CLARUS 500 / HEADSPACE TURBO MATRIX 1. INTRODUÇÃO

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1 1/10 1. INTRODUÇÃO A Cromatografia em Fase Gasosa (CG) é um método usado frequentemente em bioquímica e em química analítica para separar, identificar e quantificar diferentes compostos. Para tanto, utiliza-se colunas capilares tais como a Elite-5 PerkinElmer (5% difenil - polisiloxano e 95% dimetil polisiloxano) e a Elite-WAX (polietilenoglicol). Pela coluna capilar, passará um gás de arraste (neste caso, o gás nitrogênio - N 2 ) que funcionará como fase móvel. A depender do fluxo do gás, das temperaturas das rampas da corrida cromatográfica, das características do filme que preenche a coluna capilar, assim das moléculas em análise e do comprimento da coluna, os analitos presentes na amostra terão migração, ao longo desta, diferenciado e, consequentemente, tempos de retenção (RT) diferentes. Nesta análise, o CG pode ser acoplado a um TurboMatrix Headspace, equipamento que aquece e pressuriza a amostra e injeta o vapor dos compostos voláteis presentes no cromatógrafo através de uma linha de transferência. O cromatógrafo a gás Clarus 500 também possui um amostrador automático e detectores (FID e ECD). No FID (detector de ionização em chama) as ionizações dos analitos gerarão sinais elétricos que serão registrados pelo software TotalChrom. Estes sinais serão transcritos em forma de picos cromatográficos, cuja área e altura serão diretamente proporcionais à concentração desses analitos. O detector ECD (detector de captura de elétrons) é muito sensível e específico para compostos orgânicos do grupo dos haletos, nitratos, nitrilas, peróxidos, anidridos e organometálicos. O Clarus 500 precisa de nitrogênio (N 2 ) como gás de arraste, hidrogênio (H 2 ) e ar sintético para a produção da chama do FID. Todos os gases são com grau de pureza de no mínimo 99,9%. 2. ABRANGÊNCIA Setor de Toxicologia. 3. SIGLAS E DEFINIÇÕES Clarus 500: Cromatógrafo a gás (CG) Headspace: Equipamento acoplado ao CG para injetar alíquotas de vapores de solventes voláteis presentes em alíquotas de amostras. Transferline: Capilar que liga o CG ao Headspace que serve para conduzir os vapores presentes nas amostras até o injetor do CG. Autosampler: Amostrador automático acoplado ao CG. Lines: Tubos de vidro que são inseridos nos injetores que são aquecidos durante a análise e conduzem as alíquotas que chegam ao injetor na coluna capilar. 4. ESPECIFICAÇÃO DO EQUIPAMENTO

2 2/10 Equipamento: Cromatógrafo a gás, marca PerkinElmer, modelo Clarus 500, número de série: 65ON72401 Equipamento: Headspace, marca PerkinElmer, modelo Turbo Matrix, número de série: HS16L MANUTENÇÕES a) Diária: 1) Verificação dos gases utilizados pelo equipamento 2) Troca da solução de lavagem do autosampler 3) Descarte do esgoto do autosampler 4) Limpeza do equipamento 5) Purga do sistema a.1) Semanal: 1) Verificação e/ou troca dos septos 2) Verificação e/ou troca dos lines 3) Verificação dos principais o-rings e anilhas utilizados nos equipamentos. As manutenções realizadas devem ser registradas nas planilhas LAB-106-VR e LAB-139-VR01. b) Preventiva: As manutenções preventivas assim como os testes de desempenho são realizados pela Perkin- Elmer anualmente e os períodos em que as preventivas ocorrem são acordados entre esta e o analista responsável pelo setor. c) Corretiva: As manutenções corretivas são realizados pela Perkin-Elmer, conforme contrato de manutenção entre esta e o Laboratório do Grupo Santa Helena. Tal contrato é renovado anualmente e contempla a realização de serviços de manutenções corretivas sem o fornecimento de peças. 6. CALIBRAÇÃO A verificação da calibração do equipamento e/ou a sua recalibração, quando necessária, são realizadas pela equipe técnica da Perkin-Elmer no momento da manutenção preventiva e/ou corretiva. 7. MATERIAIS E REAGENTES Coluna capilar Elite -5 ou similar; Coluna Elite-WAX ou similar; Anilhas de grafite para as colunas capilares com diâmetros adequados para os injetores e detectores O-rings com diâmetros específicos para as conexões do equipamento que precisam mais facilmente de reposições

