GERMANA MIRANDA DAMASCENA

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1 MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA Endereço: Campus Universitário Ministro Petrônio Portela, Bloco5, Bairro Ininga, Teresina-Piauí, Telefone: GERMANA MIRANDA DAMASCENA Células-tronco de dente decíduo humano como fonte de regeneração de defeitos ósseos em modelo murino Teresina 2014

2 GERMANA MIRANDA DAMASCENA Células-tronco de dente decíduo humano como fonte de regeneração de defeitos ósseos em modelo murino Artigo científico apresentado ao Mestrado em Odontologia como parte dos requisitos para obtenção do título de mestre, pelo Programa de Pós-Graduação em Odontologia. Área de Concentração: Clínica Odontológica Linha de Pesquisa: Estudo de Materiais e Técnicas Odontológicas Orientadora: Prof.ª Dr.ª Carmen Milena Rodrigues Siqueira Carvalho Teresina 2014

3 Células-tronco de dente decíduo humano como fonte de regeneração de defeitos ósseos em modelo murino COMISSÃO EXAMINADORA Prof.ª Dr.ª Carmen Milena Rodrigues Siqueira Carvalho (Presidente) Titulação: Doutorado em Odontologia (Dentística e Endodontia) UFPE Prof. Dr. Matheus Levi Tajra Feitosa Titulação: Doutorado em Ciências USP Prof.ª Dr.ª Maria Cândida de Almeida Lopes Titulação: Pós Doutorado em Ciências da Saúde (Cirurgia e Traumatologia Buco Maxilo Facial) - University of Florida. Suplente: Prof.ª Dr.ª Simone Souza Lobão Veras Barros Titulação: Doutora em Patologia Bucal UFRN Teresina 2014

4 DEDICATÓRIA Dedico esta conquista à minha família, e de maneira especial aos meus pais, Antônio e Fátima, por terem me oferecido o equilíbrio do seio familiar e serem os meus maiores incentivadores.

5 AGRADECIMENTOS Primeiramente agradeço a Deus pelo conforto nos momentos difíceis, e por me oferecer os instrumentos necessários para ultrapassar as dificuldades e alcançar os meus objetivos; Aos meus pais, Antônio e Fátima, pelo apoio, carinho, amor e dedicação durante toda minha vida. A vocês dedico todas as minhas vitórias, que não seriam reais se vocês não estivessem ao meu lado; Aos meus irmãos, George e Gerson, pelo amor, companheirismo e disponibilidade em me ajudar nas tarefas do meu cotidiano; Ao meu namorado, Jarles, pelo amor, cumplicidade e incentivo durante cada obstáculo e por compreender a minha ausência durante essa caminhada. À Professora e orientadora Dr.ª Carmen Milena Rodrigues Siqueira Carvalho, pelos conhecimentos repassados, por sua confiança no meu trabalho, pelo incentivo constante, e por ser um exemplo de otimismo. Muito obrigada pela oportunidade e carinho; Ao Professor Dr. Flávio Ribeiro Alves, por ser sempre solicito e acessível, e pela sua colaboração inestimável para a realização dessa pesquisa; À doutoranda Yulla Klinger Pereira de Carvalho, pelos conselhos e auxílio nas práticas do laboratório; Á Nilcely Guimarães, por seu carinho e disponibilidade nos finais de semana e feriados; Á Professora Dr.ª Maria Acelina Martins de Carvalho, em nome da qual agradeço a todos os pesquisadores que fazem parte do NUPCELT, obrigada pelo acolhimento; Às companheiras Jessyca Moura Fé e a Isadora Mello Vilarinho Soares, pela compreensão e ajuda com as atividades do mestrado;

6 À querida aluna de graduação Larissa Cordeiro por sua dedicação e responsabilidade para com as suas atividades acadêmicas e pelo auxilio no desenvolvimento desta pesquisa Às amigas de Mestrado, pelo apoio constante, pelos desabafos e brincadeiras; À amiga Janayla Moreira Abreu, por participar dos momentos mais relevantes da minha vida, obrigada pelos conselhos e pela torcida; Às amigas de longas datas, pela compreensão, companheirismo e torcida para a conquista deste sonho. Obrigada por entender a minha ausência durante este período Aos Professores membros da banca examinadora, Prof. Dr. Matheus Levi Tajra Feitosa, Prof.ª Dr.ª Maria Cândida de Almeida Lopes, Prof.ª Dr.ª Simone Souza Lobão Veras Barros, por terem aceitado o convite para desempenhar este papel, dispondo de seu tempo e conhecimento para analisar este trabalho; A todo corpo docente e à coordenação do Programa de Pós-graduação em Odontologia da UFPI, pelos ensinamentos transmitidos e oportunidade de crescimento profissional; A todos os funcionários da UFPI, que de alguma forma contribuíram com esta caminhada. À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Piauí (FAPEPI), e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão de bolsa de estudo; A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho; A todos vocês, minha eterna gratidão!

7 Listas de abreviatura e siglas BMSC Célula-tronco da medula óssea CT Célula-tronco CTM Célula-tronco mesenquimal DPSC Célula-tronco da polpa dentária humana GFP Proteína verde fluorescente HA/TCP Hidroxiapatita / tricálcio fosfato HE Hematoxilina-eosina IM Intramuscular ISCT Sociedade Internacional de Citoterapia OPN Osteopontina PBS Solução tampão fosfato estéril RT-PCR Reação em cadeia da polimerase em tempo real SHED Célula-tronco da polpa de dente decíduo SPSS Pacote estatístico para as ciências sociais

8 SUMÁRIO REVISÃO DA LITERATURA... 1 Células-tronco mesenquimais... 2 Reparo ósseo... 3 Células-tronco pulpares e osteogênese... 4 Referência Bibliográfica... 8 ARTIGO CIENTÍFICO Página de título Resumo Introdução Materiais e Métodos Isolamento e cultivo SHED Curva de crescimento Diferenciação celular Grupos experimentais Procedimentos Cirúrgicos e Transplante Análise radiográfica Eutanásia Processamento histológico Imunohistoquímica Análise Estatística Resultados Comportamento celular Análise radiográfica Infiltrado Inflamatório Neoformação Óssea Expressão de osteopontina Discussão Agradecimentos... 29

9 Referências Bibliográficas Tabelas Figuras ANEXOS Carta de aprovação do Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal do Piauí Carta de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Piauí Comprovante de submissão Normas para submissão do artigo Produção da Aluna durante o Curso... 54

10 REVISÃO DA LITERATURA 1

11 2 Células-tronco mesenquimais As primeiras evidências sobre células-tronco mesenquimais (CTM) foram descritas por Friedenstein et al., (1970). Estes evidenciaram, a partir da medula óssea de roedores, a presença de células altamente clonogênicas, com formato fibroblastóide, e propriedades plástico aderentes. Quando cultivadas, demonstravam tendência a formar colônias. Mais tarde, essas células foram denominadas por Caplan (1991) como células-tronco mesenquimais. Com o aumento das pesquisas utilizando as CTMs, a Sociedade Internacional de Citoterapia (International Society for Cellular Therapy ISCT), estabeleceu critérios mínimos para a classificação adequada: Estas células devem ser obrigatoriamente positivas para os marcadores de superfície CD73, CD90, e CD105; possuir baixa expressão (<2%) ou ausência de expressão para CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD19a ou CD79, ou moléculas de superfície HLA- DR; apresentar propriedades como plástico-aderência quando mantidas em cultura; e capacidade de diferenciação em osteoblastos, adipócitos e condroblastos in vitro (Dominici et al., 2006). As CTM estão presentes especialmente na medula óssea. No entanto, o aspirado de medula óssea é um procedimento invasivo e doloroso para o doador. Assim, a identificação e caracterização de fontes alternativas de CTMs são de grande importância (Kern et al., 2006). As CTM estão presentes em todos os tecidos adultos como, por exemplo, sangue, córnea, retina, fígado, pele, trato gastrointestinal, pâncreas, além da polpa dental (Jo, 2007). A identificação dessas células tem ampliado as chances de potenciais benefícios para regeneração e reconstrução tecidual (Kadar et al., 2009). O órgão pulpar é formado por componentes ectomesenquimais, contendo células derivadas da crista neural, apresentando plasticidade e capacidade de exibir sua característica multipotencial (Tirino et al., 2011). Pesquisas demonstram que a polpa dentária contém células-tronco capazes de se diferenciar em vários

