UNIVERSIDADE DA BEIRA INTERIOR Faculdade de Ciências da Saúde DOENÇA DE CROHN: Etiologia, Patogénese e suas Implicações na Terapêutica

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1 UNIVERSIDADE DA BEIRA INTERIOR Faculdade de Ciências da Saúde DOENÇA DE CROHN: Etiologia, Patogénese e suas Implicações na Terapêutica - Dissertação de Mestrado - Iolanda Cristina Teixeira Ribeiro Dissertação realizada para obtenção de Grau de Mestre em Medicina Covilhã, Maio de 2009

2 UNIVERSIDADE DA BEIRA INTERIOR Faculdade de Ciências da Saúde DOENÇA DE CROHN: Etiologia, Patogénese e suas Implicações na Terapêutica - Dissertação de Mestrado - Iolanda Cristina Teixeira Ribeiro Orientador: Doutor António José Duarte Banhudo Dissertação realizada para obtenção de Grau de Mestre em Medicina Covilhã, Maio de 2009

3 AGRADECIMENTOS Após vários meses de trabalho, gostaria de agradecer a todos aqueles que de forma directa e indirecta me apoiaram. Ao Dr. António Banhudo, pela orientação e disponibilidade demonstrada ao longo da realização deste trabalho. Ao meu pai e à minha avó, que sempre estiveram presentes nos momentos mais difíceis e a quem agradeço tudo o que sou hoje. São as duas pessoas mais importantes da minha vida. Aos meus amigos, particularmente à Mariana, Rute e Bárbara pela ajuda sempre prestada ao longo destes anos. iii

4 Valeu a pena? Tudo vale a pena se a alma não é pequena Fernando Pessoa iv

5 RESUMO A doença de Crohn é uma doença inflamatória crónica transmural e segmentar do tracto gastrointestinal, cuja etiologia e patogénese permanecem desconhecidas. Apesar de várias hipóteses terem sido colocadas, considera-se que esta doença resulta da combinação de uma predisposição genética com factores ambientais, alterações na permeabilidade da parede intestinal, perda da tolerância aos antigénios comensais e diminuição da eliminação bacteriana, com a consequente génese e perpetuação dos mecanismos inflamatórios. Várias mutações genéticas estão identificadas, embora ainda não seja totalmente compreendida a sua contribuição para o desenvolvimento da doença de Crohn. Diversas explicações foram propostas, embora controversas. O sistema imunitário é um dos principais intervenientes. As células do sistema imunitário inato, nomeadamente as células dendríticas, respondem de forma inapropriada aos microorganismos comensais com produção de citocinas próinflamatórias e consequente activação de células T helper1 e aumento da expressão de moléculas de adesão. O desequilíbrio entre as células TCD4 + efectoras e as células T reguladoras é outro dos mecanismos que contribui para a patogénese da doença de Crohn. Diversos microorganismos, como o Mycobacterium avium paratuberculosis, foram identificados, mas ainda não existem evidências suficientes para estabelecer uma relação causal com esta doença. Embora variados fármacos sejam utilizados para induzir a remissão da doença de Crohn, há muitos casos que não conseguem ser controlados pelas terapêuticas convencionais, o que indica a necessidade considerável de se apostar em tratamentos v

6 novos e mais eficazes. Por isso, tendo em conta os actuais conhecimentos sobre a patogénese desta doença, são aqui abordados alguns dos novos agentes em investigação e que poderão vir a ser usados no futuro. Apesar dos grandes avanços científicos nos últimos anos, ainda existe um longo caminho a percorrer no que diz respeito à patogénese da doença de Crohn. Só com um profundo conhecimento da etiologia e patogénese se conseguirá progredir verdadeiramente no sentido da cura. Os principais objectivos deste trabalho são: discutir as possíveis etiologias da doença de Crohn, realçar a importância dos factores genéticos, ambientais, sistema imunitário, epitélio intestinal e microflora para a patogénese da doença; dar a conhecer os grandes avanços que têm sido alcançados no que diz respeito ao conhecimento dos mecanismos responsáveis pelo desenvolvimento da doença de Crohn, quais as suas implicações no tratamento futuro e melhoria da qualidade de vida e, por último, destacar novas estratégias de tratamento em estudo. PALAVRAS-CHAVE Doença de Crohn; patogénese; etiologia; NOD2/CARD15; TLR; sistema imunitário; factores ambientais; epitélio intestinal; microorganismos, tolerância oral. vi