3 3/10 Septos para os injetores Vials de 20 ml com suas respectivas tampas (frascos de vidro rosqueáveis) para as amostras do Headspace Vials de 2 ml com suas respectivas tampas para o amostrador automático do CG. Gases nitrogênio, hidrogênio e ar sintético. 8. DETALHAMENTO DO PROCEDIMENTO a) CLARUS 500 Verificar a pressão dos gases na sala dos cilindros. Abrir a válvula no painel dos gases no laboratório. Conectar a coluna capilar de interesse no injetor e detector desejados. Trocar o septo do injetor por outro novo. Troca o liner se necessário Ligar o microcomputador Ligar o cromatógrafo Clarus 500. Pressionar, no display do CG, o botão Log In. Em seguida, clique em botão correspondente ao FID, na tela do display. Digite no campo correspondente à temperatura do FID o valor 250. Para tanto, pressione o campo em branco onde já existe um valor; em seguida pressione, na parte inferior central do display, o desenho que lembra uma máquina de calcular. Aparecerá uma janela com números. Use-os para digitar 250 e pressione a tecla maior a sua direita. Depois pressione o botão Ignite para acender a chama. Em seguida pressione o botão correspondente a Oven, na parte superior a do display. Digite no campo referente à primeira coluna e primeira linha o valor 180 da mesma forma que foi digitada a temperatura do detector. Pressione o botão correspondente a ao injetor A (A-Cap), na parte superior do display a sua esquerda. Digite o valor de 230 no campo da temperatura, da mesma maneira que foi feito para o FID e o forno (Oven). Observe que acima da palavra FID, parte superior do display à sua direita, existe grafada a letra B em um círculo vermelho. Pressionar e observar na parte superior do display, da sua direita para a esquerda B-ECD, Oven e B-Cap. Digitar os valores 200 e 150 para o B-ECD e B-Cap respectivamente. A temperatura do forno (Oven) já foi digitada.

4 4/10 Deixar o cromatógrafo nestas temperaturas por pelo menos 30 minutos para limpeza da coluna capilar, e condicionamento do forno e do detector. Após os 30 minutos, clicar no ícone do TotalChrom Navigator Clicar no ícone Method Aparecerão as janelas Method Editor e Startup. Clique em create new method na janela Startup. Aparecerá a janela Instrument Selection Clique em Clarus 500; em seguida, clique em OK Aparecerá a janela Documentation; nela poder-se-á escrever o nome da determinação (facultativo). Clique em Next Aparecerá a janela Instrument Notes. Na parte inferior a sua esquerda, em template, selecione CAP-GC. Aparecerão tópicos relativos à corrida cromatográfica que poderão ser preenchidos (facultativo). Clique em Next Aparecerá a janela Date Acquisition. Na parte superior à sua esquerda, existe a seção Data Channels. Se for operar apenas o FID, ou apenas o ECD ou ambos clique em A, B e Dual respectivamente. Clique em Real-time Plot, na parte superior a sua esquerda. Em Channel A digite -5 em Offset (mua). Clique em Next. Aparecerá a janela Instrument Control. Podem ser observadas na parte superior à esquerda desta janela quatro seções. Na primeira (Oven/Inlets) deve-se digitar a rampa cromatográfica de interesse, que encontrase no POP técnico do analito em análise. Também deve-se digitar as temperaturas dos injetores A e B no campo inferior a sua esquerda. Também é preciso digitar o valor da temperatura máxima de operação da coluna capilar em uso (normalmente 250) e o tempo de equilíbrio na parte inferior a sua direita. Clique na segunda seção (Carrier). Deve-se digitar o fluxo desejado para o injetor A (Carrier A) e B (CarrierB) na coluna Setpoint. Se for usar apenas o injetor A, deve-se digitar o valor 0,00 em Setpoint em Carrier B e vice-versa. Clique em Detectors na parte superior a sua direita e digite a temperatura do injetor com o qual trabalhará (Temp ( o C)). Se desejar, mude o Range para melhorar o sinal detectado.

