O CH 2 -CH-COOH I 3, 5, 3 -Triiodotironina (3, 5, 3 - T 3 ) I I NH 2 HO O CH 2 -CH-COOH I 3, 3, 5 - Triiodotironina (T 3 - reversa) I NH 2 HO O CH 2 -CH-COOH I 3, 5 -Diiodotironina (3, 5 - T 2 ) I I NH 2 HO O CH 2 -CH-COOH 3, 3 -Diiodotironina (3, 3 - T 2 ) I NH 2 HO O CH 2 -CH-COOH I 3, 5 -Diiodotironina (3, 5 - T 2 ) I NH 2 HO O CH 2 -CH-COOH 3 -Monoiodotironina (3 - T 1 ) I NH 2 HO O CH 2 -CH-COOH 3 -Monoiodotironina (3 - T 1 ) NH 2 HO O CH 2 -CH-COOH Tironina (T 0 ) Atividade 5 desiodase Atividade 5 desiodase Figura 2: Representação esquemática da cascata de desiodação das iodotironinas. Adaptado de Engler & Bulger (1984) e Leonard & Visser (1986). Iodotironina Desiodase Tipo 1 (D1) A D1 é a isoenzima mais estudada, sendo a primeira a ser identificada como responsável por catalisar a conversão de T 4 a T 3, sendo também a primeira a ser clonada. O cdna da D1 foi clonado em ratos, camundongos, humanos e outras espécies e revelam alto

33 11 grau de homologia e compartilham características estruturais. O RNAm apresenta em torno de 2-2,1 kb e todos contém um códon UGA no centro ativo, que codifica uma selenocisteína, indispensável para a máxima atividade enzimática, sendo então classificada como uma selenoproteína (Berry et al., 1991a; Schoenmakers et al., 1993; Mandel et al., 1992). O selênio parece ser parte integral de sua unidade catalítica primária (Veronikis, 1996). Estima-se que o peso molecular da D1 está entre 50 a 60 KDa e parece ser composta de duas unidades, sendo possivelmente um homodímero (Leonard et al., 2000). A D1 catalisa a desiodação do T 4 e rt 3, gerando principalmente T 3 e 3,3 T 2, respectivamente, além de também desiodar outras iodotironinas. Os substratos preferenciais para a desiodação são, em ordem decrescente, rt 3, T 4, 3 5 T 2, 3,3 T 2 (Körhle, 1999). Quanto ao anel de desiodação, a D1 pode remover o iodo tanto do anel fenólico como do tirosílico, porém parece ter preferência por desiodar o anel fenólico do T 4 e rt 3 (Larsen & Berry, 1995), sendo o ph intracelular e a sulfatação das iodotironinas importantes para determinar qual o anel será desiodado (Leonard & Visser, 1986; Leonard & Köhrle, 1996). A cinética da reação da D1 é do tipo ping-pong, dividida em 2 etapas distintas. No primeiro passo a D1 retira o iodo na posição correspondente da iodotironina, levando a oxidação do grupo sulfidril da enzima ao estado sulfenil, o qual é reduzido pelos cofatores tióis, completando o ciclo catalítico e regenerando a enzima para uma nova desiodação (Visser et al., 1978; Leonard & Rosenberg, 1980). Vários inibidores da atividade D1 têm sido identificados. Dentre os mais conhecidos e utilizados nos estudos está o PTU, que é um inibidor competitivo reversível, competindo com o cofator, e o iodoacetato, que altera irreversivelmente o centro ativo da enzima. O ácido iopanóico e também a ATG possuem ação inibitória (Oppenheimer et al., 1972; Leonard & Visser, 1984). A D1 é amplamente distribuída pelos tecidos, porém o seu conteúdo varia muito entre os órgãos. No rato, detecta-se altos níveis de atividade específica no fígado, rim e tireóide, comparados a outros tecidos, que apresentam menos de 10% da atividade hepática e renal, tais como: músculo esquelético, glândula mamária lactante, placenta, intestino, baço, coração, pulmão, glândula salivar, tecido adiposo marrom (TAM) e branco, pele, cerébro e hipófise (Chopra 1977; Tsukahara et al., 1989; Leonard & Körhle, 1996). Em humanos, a atividade D1 é notavelmente ausente no cérebro, sendo encontrada principalmente no fígado,

34 12 rim, tireóide e em menor extensão na placenta, hipófise, tecido adiposo branco e em células mononucleares (Campos- Barros et al., 1996; Nishikawa et al., 1998). A localização subcelular exata da D1 ainda é discutida e parece variar de órgão para órgão. Alguns autores a relacionam com a membrana plasmática no rim, tireóide e em células da glia (Leonard & Rosenberg, 1978; Santini et al., 1995;Baqui et al., 2000; Leonard et al., 2000 ); no fígado parece estar presente no retículo endoplasmático (Leonard & Körhle, 1996). O principal papel fisiológico da D1 é contribuir para produção da maior parte do T 3 circulante sob condições metabólicas