12 3 tipos celulares como os osteoblastos, odontoblastos, adipócitos e células neurais (Dissanayaka et al., 2011; Guimarães et al., 2011; Snyder et al., 2011). Reparo ósseo O tecido ósseo possui a capacidade intrínseca para a regeneração, como parte do processo de reparo em resposta à uma lesão, bem como desenvolvimento ou remodelação contínua ao longo da vida adulta. A regeneração óssea de defeitos é facilitada pelo preenchimento destes com materiais com capacidade de osteocondução, que se caracteriza pelo desenvolvimento de um novo tecido ósseo por meio da proliferação e da migração de células osteoprogenitoras ao longo de um condutor. O material é então reabsorvido e simultaneamente substituído por tecido ósseo (Albrektssone Johansson, 2001; Pretel, 2007). Regeneração óssea é composta por uma série de eventos biológicos de indução óssea e de condução, uma série de tipos de células e vias de sinalização intracelular e extracelular, na tentativa de aperfeiçoar o reparo e restaurar função (Einhorn 1998; Cho et al., 2002). O processo de reparo é composto, basicamente, por três fases: inflamação, reparo e remodelação. Migram para o local lesionado, inicialmente, neutrófilos e monócitos que liberam mediadores químicos e fatores de crescimento capazes de ativar as células osteoprogenitoras e de revestimento ósseo (Dimitriou et al. 2005; Phillips 2005; Polimeni et al. 2006). No entanto, uma reação imunológica desequilibrada durante essa fase inicial de cicatrização óssea pode comprometer o reparo (Schmiidt-Bleek et al. 2012). Durante a fase de reparo, em decorrência da intensa proliferação e diferenciação celular, forma-se um calo ósseo que posteriormente passará por um processo de remodelação. A formação dos calos é dependente do recrutamento de células tronco mesenquimal (CTM) (Cho et al. 2002; Marsell e Einhorn, 2009).

13 4 Para que a regeneração óssea progrida, o calo ósseo primário é reabsorvido e substituído por um calo ósseo secundário, que proporciona estabilidade, contudo não restaura completamente as propriedades biomecânicas do osso normal. Para alcançar isso, ocorre o processo de remodelação que é realizado pelo equilíbrio de reabsorção do calo pelos osteoclastos, e deposição de osso lamelar pelos osteoblastos (Gerstenfeld et al. 2003). Células-tronco pulpares e osteogênese Gronthos et al., (2000) foram os primeiros pesquisadores a isolarem célulastronco (CT) provenientes da polpa dentaria humana. Para isso foi realizada a coleta da polpa de terceiros molares impactados de adultos. As células-tronco da polpa dentária humana (DPSC) foram comparadas às células-tronco da medula óssea (BMSC) coletadas de humanos voluntários. Embora compartilhem imunofenótipo semelhantes, foi observado que DPSCs produzem, in vitro, nódulos calcificados esporadicamente, enquanto que as BMSCs produziam aglomerados calcificados em toda a camada de células aderentes. Quando as DPSCs foram transplantadas em camundongos imunocomprometidos, ocorreu a formação de estruturas semelhantes a odontoblastos humanos. Em contraste, BMSCs formaram osso lamelar contendo osteócitos e osteoblastos, em torno de um tecido vascular fibroso com hematopoiese ativa e adipócitos. Estes resultados demonstram que DPSCs possuem propriedades semelhantes às da BMSCs, incluindo a capacidade de auto-renovação e diferenciação em multi-linhagem. Miura et al., (2003) verificaram a capacidade das células-tronco da polpa de dente decíduo (SHED) na estimulação da osteogênese pós-transplante. Além de isolarem uma população de CT multipotentes do remanescente pulpar de dentes decíduos esfoliados, também, demonstraram que essas células apresentam características diferentes daquelas observadas em DPSC, apresentando maior taxa de proliferação, formação de colônias, capacidade de ósteo-indução in vitro. As SHEDs foram injetadas no cérebro de camundongos imunocomprometidos e após o transplante, foram capazes de induzir a formação óssea, e gerar dentina. Segundo esses autores, considerando a facilidade de

14 5 obtenção das SHEDs, os dentes decíduos esfoliados poderiam ser uma fonte ideal de CT para reparar estruturas dentárias comprometidas, induzir regeneração óssea e possivelmente, tratar injúrias de tecido nervoso ou doenças degenerativas. Otaki et al., (2007) verificaram que DPSC apresentava a capacidade de formar osso, além do seu destino de origem, que seria formar dentina. As DPSCs foram associadas a 60 mg de hidroxiapatita / tricálcio fosfato (HA / TCP) em pó e, em seguida, transplantadas na região subcutânea dorsal de ratos imunocomprometidos. Para o controle, foi utilizado somente HA / TCP. Após 7 semanas de transplante, o tecido ósseo foi observado nas superfícies de HA / TCP. Havia osteoblastos, indicando a formação óssea ativa. Em 15 semanas após o transplante, foi observado osso lamelar com osteoblastos alinhados. A formação óssea não foi observada no grupo controle. Esta evidência mostra que as células-tronco da polpa dentária são progenitores comuns de odontoblastos e osteoblastos. Seo et al., (2008) verificaram a capacidade das SHEDs em regenerar defeitos em calvárias de ratos imunocomprometidos, comparando-as à BMSC. Foram utilizados 18 animais divididos em três grupos (SHEDs; BMSCs; hidroxiapatita/ tricálcio fosfato). Cinco ratos de cada grupo foram colhidos em oito semanas pós-transplante e um rato de cada grupo se manteve até 6 meses. Seis meses após o transplante, houve reparação óssea completa da calvária. No entanto, o osso mediado por SHED não conseguiu recrutar elementos da medula hematopoiéticas que são comumente vistos no osso gerado a partir de BMSC. Estes dados suportam que as SHEDs possuem potencial de diferenciação osteogênica in vivo e in vitro, e são análogos às células estaminais da medula óssea. Costa et al., (2008) realizaram um estudo cujo principal objetivo era avaliar a capacidade das células - tronco da polpa dentária humana isoladas de dentes decíduos, para reconstruir defeitos ósseos cranianos em ratos nãoimunocomprometidos (NIS). Para isso foram realizados dois defeitos cranianos de espessura total simétricas ( 5 x 8 milímetros ) em cada região parietal em oito ratos NIS. O lado esquerdo (LS) foi utilizado como controle do lado direito (RS).

15 6 Em seis dos quais, no lado esquerdo foi tratado somente com membrana de colágeno, e no lado direito (RS) foi tratado com membrana de colágeno associada a células tronco indiferenciadas. Para o transplante foi semeado 10 6 células tronco de dentes decíduos esfoliados sobre uma membrana de colágeno em seis poços de 35mm. Os poços foram suplementadas com 2,5mL de meio de cultura basal e as células foram incubadas por 24 horas a 37ºC em 5% de CO2 antes do transplante para aderir na membrana. Foi observado que a região do lado direito apresentou formação de um osso mais maduro comparado ao lado esquerdo. Os resultados desse trabalho indicam que o enxerto alógeno de células humanas não promove rejeição nestes animais. A utilização desses enxertos pode proporcionar uma opção para reparar grandes defeitos ósseos cranianos humanos. E possivelmente a utilização de células tronco de dentes decíduos poderá ser utilizado como uma alternativa na regeneração do tecido ósseo Nakamura et al., (2009) caracterizaram as SHEDs em comparação com as DPSCs e e as BMSCs. Foram analisadas a taxa de proliferação celular e a expressão do marcadores de DPSCs, SHEDs, e BMSCs. Além disso, os perfis de expressão do gene de DPSCs e SHEDs foram analisados através de microarrays de DNA. Todas as células isoladas a partir das três fontes exibiam características CTM incluindo morfologia fibroblastoide e a expressão de marcadores mesenquimais de células-tronco. A taxa de proliferação de SHEDs foi significativamente mais elevada do que a de DPSCs e BMMSCs (p<0,05). Devido à maior capacidade de proliferação, ao fornecimento abundante de células, e à coleta de CT ser minimamente invasiva, as SHEDs poderiam ser uma opção desejável como uma fonte de células para potenciais aplicações terapêuticas. Zheng et al., (2009) isolaram células-tronco de dentes decíduos de porco transfectadas com GFP, e enxertaram em defeitos ósseos de tamanho crítico gerados na mandíbula de 10 suínos. E, após o rastreamento celular, verificaram que células tronco foram capazes reparar o defeito crítico mandibular em 6 meses após a cirúrgia, podendo, potencialmente servir como uma alternativa na reconstrução ou reparação de defeitos ósseos. Suchánek et al., (2010) isolaram as células-tronco a partir de dentes humanos decíduos esfoliados para cultivá-las in vitro, investigar suas