5 5/10 Digite as proporções dos gases usados na geração da chama do FID (normalmente H 2 40: Ar 400). Clicar em Apply e Next. Clique em Next até aparecer a janela Components. Em seguida, clique em Finish. Agora na janela Method Editor, clique em File em seguida, Save As. Salve o método criado na pasta MÉTODOS em C:\PenExe\TcWS\Ver6.3.1\Metodos. Novamente na janela TotalChrom, clique em RUN; em seguida em Take Control. O programa neste momento tomará o controle do GC. Em seguida clique em SETUP, na parte superior central da janela TotalChrom. Aparecerá a janela Setup Instrument. Clique em Method na parte superior central desta janela. Na linha Method, selecione o método que acabara de criar ou qualquer outro. Nas linhas Raw file path e Results file path deverão ser selecionadas as pastas onde serão gravados os registros das corridas cromatográficas. Ainda nesta mesma janela dever-se-á escrever em Base file name, o nome da sua corrida cromatográfica. Clique no botão à sua direita nesta linha. Aparecerá a janela Default Base Names; selecione a opção Sample name; em seguida clique em OK. Ainda em Setup Instruments, clique em Suppress reports/plots e em vial list. Aparecerá a janela Sequence Editor. Na coluna Name, dever-se-á digitar o nome dos padrões ou as O.S.s dos pacientes. Tecle CTRL+A para habilitar mais linhas se necessário. Em seguida clique em File, Save e Exit respectivamente. Clique em OK. Na mini-janela Status à sua direita, aparecerá escrito em letras verdes GC Ready. Na parte superior a sua direita na tela do display do CG, há uma figura de uma seringa; clique na mesma. Aparecerá no visor um botão verde escrito START. Com o seu padrão ou sua amostra já seringa, posicione-a no injetor no qual trabalhará e pressione o botão verde. Aguarde os 5 segundos e injete a amostra. A mini-janela Status no software TotalChrom ficará em azul. Caso use o amostrador automático, basta clicar em Star Run no software e o autosampler iniciará as pipetagens das alíquotas. Clicar em Real-Time Plot na parte inferior da janela TotalChrom para acompanhar a corrida cormatográfica. No fim da análise, clicar em RUN em Release Control, para que o equipamento não mais seja controlado pelo software.

6 6/10 Proceder a limpeza da coluna deixando o equipamento por pelo menos 30 minutos com o forno numa temperatura de 200 o C. Logo após, digitar o valor de 100 para as temperaturas dos injetores e detectores e 50 para o forno. Deixar o equipamento atingir as temperaturas digitadas Desligar o CG. Fechar os gases no painel do laboratório. Fechar o software TotalChrom E desligar o computador b) CG com o TurboMatrix 16 Headspace Verificar a pressão dos gases na sala dos cilindros. Abrir a válvula no painel dos gases no laboratório. Conectar a coluna capilar de interesse no injetor e detector desejados. Trocar o septo do injetor por outro novo. Troca o liner se necessário Conectar o transfer do TurboMatrix no injetor de interesse. Ligar o microcomputador Ligar o cromatógrafo Clarus 500. Ligar o TurboMatrix 16 Headspace Pressionar a tela do display do TurboMatrix em qualquer ponto Aparecerá na parte superior do visor três seções: Run, Status e Log da sua esquerda para a direita. Tecle em Run; aparecerão dois campos onde se deve digitar as posições das vials com as amostras que serão analisadas. Use os botões (+) e (-) para aumentar ou diminuir os valores nos campos. Pressione o botão Status. Nele dever-se-á digitar os valores do forno do TurboMatrix, da sua agulha e do seu transfer ( normalmente 70, 100 e 120 respectivamente). Pressionar, no display do CG, o botão Log In. Em seguida, clique em botão correspondente ao FID, na tela do display.