normais (Körhle, 1999). Estudos em ratos tireoidectomizados recebendo T 4 e ratos eutireóideos, ambos tratados cronicamente com altas doses de PTU (para inibir a D1), demonstraram que a taxa de conversão de T 4 a T 3 diminui em cerca de 50%, indicando que a D1 é responsável por metade da produção extratireóidea de T 3 (Larsen & Frumess, 1977; Oppenheimer et al., 1972). Em humanos essa contribuição parece ser bem menor (25%) (Inada et al., 1975; Lum et al., 1984; Nicoff et al., 1984). Alguns autores têm sugerido que a D1 hepática é a principal produtora de T 3 para a circulação (Chopra, 1996; Köhrle, 1996). Contudo, no rato destaca-se a relativa importância da desiodação intratireóidea para a manutenção destas concentrações séricas (Chanoine et al, 1993 a e b; Michell et al., 1996). A atividade D1 tireóidea pode ser de maior importância para a produção relativa de T 3, sob condições de estresse sistêmico onde a contribuição da D1 hepática está diminuída, tais como jejum, sepse e trauma (Everts et al., 1996); ou sob condições de deficiência de iodo ou selênio e durante hipotireoidismo, quando as concentrações de TSH estão elevadas e estimulam a D1 tireóidea (Chanoine et al., 1993; Köhrle, 1993; Villet et al., 1998). Em outros tecidos, a D1 aparentemente não contribui de forma significativa para a manutenção do T 3 circulante ( Köhrle, 1996). A D1 também tem a função de inativar os hormônios tireóideos e seus metabólitos no hipertireoidismo, a fim de contribuir para a eliminação do excesso de hormônios ( Köhrle, 1996). A regulação da atividade e expressão da D1 envolve vários fatores e condições metabólicas. Destacam-se principalmente os hormônios tireóideos, além de outros como, os glicocorticóides, as citocinas, as carências nutricionais e o período de desenvolvimento. O aumento da atividade e RNAm da D1 pelos hormônios tireóideos é bem documentado em ratos, camundongos e humanos (Berry et al., 1990; Berry et al., 1991; Maia et al., 1995a,b). Foi demonstrato que o gene da D1 humano (Dio1) possui dois TREs (Zhang

35 13 et al, 1998). O T 3 parece estimular a expressão gênica da D1, elevando em até 5 vezes o seu RNAm em fígado e rim de ratos e em aproximadamente 3 vezes em cultura de células tireóideas (FRTL-5), de hepatócitos e de células somatotróficas hipofisária (Menjo et al., 1993; Berry et al., 1990; Toyoda et al., 1992; Maia et al., 1995a). Maia et al (1995b), demonstrou que mesmo camundongos deficientes na atividade D1 (apenas 10% de atividade), são responsivos a administração de T3. No hipotireoidismo, a atividade D1 hepática, renal e hipofisária encontra-se reduzida (Leonard & Visser, 1986; Escobar-Morreale et al., 1996); já no hipertireoidismo, experimental ou clínico, ocorre um aumento da atividade desiodase nos rins e no fígado. A atividade D1 tireóidea parece ter uma modulação diferenciada, sendo estimulada, principalmente pelo TSH, tanto em ratos como em humanos (Ishii et al., 1981, Wu et al., 1985; Erickson et al., 1988). Em ratos hipofisectomizados, observou-se diminuição da atividade D1 tireóidea e a reposição com T4 não recuperou esta atividade (Leonard & Köhrle, 1996). A regulação da D1 pelos glicocorticóides ainda não é bem compreendida e tanto a inibição como a estimulação da D1, tem sido mostrado em diferentes modelos animais e em humanos (Menjo et al., 1993). A mesma controvérsia é observada para as citocinas. Alguns estudos in vitro sugerem inibição da atividade D1 tireóidea pelo IFN-γ (interferon γ) e pelo TNF-α (fator de necrose tumoral α) (Tang et al, 1995). Todavia, in vivo o TNF-α e a IL-1β (interleucina 1 β) não inibem a enzima (Leonard & Koehrle, 1996). Quanto aos fatores nutricionais que modulam a atividade e RNAm da D1, tem sido destacado a deficiência de selênio, o jejum e a desnutrição. Estudos em ratos submetidos à deficiência de selênio, demonstraram que ocorre uma queda na atividade D1 hepática e renal (Beckett et al., 1987; Beckett et al., 1989; Beckett et al., 1990; De Palo et al., 1994), enquanto a atividade desta enzima na tireóide e na hipófise não se altera (Meinhold et al., 1992; Bates et al., 2000). No jejum também parece ocorrer diminuição da atividade D1 hepática, renal e tireóidea, em parte devido a diminuição da proteína em um nível pretraducional (Kaplan, 1979; O Mara et al., 1993; Lisbôa, 2001a) ou em conseqüência à diminuição de cofatores tióis (Harris et al., 1979). Estudos demonstram que a atividade da D1 sofre mudanças em função do desenvolvimento ou envelhecimento. Há relatos de que na vida fetal em humanos e ovinos, a desiodação eleva-se gradualmente a partir do fim do primeiro trimestre de gestação. Logo após o nascimento, há um aumento, não muito bem compreendido, da atividade D1. Bates et