16 7 propriedades biológicas básicas, e compará-las às células-tronco de polpa dentária isoladas de dentes permanentes. A viabilidade celular e outras propriedades biológicas foram analisadas utilizando um analisador Cell-Vi e uma Z2-Counter. As análises fenotípicas foram realizadas por citometria de fluxo. Esses resultados mostraram que as SHEDs cultivadas nas mesmas condições que DPSCs tiveram, em média, tempo maior de duplicação da população (41,3 horas para SHED; e 24,5 horas para DPSC). Durante o período de cultivo as SHEDs não mostraram quaisquer sinais de degeneração ou diferenciação espontânea. Estas células podem ser extremamente úteis para a criação de um banco de CT. Mori et al., (2011) avaliaram o fenótipo osteoblástico desenvolvido pela DPSCs cultivadas em meio osteogênico. Foram analisadas a expressão dos marcadores de osteoblastos típicos, tais como fosfatase alcalina, o colágeno tipo I, osteocalcina, osteopontina, bem como a produção de matriz mineralizada. Usando microarray e análise de reação em cadeia da polimerase-transcriptase reversa (RT-PCR), verificou-se que os genes reguladores da remodelação óssea (IGFBP-5, JunB, e NURR1) estão presentes durante a diferenciação de DPSCs. Estes dados indicam que DPSCs apresentam um fenótipo osteoblástico após diferenciação induzida. Wang et al., (2012) caracterizaram e compararam as SHEDs com as DPSCs para certificar que a SHED é uma fonte promissora para engenharia de tecidos. As SHEDs e DPSCs foram testadas para seus antígenos de superfície celular e a taxa de proliferação celular foi medida. A capacidade de mineralização das células foi examinada in vivo através do implante de CTs no subcutâneo de ratos imunocomprometidos por 8 semanas. As SHEDs mostraram uma maior taxa de proliferação e capacidade de diferenciação em comparação com DPSCs in vitro. Os resultados do transplante in vivo sugerem que SHEDs têm uma maior capacidade de mineralização do que as DPSCs.

17 8 Referência Bibliográfica Albrektsson T, Johansson C. (2001). Osteoinduction, osteoconduction and osseointegration. Eur Spine J 10Suppl 2:S Caplan AI (1991) Mesenchymal stem cells. J Orthop Res 9: Cho TJ, Gerstenfeld LC, Einhorn TA (2002) Differential temporal expression of members of the transforming growth factor beta superfamily during murine fracture healing. J Bone Miner Res 17: Costa AM, Bueno DF, Martins MT, Kerkis I, Kerkis A, Fanganiello RD, Cerruti H, Alonso N, Passos-Bueno MR. (2008) Reconstruction of Large Cranial Defects in Nonimmunosuppressed Experimental Design With Human Dental Pulp Stem Cells. J Craniofac Surg.19(1): Dimitriou R, Tsiridis E, Giannoudis PV. (2005). Current concepts of molecular aspects of bone healing. Injury 36: Dissanayaka WL, Zhu X, Zhang C, Jin L (2011) Characterization of Dental Pulp Stem Cells Isolated from Canine Premolars. J Endod 37: Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini F, Krause D Deans R, Keating A, Prockop Dj, Horwitz E (2006) Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 8: Einhorn TA (1998) The cell and molecular biology of fracture healing. Clin Orthop Relat Res 355(Suppl):S7-21. Friedenstein A, Chailakhjan R, Lalykina K (1970) The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells. Cell Tissue Kinet 3: Gerstenfeld LC Cullinane DM Barnes GL Graves DT Einhorn TA (2003) Fracture healing as a post-natal developmental process: molecular, spatial, and temporal aspects of its regulation. J Cell Biochem 88: Gronthos, S. Mankani M, Brahim J, Shi S (2000) Postnatal human dental stem cells (DPSCs) in vitro. and in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: Guimarães ET, Cruz GS, de Jesus AA Lacerda de Carvalho AF, Rogatto SR, Pereira LV, Ribeiro-dos-Santos R, Soares MB (2011) Mesenchymal and embryonic characteristics of stem cells obtained from mouse dental pulp. Arch Oral Biol 56:

18 9 Jo YY, Lee HJ, Kook SY, Choung HW, Park JY, Chung JH, Choung YH, Kim ES, Yang HC, Choung PH (2007). Isolation and characterization of postnatal stem cells from human dental tissues. Tissue Eng. 13(4): Kadar K, Kiraly M, Porcsalmy B, Molnar B, Racz GZ, Blazsek J, Kallo K, Szabo EL, Gera I, Gerber G, Varga G. (2009) Differentiation potential of stem cells from human Dental origin - promise for tissue engineering. J Physiol Pharmacol. 2009; 60: (Supl 7), Kern S, Eichler H, Stoeve J, Klüter H, Bieback K. (2006) Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells 24: Marsell R e Einhorn TA (2009) The role of endogenous bone morphogenetic proteins in normal skeletal repair. Injury 40 Suppl 3:S4-7 Miura M, Gronthos S, Zhao M, Lu B, Fisher LW, Robey PG, Shi S (2003) SHED: Stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: Mori G, Brunetti G, Oranger A, Carbone C, Ballini A, Lo Muzio L, Colucci S, Mori C, Grassi FR, Grano M (2011) Dental pulp stem cells: osteogenic differentiation and gene expression. Ann N Y Acad Sci 1237:47-52 Nakamura S, Yamada Y, Katagiri W, Sugito T, Ito K, Ueda M (2009) Stem cell proliferation pathways comparison between human exfoliated deciduous teeth and dental pulp stem cells by gene expression profile from promising dental pulp. J Endod. 35(11): Otaki S, Ueshima S, Shiraishi K, Sugiyama K, Hamada S, Yorimoto M, Matsuo O (2007) Mesenchymal progenitor cells in adult human dental pulp and their ability to form bone when transplanted into immunocompromised mice. Cell Biol Int. 31(10): Phillips AM (2005) Overview of the fracture healing cascade. Injury 36:5-7. Polimeni G, Xiropaidis AV, Wikesjö UM (2006) Biology and principles of periodontal wound healing/regeneration. Periodontol : Pretel H, Lizarelli RF, Ramalho LT (2007) Effect of low-level laser therapy on bone repair: histological study in rats. Lasers Surg Med 39: Schmidt-Bleek K; SchellH; Schulz N; Hoff P; Perka C; Buttgereit F; Volk R-D; Lienau J; Duda GN (2012) Inflammatory phase of bone healing initiates the regenerative healing cascade. Cell Tissue Res 347:

19 10 Seo BM, Sonoyama W, Yamaza T, Coppe C, Kikuiri T, Akiyama K, Lee JS, Shi S (2008) SHED repair critical-size calvarial defects in mice. Oral Dis 14(5): Snyder BR, Cheng P, Yang J, Yang S, Huang AHC, Chan AWS (2011) Characterization of Dental Pulp Stem/Stromal Cells of Huntington Monkey Tooth Germs. BMC Cell Biol 12: 39. Suchánek J, Visek B, Soukup T, El-Din Mohamed SK, Ivancaková R, Mokrỳ J, Aboul-Ezz EH, Omran A. (2010) Stem cells from human exfoliated deciduous teeth--isolation, long term cultivation and phenotypical analysis. Acta Medica (Hradec Kralove) 53(2):93-9. Tirino V, Paino F, D aquino R, Desiderio V, Rosa A, Papaccio G (2011) Methods for the Identification, Characterization and Banking of Human DPSCs: Current Strategies and Perspectives. Stem Cell Rev and Rep 7(3): Wang J, Wei X, Ling J, Huang Y, Gong Q, Huo Y (2012) Identification and characterization of side population cells from adult human dental pulp after ischemic culture. J Endod 38(11): Zheng Y, Liu Y, Zhang CM, Zhang HY, Li WH, Shi S, Le AD, Wang SL (2009) Stem cells from deciduous tooth repair mandibular defect in swine. J Dent Res. 88(3):