7 7/10 Digite no campo correspondente à temperatura do FID o valor 250. Para tanto, pressione o campo em branco onde já existe um valor; em seguida pressione, na parte inferior central do display, o desenho que lembra uma máquina de calcular. Aparecerá uma janela com números. Use-os para digitar 250 e pressione a tecla maior a sua direita. Agora, pressione o botão Ignite para acender a chama. Em seguida pressione o botão correspondente a Oven, na parte superior a do display. Digite no campo referente à primeira coluna e primeira linha o valor 180 da mesma forma que foi digitada a temperatura do detector. Pressione o botão correspondente a ao injetor A (A-Cap), na parte superior do display a sua esquerda. Digite o valor de 230 no campo da temperatura, da mesma maneira que foi feito para o FID e o forno (Oven). Observe que acima da palavra FID, parte superior do display à sua direita, existe grafada a letra B em um círculo vermelho. Pressione-a. Será observado na parte superior do display, da sua direita para a esquerda B- ECD, Oven e B-Cap. Digitar os valores 200 e 150 para o B-ECD e B-Cap respectivamente. A temperatura do forno (Oven) já foi digitada. Deixar o cromatógrafo e o TurboMatrix nestas temperaturas por pelo menos 30 minutos para limpeza da coluna capilar, e condicionamento do forno, do detector e do TurboMatrix. Após os 30 minutos, clicar no ícone do TotalChrom Navigator Clicar no ícone Method Aparecerão as janelas Method Editor e Startup. Clique em create new method na janela Startup. Aparecerá a janela Instrument Selection Clique em Clarus 500; em seguida, clique em OK Aparecerá a janela Documentation; nela poder-se-á escrever o nome da determinação (facultativo). Clique em Next Aparecerá a janela Instrument Notes. Na parte inferior a sua esquerda, em template, selecione CAP-GC. Aparecerão tópicos relativos à corrida cromatográfica que poderão ser preenchidos (facultativo). Clique em Next

8 8/10 Aparecerá a janela Date Acquisition. Na parte superior à sua esquerda, existe a seção Data Channels. Se for operar apenas o FID, ou apenas o ECD ou ambos clique em A, B e Dual respectivamente. Clique em Real-time Plot, na parte superior a sua esquerda. Em Channel A digite -5 em Offset (mua). Clique em Next. Aparecerá a janela Instrument Control. Podem ser observadas na parte superior à esquerda desta janela quatro seções. Na primeira (Oven/Inlets) deve-se digitar a rampa cromatográfica de interesse, que encontrase no POP técnico do analito em análise. Também deve-se digitar as temperaturas dos injetores A e B no campo inferior a sua esquerda. Também é preciso digitar o valor da temperatura máxima de operação da coluna capilar em uso (normalmente 250) e o tempo de equilíbrio na parte inferior a sua direita. Clique na segunda seção (Carrier). Deve-se digitar o fluxo desejado para o injetor A (Carrier A) e B (CarrierB) na coluna Setpoint. Se for usar apenas o injetor A, deve-se digitar o valor 0,00 em Setpoint em Carrier B e vice-versa. Clique em Detectors na parte superior a sua direita e digite a temperatura do injetor com o qual trabalhará (Temp ( o C)). Se desejar, mude o Range para melhorar o sinal detectado. Digite as proporções dos gases usados na geração da chama do FID (normalmente H 2 40: Ar 400). Clicar em Apply e Next. Clique em Next até aparecer a janela Components. Em seguida, clique em Finish. Agora na janela Method Editor, clique em File em seguida, Save As. Salve o método criado na pasta MÉTODOS em C:\PenExe\TcWS\Ver6.3.1\Metodos. Novamente na janela TotalChrom, clique em RUN; em seguida em Take Control. O programa neste momento tomará o controle do GC. Em seguida clique em SETUP, na parte superior central da janela TotalChrom. Aparecerá a janela Setup Instrument. Clique em Method na parte superior central desta janela. Na linha Method, selecione o método que acabara de criar ou qualquer outro. Nas linhas Raw file path e Results file path deverão ser selecionadas as pastas onde serão gravados os registros das corridas cromatográficas. Ainda nesta mesma janela dever-se-á escrever em Base file name, o nome da sua corrida cromatográfica. Clique no botão à sua direita nesta linha. Aparecerá a janela Default Base Names; selecione a opção Sample name; em seguida clique em OK.