36 14 al. (1999) demonstraram que a atividade D1 no fígado, rim é maior nos animais adultos, enquanto que a D1 do intestino é maior no décimo dia de vida. Por outro lado, em ratas velhas tem sido demonstrado diminuição na atividade D1 hipofisária, sem qualquer alteração intratireóidea total (Correa da Costa & Rosenthal, 1996). Foi relatado também, que fêmeas velhas apresentam atividade D1 hepática menor em relação às jovens, porém, a atividade D1 hepática é maior nas fêmeas velhas do que nos machos velhos (Correa da Costa, 2000). Quanto à expressão gênica da D1 tireóidea, não foi observada qualquer alteração significativa do seu RNAm durante o envelhecimento em ratos (Correa da Costa, 2000) Outros fatores também parecem modular positiva ou negativamente a atividade e expressão da D1 em tecidos específicos, tais como: testosterona e estrogênio (Lisbôa, 1997a, Lisbôa et al., 1997b; Lisbôa et al., 2001b; Lisbôa et al., 2001c), insulina (Nascimento- Saba et al., 1997), GH (hormônio do crescimento); IGF-1 (fator de crescimento insulínico) entre outros (Bianco et al., 2002). Recentemente foi sugerido que a leptina também atua regulando a atividade D1. Lisbôa (2001a) demonstrou que em ratos eutireóideos, após 30 e 120 minutos da administração de leptina, ocorreu um aumento de 40% na atividade D1 tireóidea, enquanto o TSH só se elevou após 2 horas. Sugerindo, então, que a leptina atue regulando rápida e positivamente a atividade D1 tireóidea. A recente identificação de receptores específicos de leptina na tireóide de ratos, sugere que a leptina pode estar atuando diretamente nos tireócitos (Nowak et al, 2002), contribuindo para a ativação da desiodase. Segundo Cusin et al. (2000) animais tratados cronicamente com leptina apresentaram restauração da atividade da D1 hepática, reduzida pelo jejum. Estes autores atribuíram a este efeito estimulador da leptina sobre a D1 no fígado, o fato do T 3 sérico ser mantido normal em relação ao controle com ingesta alimentar reduzida. Entretanto, parece que a regulação da desiodase pelos hormônios tireóideos é maior que o exercido pela leptina, pois em animais hipotireóideos foi encontrado aumento de leptina plasmática (Escobar-Morreale et al., 1997) e nesta situação é bem documentado a diminuição da D1 hepática (Escobar-Morreale et al., 1996). Iodotironina Desiodase Tipo 2 (D2) Esta isoforma foi clonada em anfíbios, ratos, camundongos e humanos. O cdna para a D2 em mamíferos tem 7,8 kb e codifica o maior RNAm entre as outras isoformas (Croteau et al., 1996; Salvatore et al., 1996; St. Germain & Galton, 1997). A

37 15 clonagem da D2 provou definitivamente que esta também é uma selenoproteína com cerca de 30 kb (Croteau et al., 1996; St. Germain & Galton, 1997). A D2 catalisa a remoção do iodo do anel externo do T 4 e do rt 3, assim como a D1, porém só realiza a 5 desiodação. Esta isoenzima apresenta algumas características que a distingue da D1, sendo as mais importantes: insensibilidade in vivo e in vitro ao PTU e possuir baixo Km para T 4 comparado a rt 3 e, devido a este fato, vem constantemente sendo designada como desiodade de baixo Km (Leonard & Safran 1994). Tanto o T 4 quanto o rt 3 são excelentes substratos para a D2, no entanto ela possui maior afinidade pelo T 4 (Salvatore et al., 1996a). A D2 requer altas concentrações de compostos reduzidos (tióis), podendo ser este o motivo relacionado a resistência dessa isoforma ao PTU, provavelmente por uma proteção dos grupos SH essenciais à atividade enzimática (Refetoff & Nicoloff, 1995). A reação de desiodação catalisada pela D2 demonstra cinética de reação sequencial, sugerindo que tanto o substrato como os cofatores tióis