20 ARTIGO CIENTÍFICO 11

21 12 Página de título Células-tronco de dente decíduo humano como fonte de regeneração de defeitos ósseos em modelo murino GERMANA MIRANDA DAMASCENA 1, CARMEN MILENA RODRIGUES SIQUEIRA CARVALHO 2 1 Programa de Pós-graduação em Odontologia, Universidade Federal do Piauí (UFPI), Teresina, Piauí, Brasil. 2 Departamento de Patologia e Clínica Odontológica, Universidade Federal do Piauí (UFPI), Teresina, Piauí, Brasil. Endereço para correspondência: Profa. Dra. Carmen Milena Rodrigues Siqueira Carvalho Campus Universitário Ministro Petrônio Portella bloco 5 Programa de Pós- Graduação em Odontologia, Bairro Ininga / CEP: Teresina - Piauí Brasil Phone: (+5586) / Descritores: Regeneração óssea; Células tronco mesenquimais; Dentes decíduos

22 13 Resumo Em busca de uma terapia que possa favorecer o processo de reparo ósseo, avaliou-se o potencial de células-tronco de dentes decíduos esfoliados (SHED) na regeneração óssea, in vivo. Foi confeccionado um defeito ósseo não-crítico em tíbias de 45 ratos não-imunocomprometidos, e estes foram preenchidos com: coágulo sanguíneo; esponja de colágeno reabsorvível; e SHED semeada em esponja de colágeno reabsorvível. Após sete, quinze e trinta dias os animais foram eutanasiados e as peças submetidas ao processamento histológico e imunohistoquímica. Os animais foram acompanhados radiograficamente e avaliados pelo percentual de preenchimento da lesão. A avaliação histológica foi realizada de forma semi-quantitativa, com atribuição de escores de acordo com o estágio do processo de reparo ósseo e presença de infiltrado inflamatório. Para análise imunohistoquímica, os escores foram atribuídos pela intensidade de expressão de osteopontina. Radiograficamente todos os grupos apresentaram evolução no reparo, sendo que o grupo tratado SHED foi o que apresentou maior percentual de reconstrução (97%-100%). O infiltrado inflamatório reduziu no decorrer dos tempos experimentais, e não houve diferença significante entre os grupos (p>0,05). Em relação ao processo de reparo ósseo, houve diferença significativa nos tempos experimentais de sete (p=0,022) e trinta (p=0,016) dias. O grupo tratado com SHED apresentou reparo cortical total com presença de tecido ósseo primário. Esse resultado foi confirmado pela maior expressão de osteopontina (p=0,022), no período de trinta dias, demonstrando maior atividade reparadora comparada aos demais grupos. Apesar de tratar-se de um transplante autólogo, nenhum animal exibiu sinais de rejeição. Em conclusão, as SHEDs favoreceram o processo de reparo de defeitos ósseos em um modelo animal, fornecendo evidencias para que estas células possam ser utilizadas em terapias com humanos. Descritores: Regeneração óssea; Células tronco mesenquimais; Dentes decíduos

23 14 Introdução Lesões ósseas constituem grande preocupação na odontologia. A perda óssea na cavidade bucal pode ocorrer por processos patológicos ou por iatrogenias. Dessa forma, tem-se buscado novos métodos, técnicas e materiais para otimizar o processo de reparo ósseo (Pinheiro e Gerbi 2006; Zheng et al., 2009). Para a regeneração destas lesões acontece uma resposta programada que envolve processos celulares e moleculares complexos (Rundle et al., 2006). Além disso, é necessária a disponibilidade de células, que se diferenciam, multiplicam e migram para a região lesionada, e de estímulos para recrutá-las. E são as proteínas da matriz extracelular que regulam como as células responderão a esses sinais, como por exemplo, a osteopontina (OPN). Essa é uma das principais proteínas não colágena envolvida no processo de osteogênese e remodelação óssea (Gordjestani et al., 2007). O potencial de diferenciação, auto-renovação e proliferação das célulastronco (CT) tem direcionado as pesquisas para estudos com reparo e remodelação tecidual, contudo a plasticidade destas células pode ser maior do que, apenas, diferenciar-se em células específicas do tecido de origem (Chambers et al. 2003; Chambers e Smith 2004; Clark et al. 2004; Monteiro et al 2009). A principal fonte de CT é a medula óssea, no entanto a coleta destas células podem causar danos ao doador. Assim tem-se buscado fontes alternativas de CT, (Jo et al., 2007). Alguns estudos in vitro (Karaoz et al., 2010; Bakopoulou et al., 2011; Dissanayaka et al., 2011) e in vivo (Almushayt et al., 2006; Oda et al., 2010; Um et al., 2011) estão sendo relatados para demonstrar o potencial de diferenciação das células tronco da polpa dentária, na tentativa de definir técnicas e meios exatos para utilização dessas células na engenharia tecidual. As células tronco provenientes da polpa dentária têm demonstrado um importante papel nos mecanismos ligados à plasticidade do tecido pulpar, tanto

24 15 na regeneração tecidual, quanto a sua habilidade de diferenciação em cultura. Tais características foram assim observadas para a polpa de dentes permanentes (DPSC) (Gronthos et al., 2000) e de dentes decíduos esfoliados (SHED) (Miura et al., 2003). Estudos (Nakamura et al., 2009; Suchanek et al., 2010; Wang et al., 2012) demonstram que as SHEDs possuem maior taxa de proliferação e se apresentam em um estado mais indiferenciado quando comparado às DPSC. Porém, a literatura científica possui poucas evidências sobre as propriedades osteogênicas e osteoindutoras dessas células, in vivo. Em busca de uma terapia que pudesse favorecer o processo de reparo ósseo, esta pesquisa avaliou por meio de análise histológica, imunohistoquimica e por controle radiográfico, a evolução do reparo tecidual de um defeito ósseo, confeccionado em um modelo murino tratado com células-tronco isoladas de dentes decíduos humanos associadas a uma esponja de colágeno reabsorvível.

25 16 Materiais e Métodos Todos os procedimentos foram realizados em acordo com critérios de bioética que regem as pesquisas com humanos e com animais na Universidade Federal do Piauí-UFPI. Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Humanos da Universidade Federal do Piauí ( ) e pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal do Piauí (075/12.). Essa pesquisa caracteriza-se como sendo experimental, laboratorial, controlada (padronização e uniformização de todos os procedimentos e de todas as condições submetidas aos animais), randomizada (aleatorização no processo de composição dos grupos) e com leitura cega (avaliação histológica e imunohistoquímica feitas por um observador cego). Isolamento e cultivo SHED Foram coletados dois dentes decíduos hígidos esfoliados, de um mesmo doador, após a assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE) pelos responsáveis da criança. A polpa dentária remanescente foi removida com auxìlio de limas hedstroem (15 a 25). O material coletado passou por três lavagens em solução tampão fosfato estéril (PBS, 0,01 M, ph: 7,4) suplementado com penicilina-estreptomicina a 3% (100 U/mL de penicilina; 100µg/mL de estreptomicina). O tecido pulpar foi dissociado mecanicamente com auxílio de lâmina de bisturi em placa de Petri de 35mm contendo D-MEM/F-12 (Invitrogen) suplementado com: 20% de soro fetal bovino (Invitrogen), penicilinaestreptomicina a 3% (SIGMA, Brasil), L-glutamina a 1% e aminoácidos nãoessenciais a 1%. Em seguida, o tecido foi transferido para garrafa de cultivo de 25cm 2 e incubado em estufa (Thermo fisher scientific forma 3110 series II water jacketed CO 2 incubator) controlada com atmosfera de CO 2 (5%) a 37 ºC.