9 9/10 Ainda em Setup Instruments, clique em Suppress reports/plots e em vial list. Aparecerá a janela Sequence Editor. Na coluna Name, dever-se-á digitar o nome dos padrões ou as OSs dos pacientes. Tecle CTRL+A para habilitar mais linhas se necessário. Em seguida clique em File, Save e Exit respectivamente. Clique em OK. Na mini-janela Status à sua direita, aparecerá escrito em letras verdes GC Ready. Coloque as vials com as amostras no carrossel do TurboMatrix. Na parte inferior a sua esquerda da tela do TurboMatrix, há um botão verde escrito START; clique no mesmo e terá início a análise. A mini-janela Status no software TotalChrom ficará em azul. Clicar em Real-Time Plot na parte inferior da janela TotalChrom para acompanhar a corrida cormatográfica. No fim da análise, clicar em RUN em Release Control, para que o equipamento não mais seja controlado pelo software. Desligue o TurboMatrix Proceder a limpeza da coluna deixando o equipamento por pelo menos 30 minutos com o forno numa temperatura de 200 o C. Logo após, digitar o valor de 100 para as temperaturas dos injetores e detectores e 50 para o forno. Deixar o equipamento atingir as temperaturas digitadas. Desligar o CG. Fechar os gases no painel do laboratório. Fechar o software TotalChrom. E desligar o computador. 9. BIOSSEGURANÇA Utilizar o EPI (Equipamento de Proteção Individual) comum a toda área técnica sendo eles: jaleco, luva, pro-pé e touca, conforme descrito no PO Orientações de Biossegurança (Cód. PO-LB-CQ-001) em vigor. 10. COMENTÁRIOS Deve-se evitar desligar o equipamento sem resfriá-lo antes para não danificar a(s) coluna(s) capilar(es) instaladas no equipamento. O equipamento não pode estar em funcionamento sem que haja fluxo do gás de arraste pela coluna capilar para não danificar a coluna capilar.

10 10/ DOCUMENTOS DE REFERÊNCIA a) Bibliografia b) Documentos de referência Manuais PerkinElmer Clarus 500 Manuais PerkinElmer Headspace TurboMatrix Plano da qualidade do setor de Toxicologia (Cód. PQ-LB-TX-001) 12. HISTÓRICO DAS REVISÕES Pg. Natureza da Revisão Data da Revisão Versão Responsáveis Procedimento adequado para atender ao item 5.3 da Norma PALC, versão 2013 Procedimento adequado para atender ao item 5.3 da Norma PALC, versão 2013 Após Pré auditoria. 01/08/ /01/ Procedimento revisado e sem alterações. 13. ANEXOS Não se aplica 14. REGISTRO DE TREINAMENTO DATA NOME COMPLETO ASSINATURA

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