precisam combinar com a enzima antes da reação acontecer (Visser et al., 1983). Alguns compostos como o iodoacetato e o ácido iopanóico, inibem a atividade D2 possivelmente por ter grande semelhança com as iodotironinas, o que geraria uma competição pelo sítio ligador do hormônio tireóideo, enquanto a ATG age por inibição não competitiva (Köhrle et al., 1991). Sabe-se que a distribuição tecidual da D2 é mais ampla do que anteriormente se acreditava. Em ratos, encontra-se na hipófise (Kaplan & Yaskoski, 1980), sistema nervoso central (Visser et al., 1982), músculo esquelético e cardíaco (Tsukahara et al., 1989), TAM (Silva & Larsen, 1983), pele (Kaplan et al., 1988), glândula pineal (Tanaka et al., 1986), timo (Molinero et al, 1995), testículo e ovário (Bates et al., 1999; Bates et al., 2000) e útero de ratas grávidas (Galton et al., 2001). Na adenohipófise parece estar presente nos tireotrofos, lactotrofos e somatotrofos (Becker, 1996). Recentemente, relatou-se a presença de atividade e RNAm para D2 em tireóide murina (Bates et al., 1999) e em glândula mamária de camundongos (Song et al., 2000). Em humanos, além dos tecidos citados, encontra-se na musculatura esquelética e cardíaca (Salvatore et al., 1996a), artéria coronária (Mizuma et al., 2001), placenta (Hidal & Kaplan, 1985) e em baixas concentrações no rim e pâncreas (Croteau et al., 1996). Tem sido verificado diferenças na expressão e atividade da D2 em várias espécies, indicando que essa enzima tem funções espécie-específica (Bianco et al., 2002).

38 16 Quanto à localização subcelular, sabe-se que a D2 é uma enzima microssomal, podendo estar no retículo endoplasmático ou na membrana plasmática (Leonard et al., 1982; Baqui et al., 2000). A principal contribuição fisiológica da D2 é manter a homeostasia de T 3 intracelular em tecidos onde a deficiência deste hormônio seria mais crítica. Tem sido demonstrado que em ratos hipotireóideos, o aumento da atividade D2 foi capaz de normalizar os níveis de T 3 na adenohipófise, cérebro e TAM, o que pode ser visto como um mecanismo adaptativo destes tecidos em resposta à queda dos níveis circulantes dos hormônios tireóideos (Koening et al., 1984; Escobar-Morreale et al., 1996). Sugere-se que no hipotireoidismo ocorra aumento da estabilidade e da meia vida desta enzima (Leonard & Köhrle, 1996). Apesar do conceito pré-estabelecido de que a atividade D2 não contribui para a geração do T3 sérico, recentemente dados experimentais sugerem que, pelo menos em roedores, tal afirmação pode não ser verdadeira. Observou-se que em ratos normais ou tireoidectomizados tratados com PTU, foi bastante semelhante o percentual de conversão de T 4 a T 3, sugerindo que a D2 também atua na manutenção das concentrações circulantes de T 3, contribuindo com metade da produção de T 3, juntamente com a D1. Parece que a D1 atua mais rapidamente e a D2 mais tardiamente no equilíbrio da taxa de conversão de T 4 a T 3 (Nguyen et al., 1996). Além dessas evidências em roedores, demonstrou-se em humanos eutireóideos, que o PTU causa somente 20% de supressão da conversão de T 4 a T 3, indicando que a via catalisada pela D2 talvez seja mais importante para a produção de T 3 sérico (Nicoloff et al., 1984; Pilo et al., 1990). A recente evidência de RNAm e atividade D2 em músculo esquelético e cardíaco de humanos corrobora esse papel da D2 na geração de T 3 circulante (Salvatore et al., 1996a; Hosoi et al., 1999). Os hormônios tireóideos regulam a atividade D2 tanto a nível pré-traducional como pós-traducional (Silva & Larsen, 1982; St. Germain, 1985). O T 3 diminui o RNAm para D2, enquanto o T 4 reduz a atividade desta enzima (Burmeister et al., 1997). O RNAm e a atividade D2 aumenta na hipófise de ratos com hipotireoidismo (Croteau et al., 1996). Além do efeito inibitório do T 3, a atividade D2 hipofisária é regulada positivamente pelo TRH (Köhrle et al., 1991). Foi relatado também, que o RNAm e a atividade D2 estão aumentados no córtex cerebral e em regiões somatosensória do cérebro de ratos recém-natos com hipotireoidismo, proporcionando proteção contra efeitos deletérios da falta de T 3 durante o desenvolvimento cerebral (Leonard, 1990; Guadano-Ferraz et al., 1999).