26 17 Curva de crescimento As SHEDs em terceira passagem (P3) foram plaqueadas inicialmente na concetração de 1x10 5 cel/ml em garrafas de 25cm 2 totalizando 20 garrafas. Seguiu-se a tripsinização (Tripsina/EDTA) de uma garrafa por dia. A troca de meio foi realizada a cada três dias. Para o cálculo da concentração celular, uma alíquota de 10µL da suspensão celular foi transferida ao hematocitômetro e o número de células foi contado após visualização em microscópio óptico (objetiva 10x). A concentração celular foi determinada pela contagem das células em quatro campos diagonais, sendo o total de células vivas multiplicado por 10 4 (profundidade da câmera e correção por ml), dividindo-se esse valor pelo número de quadrantes contados do hematocitômetro, conforme demonstrado abaixo: Nº total de cel. X Fator de diluição X 10 4 Nº de quadrantes contados Diferenciação celular As SHEDs foram cultivadas em placas de seis poços na concentração de 2x10 4 cel/ml, em meio de cultura basal completo.após quatro dias em cultivo o meio foi substituído por meio indutor específico para diferenciação. Para isso foi utilizado o kit de diferenciação específico (StemPro, Invitrogen) para cada tipo celular (adipogência, osteogênica e condrogênica). O meio foi trocado a cada três dias e no final de 21 dias as culturas foram fixadas e coradas. As células foram evidenciadas com o auxílio de Oil red para linhagens adipogênicas; Alizarina red para linhagens osteogênicas; e Alcian blue para a linhagem condrogênica.

27 18 Grupos experimentais Foram utilizados 45 animais machos da espécie Rattus norvegicus, variação/linhagem Wistar, com peso médio de 300 gramas. Os animais foram divididos em três grupos. O grupo I foi tratado com coágulo sanguíneo; o Grupo II tratado somente com Hemospon (esponja de colágeno hidrolisado liofilizada de origem porcina, Technew, Brasil) e o Grupo III com células tronco de dentes decíduos esfoliados associada ao Hemospon. Cada grupo foi subdividido em três subgrupos correspondente aos tempos experimentais: sete, quinze e trinta dias. Cada subgrupo continha cinco animais, que foram mantidos em gaiolas de propileno, rotineiramente higienizadas e alimentados com ração (Labina TM ) e água ad libitum. Procedimentos Cirúrgicos e Transplante Após uma semana da vermifugação os animais foram preparados para a cirurgia. Os ratos foram pré-medicados com acepromazina (Acepran, Vetnil; dose 0,05mg/100g de peso corporal), por via intramuscular (IM). Após 15 minutos da medicação pré-anestésica, foi realizada a aplicação da combinação de cloridrato de xilazina 2% (Anasedan, Vetbrands Brasil; dose 0,5mg/100g de peso corporal), associada ao cloridrato de cetamina (Dopalen, Vetbrands Brasil; dose 5mg/100g de peso corporal) IM. Posteriormente, foi realizada tricotomia do membro posterior direito, antissepsia e isolamento da tíbia com campos cirúrgicos esterilizados. Em seguida fez-se uma incisão linear de 2cm de extensão, no sentido crânio-caudal, seguida de divulsão da pele, músculo e periósteo para a exposição da superfície óssea. Sob abundante irrigação com solução fisiológica de cloreto de sódio a 0,9%, e utilizando-se uma broca esférica de aço nº.4 (Dentsply Maillefer) montada em um micromotor cirúrgico, confeccionou-se um defeito ósseo com 2mm de diâmetro (correspondente ao diâmetro da broca) e profundidade até atingir o canal medular. (Fig1a-b)

28 19 O defeito ósseo foi preenchido com coágulo (Grupo I); com Hemospon (Grupo II); e com SHED associado ao Hemospon (Grupo III). Para a adesão celular no defeito ósseo, o Hemospon foi embebido em suspensão contendo 1 x 10 5 cel/ml e incubado por 24 horas em estufa de CO 2. Sua propriedade absorvível e seu emaranhado de fibras permitem a agregação e liberação progressiva das células. A sutura do músculo foi realizada com fio absorvível (fio cirúrgico nº 4-0 Catgut, Somerville, Brasil), seguida da sutura da pele com fio de nylon nº 4-0. Os animais foram acompanhados no período pós-operatório e foi administrado o analgésico acetominofenol (Tylenol ) em solução oral na dose de 2mg/ml na água do bebedouro, durante 48 horas, e receberam injeção subcutânea do antibiótico enrofloxacino (Chemitril, Chemitec; dose 5mg/kg de peso corporal), imediatamente após os procedimentos cirúrgicos, para evitar infecções pós-operatórias. Análise radiográfica A tomada radiográfica foi realizada em todos os animais e em dois momentos: logo após o procedimento cirúrgico e após a sedação prévia a eutanásia. Para isso os animais foram posicionados em decúbito ventral com o membro posterior direito abduzido. Foi aplicada a técnica de exposição de 45 KVp e 0,1 mas. As imagens foram obtidas através de um aparelho de raio-x fixo INTECAL CR7, e do digitalizador CR 30-X (Agfa HealthCare). Essas imagens foram analisadas, de maneira cega, por um Médico Veterinário especialista em Diagnóstico por Imagem. A análise foi conduzida de maneira descritiva avaliando o percentual de preenchimento da lesão Eutanásia Decorridos sete, quinze e trinta dias após as cirurgias, os animais de cada grupo foram pré-medicados com acepromazina (Acepran, Vetnil; dose 0,05mg/100g de peso corporal), por via IM, e, em seguida, eutanasiados com a

29 20 administração de sobredose do anestésico tiopental sódico por via intraperitoneal (Thiopentax, Cristália; dose 5mg/100g de peso corporal). Processamento histológico A tíbia direita de cada animal foi dissecada (Fig1c) e as peças fixadas por 48 horas em solução de formalina neutra tamponada a 10%. Após a fixação, os espécimes foram descalcificados em solução de ácido clorídrico (5% por uma hora; 10% por 30 minutos e 15% por 15 minutos). Os fragmentos foram então submetidos ao processamento histológico laboratorial de rotina. Os espécimes foram incluídos em parafina e feitas secções longitudinais de 3µm de espessura. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) para análise histomorfológica e para a identificação das áreas de neoformação óssea e inflamação. Os cortes foram examinados em microscópio de luz binocular Nikon E200 e fotografados utilizando sistema fotomicrográfico digital. A observação foi realizada de forma cega por um médico patologista, que realizou análise descritiva (qualitativa) e semi-quantitativa das lâminas, considerando parâmetros representativos do processo de reparo, como característica do tecido conjuntivo (organização e maturação), angiogênese, infiltrado inflamatório e neoformação óssea. Os fenômenos observados e os critérios adotados para mensurá-los de forma semi-quantitativa, com a atribuição de escores estão descritos na Tabela 01, Fig2 e Fig3 (Pretel 2007; Hedner e Linde 1995; Dahlin et al., 1988). Imunohistoquímica Para as reações imunohistoquímicas, foi utilizado anticorpo primário monoclonal (Santa Cruz Biotechnology, referência sc-21742, titulação 1:200) desenvolvido contra OPN. As amostras de tecido incluídas em parafina foram cortadas em secções longitudinais de 3 µm de espessura e colocadas em lâminas silanizadas. Os cortes foram desparafinizados em estufa a 60ºC por uma hora. As lâminas foram submetidas à Plataforma de coloração IHC/ISH (Benckmark GX,

30 21 Ventana), sob o seguinte protocolo: Desparafinização, CC1 por 60 min, anticorpo por 32 min, amplificador, hematoxila por 8 min e bluing por 4 min. Logo após foi feita lavagem das laminas com sabão neutro e água corrente seguida de três lavagens em álcool absoluto e duas em xilol, posiciona-se a lamínula e fixa com Entellan (Merck, Alemanha) Como controle positivo externo, utilizou-se tecido de rim humano. Como controle negativo, os cortes foram submetidos ao mesmo processo, com a omissão da aplicação do anticorpo. A avaliação imunohistoquímica da expressão de OPN foi realizada de forma semi-quantitativa, de acordo com o grau de intensidade de impregnação da substância cromógena, com a atribuição de escores (Tabela 2). A imunorreatividade foi considerada na matriz óssea componente dos tecidos regenerados (Fig4 ) (Christgau et al., 2007; Routray et al., 2013; Modoloet al., 2010; Faria et al., 2008). Análise Estatística O software utilizado para a análise foi o Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) versão Inicialmente aplicou-se o teste de normalidade Shapiro-Wilk e o teste de Levene para homogeneidade de variâncias. Por ser um dado não normal foi aplicado o teste não paramétrico Jonckheere-Terpstra para comparação entre os grupos para cada tempo analisado. Em todos os testes citados, o nível de significância assumido foi de 5%.

31 22 Resultados Comportamento celular As primeiras células aderentes liberadas pelo explante foram observadas por volta do oitavo dia de cultivo, algumas apresentaram forma arrendondada que aos poucos se alongavam adquirindo formato fusiforme. Atingiram confluência (>80%) após 25 dias em cultivo (Fig5). O estudo da curva de crescimento, de células tronco em quarta passagem, permitiu analisar o comportamento proliferativo das células em cultivo. Observase que a máxima concentração celular ocorreu no 17º dia de cultivo com 22x10 5 cel/ml. Desse modo tem-se que as SHED demonstraram crescimento típico de células tronco mesenquimais (CTM), apresentando uma fase de log inicial, alcançando um plateau e em seguida uma fase de lag, quando da exaustão por falta de espaço para crescimento (Fig6). As SHEDs demonstraram sua plasticidade ao serem induzidas em meio específico in vitro. A figura 7 evidencia a diferenciação osteogênica, adipogência e condrogênica. Análise radiográfica Avaliação radiográfica no período de sete dias (Fig8) Grupo I: Foco da lesão visível, variando entre 20 e 50%, com margens regulares em borda da lesão e preenchimento homogêneo. Ausência de calo ósseo primário ou secundário Grupo II: Foco da lesão visível, variando entre 20 e 30%, com margens regulares em borda da lesão e preenchimento homogêneo com bioenxerto utilizado. Ausência de calo ósseo primário ou secundário Grupo III: Foco da lesão visível, variando entre 20 e 30%, com margens regulares em borda da lesão e preenchimento homogêneo com bioenxerto utilizado. Ausência de calo ósseo primário ou secundário

32 23 Avaliação radiográfica no período de 15 dias (Fig8) Grupo I: Foco da lesão visível, variando entre 10 e 40%, com margens regulares em borda da lesão e preenchimento homogêneo. Calo ósseo primário e secundário visíveis e em formação, exibindo focos de calcificação e obliteração da lesão Grupo II: Foco da lesão visível, variando entre 5 e 20%, com margens regulares em borda da lesão e preenchimento homogêneo com bioenxerto utilizado. Calo ósseo primário e secundário visíveis e em formação, exibindo focos de calcificação e obliteração da lesão Grupo III: Foco da lesão visível, 5 a 10%, com margens regulares em borda da lesão e preenchimento homogêneo com bioenxerto utilizado. Calo ósseo primário e secundário visíveis e em formação, exibindo focos de calcificação e obliteração da lesão Avaliação radiográfica no período de 30 dias (Fig8) Grupo I: Foco da lesão visível, variando entre 1 e 5%, com margens regulares em borda da lesão e preenchimento homogêneo. Calo ósseo primário e secundário visíveis e em formação, exibindo focos de calcificação e obliteração da lesão, remodelamento e reconstrução total da lesão em aproximadamente % Grupo II: Foco da lesão visível, variando entre 1 e 3%, com margens regulares em borda da lesão e preenchimento homogêneo com bioenxerto utilizado. Calo ósseo primário e secundário visíveis e em formação, exibindo focos de calcificação e obliteração da lesão, remodelamento e reconstrução total da lesão em aproximadamente 85-97% Grupo III: Foco da lesão visível, 5 a 10%, com margens regulares em borda da lesão e preenchimento homogêneo com bioenxerto utilizado. Calo ósseo primário e secundário visíveis e em formação, exibindo focos de calcificação e obliteração da lesão, remodelamento e reconstrução total da lesão em aproximadamente %

33 24 Infiltrado Inflamatório O infiltrado inflamatorio decresceu com o decorrer do tempo para todos os grupos analisados. No período de sete dias o grupo teste obteve menor média, e nos demais tempos, manteve-se entre as médias do grupo tratado com coágulo e com Hemospon. Contudo não houve padrão significante de entre os grupos. Todos os grupos mantiveram padrões semelhantes de resposta inflamatória, composta de linfócitos, macrófagos e neutrófilos (Fig9). Neoformação Óssea No periodo de sete dias os grupos I e II apresentaram características semelhantes como neoformação óssea com proliferação fibroblástica, presença de vasos sanguíneos e tecido conjuntivo em processo de diferenciação, além de trabéculas imaturas. A neoformação óssea do grupo III mostrou-se mais lenta apresentando tecido conjuntivo jovem. Essa diferença esta evidenciada na figura 10, onde observa-se um padrão significante em sete dias. Em 30 dias também nota-se essa diferença, mas de maneira contrária a encontrada em sete dias. O grupo III apresentou reparo cortical total com presença de tecido ósseo primário. Enquanto os demais grupos evidenciaram em sua maioria reparo cortical parcial com presença de matriz condroide. Expressão de osteopontina O grupo tratado com coágulo apresentou um declínio, na expressão de OPN, com o passar dos dias. Enquanto que o grupo tratado com SHED associado ao Hemospon manteve-se com expressão moderada durante os tempos analisados. Ao comparar os grupos observa-se um padrão significante, somente, no tempo experimental de 30 dias, sendo o grupo III o que apresenta maior expressão e o grupo I, menor expressão (Fig11).

34 25 Discussão A regeneração de defeitos ósseos é iniciada através da indução de uma resposta imune. Durante essa fase inicial, é formado um hematoma e a inflamação ocorre (Rundle et al., 2006; Gerstenfeld et al., 2003). A reação inflamatória inicia o processo de cura, assim, o aumento da resposta inflamatória inicial é esperado, como demonstrado nesta pesquisa no período de sete dias (Schmiidt-Bleek et al., 2012). A medida em que o processo de neoformação óssea progride há redução da visibilidade da lesão e aumento da radiopacidade. Nesse aspecto o grupo tratado com SHED obteve melhores percentuais, no período de 30 dias, comparado aos demais grupo. Alkayse et al., (2013) analisaram o percentual de neoformação após distração osteogênica em coelhos não imunocomprometidos, e verificaram que o grupo tratado com SHED,também, obtiveram maior percentual de osso neoformado, no período de 30 dias, quando comparado ao grupo controle, o qual não recebeu tratamento. Esses dados corroboram com os achados dessa pesquisa Modelos experimentais de defeitos ósseos (Liu et al., 2011; Yamada et al., 2011; Maraldi et al., 2013; Annibali et al., 2013) tratados com células tronco mesenquimais têm demonstrado que, na presença de um ambiente biológico e mecânico favorável, resultam na proliferação e diferenciação de CTM em osteoblastos, e que a terapia com células-tronco em defeitos ósseos experimentais diminui o tempo de cicatrização do defeito. Além disso, as células progenitoras que estão presentes no periósteo e endósteo possuem um potencial de regeneração limitada (Salgado et al., 2006). Dessa forma espera-se que a utilização de células tronco, como terapia em defeitos ósseos, possa acelerar o processo de reparo. Resultados significativos, em relação ao reparo ósseo, foram encontrados nessa pesquisa, onde o grupo tratado com SHED associado à esponja de colágeno apresentou melhores resultados quanto a maturidade óssea, além do reparo cortical completo após 30 dias. Resultados semelhantes também foram encontrados por Seo et al., (2008). Eles observaram que, após terapia com

35 26 SHEDs em um defeito crítico na calvária de ratos imunocomprometidos, houve reparo completo, concluíram ainda que as SHEDs são capazes, não somente de formar, mas também de induzir a formação óssea in vivo. O fato dos animais não estarem imunossuprimidos, parece não interferir nos resultados desse estudo, onde o grupo de animais que utilizaram SHED apresentou declínio da resposta inflamatória no decorrer dos tempos observados, além de não apresentar diferença significativa quando comparado ao grupo tratado apenas com coágulo sanguíneo. Apesar de ser indicada a imunossupressão para o receptor, há indícios que isso pode não ser um problema quando se refere ao transplante de células tronco mesenquimais (Pierdomenico et al., 2005). Não foram observados nenhum sintoma clínico de rejeição nos ratos receptores, fato esse, também encontrado por Costa et al., (2008) Eles verificaram a presença de células humana no reparo ósseo em defeitos crítico na calvária de ratos não imunocomprometidos, apesar disso, não houve resposta imunológica. Isso pode ser explicado pelas propriedades imunorreguladoras das células tronco mesenquimais da polpa dentária, que suprime a resposta das células T (Pierdomenico et al., 2005). O estudo do comportamento celular prévio é indispensável para sua seleção e utilização em terapias (Baghaban Eslaminejad et al., 2010). A elevada capacidade de proliferação e a diferenciação em pelo menos três linhagens celulares são requisitos básicos para identificação de células tronco (Dominici et al.,. 2006). Estudos anteriores relataram que há maior taxa de proliferação de SHEDs, quando comparados às DPSCs, além de uma maior potencialidade e capacidade de diferenciação (Miura et al., 2003; Govindasamy et al., 2010; Wang et al., 2012) Está sendo muito estudado (Seo et al., 2006; Otaki et al., 2007; Wang et al., 2012) as propriedades de diferenciação osteogênica em diferentes arcabouços, transplantados em ratos imunocomprometidos, porém há poucas evidências sobre o reparo ósseo tratado com células tronco da polpa dentária humana, utilizando como suporte, uma esponja de colágeno absorvível, in vivo (Morad et al., 2013).

36 27 Para a utilização de CTs na reconstituição de tecido ósseo é indispensável a presença de um material de suporte. Não há especificações ideais para esse arcabouço, porém este deve possuir características básicas para a sua utilização em terapias in vivo como: biocompatibilidade, osteocondução, ser reabsorvível, poroso, radiotransparente e maleável (Nitzsche et al., 2010). Assim, optou-se pela utilização do Hemospon, um material odontológico de uso clínico, de fácil acesso, e que contém os requisitos básicos para sua utilização em terapias, apesar de não ter sido desenvolvido para esse propósito. Seu emaranhado de fibras colágenas permite a agregação e liberação progressiva das células. E por sua propriedade absorvível, o gel dará espaço às células que ocuparão a área da lesão funcionando como um scafolld. Donzelli et al., (2007) semearam células tronco mesenquimais em esponja de colágeno similar ao Hemospon e verificaram que essas se diferenciaram em linhagem osteogênica, e que esse material foi reabsorvido em quatro semanas. Esse curto período poderia ser uma desvantagem para o tratamento de defeitos ósseos críticos, mas seria uma boa alternativa para acelerar o processo de reparo em defeitos ósseos não-críticos, que também oferecem morbidade. D Aquino et al., (2009) também utilizaram esponja de colágeno como arcabouço de células tronco pulpares com o intuito de promover o reparo de pacientes que apresentavam reabsorção óssea bilateral na distal do rebordo alveolar do segundo molar, após exodontia do terceiro molar em humano. Estes estudos obtiveram resultados satisfatórios quanto ao reparo e também qualificaram a esponja de colágeno como excelente arcabouço. Foi utilizado nessa pesquisa padrões de marcação para identificar a intensidade de expressão de OPN, já que essa é uma das principais proteínas não colágenas, secretadas pelas células osteoblásticas e são depositadas na matriz extracelular de tecidos mineralizados (Nagao et al., 2011). Há pesquisas que utilizam a própria OPN como tratamento em defeitos ósseo, e demonstram o seu potencial de sinalização e estimulação no processo de reparo (Gordjestani et al., 2005; Gordjestani et al., 2006; Gordjestani et al., 2007). A OPN incorporada ao osso, em conjunto com outras proteínas nãocolagenosas, atua como uma "argamassa entre os blocos de colágeno", dando coesão molecular para a matriz como um todo, enquanto que, simultaneamente,

37 28 orienta os eventos de mineralização da matriz (Nagao et al., 2011). Por isso a sua expressão representa atividade no processo reparador, assim, como foi demonstrado nessa pesquisa, houve a menor expressão no grupo tratado com coagulo e maior no grupo tratado com SHED e Hemospon. Considerando a metodologia empregada, e os resultados encontrados conclui-se que, as células tronco provenientes de dentes decíduos esfoliados favorecem o processo de reparo ósseo, em defeitos não críticos, confeccionados em tíbia de ratos não imunocomprometidos. Observou-se, também, que o Hemospon parece ser um excelente arcabouço para transplante de células tronco. A expressão de osteopontina evidenciou atividade óssea metabólica elevada, indicando um maior processo ativo de mineralização no grupo que utilizou as SHEDs. O estudo de SHEDs é um campo promissor pela possibilidade de sua utilização em diversas terapias. Apesar de se diferenciar em outras linhagens o seu potencial osteogênico tem se destacado e direcionado as pesquisa, em grande parte, para estudos que envolvem o processo de reparo ou osteogênese. É estimulado o desenvolvimento de pesquisas que promovam o rastreamento de CT em terapias que envolvam o processo de reparo ósseo, a fim de esclarecer a atividade osteogênica e osteoindutora dessas células.

38 29 Agradecimentos Agradecemos à Universidade Federal do Piauí (UFPI), à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e a Fundação de Amparo a Pesquisa no Piauí (FAPEPI) pelo apoio logístico para a realização da pesquisa e pela concessão de bolsa de estudo.

39 30 Referências Bibliográficas Alkaisi A, Ismail AR, Mutum SS, Ahmad ZA, Masudi S, Abd Razak NH (2013) Transplantation of human dental pulp stem cells: enhance bone consolidation in mandibular distraction osteogenesis J Oral Maxillofac Surg e e13 Almushayt A, Narayanan K, Zaki AE, George A (2006) Dentin matrix protein 1 induces cytodifferentiation of dental pulp stem cells into odontoblasts. Gene Ther 13: Annibali S, Cicconetti A, Cristalli MP, Giordano G, Trisi P, Pilloni A, Ottolenghi L (2013) A comparative morphometric analysis of biodegradable scaffolds as carriers for dental pulp and periosteal stem cells in a model of bone regeneration. J Craniofac Surg 24(3): Baghaban Eslaminejad MR, Vahabi S, Shariati M, Nazarian H (2010) In vitro Growth and Characterization of Stem Cells from Human Dental Pulp of Deciduous Versus Permanent Teeth. J Dent (Tehran) 7(4): Bakopoulou A, Leyhausen G, Volk J, Tsiftsoglou A, Garefis P, Koidis P, Geurtsen W (2011) Comparative analysis of in vitro. osteo/odontogenic differentiation potential of human dental pulp stem cells (DPSCs) and stem cells from the apical papilla (SCAP). Arch Oral Biol 2011; 56: Chambers I, Colby D, Robertson M, Nichols J, Lee S, Tweedie S, Smith A (2003) Functional Expression Cloning of Nanog, a Pluripotency Sustaining Factor in Embryonic Stem Cells. Cell 2003; 113: Chambers I, Smith A. (2004) Self-renewal of teratocarcinoma and embryonic stem cells. Oncogene 23: Clark AT, Bodnar MS, Fox M, Rodriquez RT, Abeyta MJ, Firpo MT, Pera RA (2004) Spontaneous differentiation of germ cells from human embryonic stem cells in vitro. Hum Mol Genet 2004; 13: Costa AM, Bueno DF, Martins MT, Kerkis I, Kerkis A, Fanganiello RD, Cerruti H, Alonso N, Passos-Bueno MR. (2008) Reconstruction of Large Cranial Defects in Nonimmunosuppressed Experimental Design With Human Dental Pulp Stem Cells. J Craniofac Surg.19(1): d'aquino R, De Rosa A, Lanza V, Tirino V, Laino L, Graziano A, Desiderio V, Laino G, Papaccio G (2009) Human mandible bone defect repair by the grafting of dental

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41 32 dental pulp stem cells seeded on nano-hydroxyapatite/collagen/poly(l-lactide). Tissue Eng A 17(19 20): Maraldi T, Riccio M, Pisciotta A, Zavatti M, Carnevale G, Beretti F, Sala GBL, Motta A, Pol AD (2013) Human amniotic fluid-derived and dental pulp derived stem cells seeded into collagen scaffold repair critical-size bone defects promoting vascularization. Stem Cell Res Ther;4:53. Miura M, Gronthos S, Zhao M, Lu B, Fisher LW, Robey PG, Shi S (2003) SHED: Stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proc Natl Acad Sci USA 100: Monteiro BG, Serafim RC, Melo GB, Silva MC, Lizier NF, Maranduba CM, Smith RL, Kerkis A, Cerruti H, Gomes JA, Kerkis I (2009) Human immature dental pulp stem cells share key characteristic features with limbal stem cells. Cell Prolif 42(5): Nagao M, Feinstein TN, Ezura Y, Hayata T, Notomi T, Saita Y, Hanyu R, Hemmi H, Izu Y, Takeda S, Wang K, Rittling S, Nakamoto T, Kaneko K, Kurosawa H, Karsenty G, Denhardt DT, Vilardaga JP, Noda M (2011) Sympathetic control of bone mass regulated by osteopontina. Proc Natl Acad Sci U S A 108(43): Nakamura S, Yamada Y, Katagiri W, Sugito T, Ito K, Ueda M. (2009) Stem cell proliferation pathways comparison between human exfoliated deciduous teeth and dental pulp stem cells by gene expression profile from promising dental pulp. J Endod 35(11): Nitzsche H, Lochmann A, Metz H, Hauser A, Syrowatka F, Hempel E, Müller T, Thurn-Albrecht T, Mäder K (2010) Fabrication and characterization of a biomimetic composite scaffold for bone defect repair. J Biomed Mater Res A. 94(1): Oda Y, Yoshimura Y, Ohnishi H, Tadokoro M, Katsube Y, Sasao M, Kubo Y, Hattori K, Saito S, Horimoto K, Yuba S, Ohgushi H (2010) Induction of pluripotent stem cells from human third molar mesenchymal stromal cells. J Biol Chem. 17;285(38) Otaki S, Ueshima S, Shiraishi K, Sugiyama K, Hamada S, Yorimoto M, Matsuo O (2007) Mesenchymal progenitor cells in adult human dental pulp and their ability to form bone when transplanted into immunocompromised mice. Cell Biol Int. 31(10): Pierdomenico L, Bonsi L, Calvitti M, Rondell D, Arpinati M, Chirumbolo G, Becchetti E, Marchionni C, Alviano F, Fossati V, Staffolani N, Franchina M, Grossi A, Bagnara GP(2005) Multipotent Mesenchymal Stem Cells with

42 33 Immunosuppressive Activity Can Be Easily Isolated from Dental Pulp. Transplantation 80: Pinheiro ALB, Gerbi MEMM (2006) Photoengineering of Bone Repair Processes 24: Rundle CH, Wang H, Yu H, Chadwick RB, Davis EI, Wergedal JE, Lau KHW, Mohana S, Ryaby JT, Baylink DJ (2006) Microarray analysis of gene expression during the inflammation and endochondral bone formation stages of rat femur fracture repair. Bone 38: Salgado AJ, Oliveira JT, Pedro AJ, Reis RL (2006) Adult stem cells in bone and cartilage tissue engineering. Curr Stem Cell Res Ther 1: Schmidt-Bleek K; SchellH; Schulz N; Hoff P; Perka C; Buttgereit F; Volk R-D; Lienau J; Duda GN (2012) Inflammatory phase of bone healing initiates the regenerative healing cascade. Cell Tissue Res 347: Seo BM, Sonoyama W, Yamaza T, Coppe C, Kikuiri T, Akiyama K, Lee JS, Shi S (2008) SHED repair critical-size calvarial defects in mice. Oral Dis 14(5): Suchánek J, Visek B, Soukup T, El-Din Mohamed SK, Ivancaková R, Mokrỳ J, Eman HA, Omran A (2010) Stem cells from human exfoliated deciduous teethisolation, long term cultivation and phenotypical analysis. Acta Medica (Hradec Kralove) 53(2): Um, S, Choi JR, Lee JH, Zhang Q, Seo BM (2011) Effect of leptin on differentiation of human dental stem cells. Oral Diseases 17: Wang J, Wei X, Ling J, Huang Y, Gong Q, Huo Y (2012) Identification and characterization of side population cells from adult human dental pulp after ischemic culture. J Endod 38(11): Yamada Y, Ito K, Nakamura S, Ueda M, Nagasaka T. (2011) Promising cell-based therapy for bone regeneration using stem cells from deciduous teeth, dental pulp, and bone marrow. Cell Transplant 20(7): Zheng Y, Liu Y, Zhang CM, Zhang HY, Li WH, Shi S, Le AD, Wang SL (2009) Stem Cells from Deciduous Tooth Repair Mandibular Defect in Swine. J Dent Res 88(3): ,

43 34 Tabelas Tabela 01. Escores atribuídos aos eventos histomorfológicos para avaliação semi-quantitativa do infiltrado inflamatório e da neoformação óssea. Escore Infiltrado Inflamatório Neoformação óssea 0 Ausente Coágulo sanguíneo 1 Discreto Neoformação tecidual, com tecido conjuntivo jovem, vasos sanguíneos, fibroblastos e macrófagos 2 Moderado Neoformação óssea com tecido conjuntivo em processo de diferenciação 3 Intenso Presença de tecido ósseo primário Adaptado de Pretel, 2007; Hedner e Linde, 1995; Dahlinet al.,., 1988 Tabela 02. Escores atribuídos para avaliação imunohistoquímica da expressão da proteína OPN. Escore Intensidade da marcação 0 Ausência de marcação 1 Marcação fracamente positiva 2 Marcação moderadamente positiva 3 Marcação intensamente positiva

44 35 Figuras Fig1. Técnica cirúrgica em ratos não imunocomprometidos. (a) Confecção do defeito na região do terço médio proximal utilizando broca esférica de 2mm de diâmetro, sob abundante irrigação. (b) Exposição do defeito (c) peça obtida após dissecação da tíbia. Fig2. Fotomicrografias dos defeitos ósseos produzidos na tíbia direita dos animais, exemplificando os padrões histomorfológicos utilizados para a atribuição dos escores na análise semi-quantitativa do processo de neoformação óssea. (A) exemplo de padrão histomorfológico de neoformação óssea com escore 1. (B) exemplo de padrão histomorfológico de neoformação óssea com escore 2. (C) exemplo de padrão histomorfológico de neoformação óssea com escore 3. Barra: 100µm Fig3. Fotomicrografias dos defeitos ósseos produzidos na tíbia direita dos animais, exemplificando os padrões histomorfológicos utilizados para a atribuição dos escores na análise semi-quantitativa do infiltrado inflamatório. (a) exemplo de

45 36 padrão histomorfológico de infiltrado inflamatório com escore 1. (b) exemplo de padrão histomorfológico de infiltrado inflamatório com escore 2. (c) exemplo de padrão histomorfológico de infiltrado inflamatório com escore 3. Barra: 100µm Fig4. Fotomicrografias dos defeitos ósseos produzidos na tíbia direita dos animais, exemplificando os padrões de marcação imunohistoquímica utilizados para a atribuição dos escores na análise semi-quantitativa da intensidade de marcação da OPN nas células do estroma. (A) exemplo de padrão de intensidade de marcação imunohistoquímica escore 1. (B) exemplo de padrão de intensidade de marcação imunohistoquímica escore 2. (C) exemplo de padrão de intensidade de marcação imunohistoquímica escore 3. Barra 100µm Fig5. Fotomicrografia de Células-tronco da polpa dentária humana. (a) Tecido pulpar após 8 dias em cultura. Notar presença de células aderentes, inicialmente esféricas, tonando-se fusiforme (seta). (b) Confluência celular (>80%) após 25 dias em cultivo. Barras: 50µm.

46 37 Fig6. Curva de crescimento de células tronco de dentes decíduos esfoliados em 20 dias de cultivo. Fig7. Diferenciação de células-tronco da polpa dentária humana, in vitro (a) Diferenciação osteogênica corada com alizarina red evidenciando depósitos de cálcio e matriz, (b) Diferenciação adipogêncica corada com oil red evidenciando as gotículas de lipídios. (c) Diferenciação condrogênica corada com alcian blue evidenciando os glicosaminoglicanos, Barra 50µm

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