7 ABSTRACT Crohn's disease is an inflammatory chronic transmural and segmentar disorder of the gastrointestinal tract, whose etiology and pathogenesis remain unknown. Despite several hypotheses have been postulated, it is considered that this disease results from a combination of a genetic predisposition with environmental factors, changes in the permeability of the intestinal wall, loss of tolerance to the commensal antigens, reduction on the bacterial clearance, with the consequent genesis and perpetuation of the inflammatory mechanisms. Several genetic mutations have been identified, but their role in Cronh s disease is still not fully understood. Although controversial, several examinations have been proposed. The immune system is one of the major players. The cells of the innate immune system, including dendritic cells, respond in an inappropriate manner to commensal microorganisms, with production of proinflammatory cytokines and consequent activation of T helper 1 cells and increased expression of adhesion molecules. The imbalance between effector T cells and regulatory T cells is another mechanism contributing to the pathogenesis of Crohn's disease. Several microorganisms such as Mycobacterium avium paratuberculosis were identified, but there is no sufficient evidence to establish a causal relationship with this disease. In spite of the use of various drugs to induce remission of Crohn s disease, there are still many cases that can not be controlled by conventional therapies, which indicates a considerable need to invest in new and more effective treatments. Therefore, vii

8 given the current knowledge on the pathogenesis of this disease, here we talk about some new agents that are under investigation and that could be used in the future. Despite significant scientific advances in recent years, there is still a long way to go and only with a thorough understanding of the etiology and pathogenesis, we can truly progress towards healing. The main objectives of this work are: to discuss the possible causes of Crohn's disease, to highlight the importance of genetic and environmental factors, immune system, intestinal epithelium and microflora in the pathogenesis of the disease; to make people aware of the major progresses that have been made concerning the mechanisms responsible for the development of Crohn's disease, their implications for future therapies and an improved quality of life and, finally, to highlight new therapeutic strategies that are under investigation. KEY WORDS Crohn's disease, pathogenesis, etiology, NOD2/CARD15, TLR, immune system, environmental factors, intestinal epithelium, microorganisms, oral tolerance. viii

9 LISTA DE SIGLAS ADN Ácido desoxirribonucleico CU - Colite ulcerosa APDI - Associação Portuguesa de Doentes com Doença Inflamatória DC - Doença de Crohn AINES - Anti-inflamatórios não esteróides AZA - Azatioprina Bax - Bcl2-associated X protein DII - Doença Inflamatória Intestinal DLG5 - Drosophilia Long Disc Homologue 5 E.coli - Escherichia coli Bcl-2 - B-cell CLL/lymphoma 2 ECAI - Escherichia coli aderente invasiva CAA - Células apresentadoras de antigénios EUA - Estados Unidos da América CD - Células dendríticas Fab Fragment antigen binding CD 4/8/25/28/40/80/86 cluster of differentiation FISH - Fluorescent in-situ hybridization CEACAM-6 - Carcinoembrionic antigenrelated cell adhesion molecule 6 G-CSF Granulocyte colony-stimulating factor CEI - Células epiteliais intestinais CMV - Citomegalovírus GM-CSF Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor IBD - Inflammatory bowel disease CO - Contraceptivos orais ICAM-1 - Intercellular cell adhesion molecule 1 ix

10 ID - Intestino Delgado IFNα/β - Interferon alfa/beta TIR - Receptor Toll-interleucina1 Ig - Imunoglobulina PCR - Polymerase chain reaction PTG - Peptidoglicano SIGIRR - Single immunoglobulin-irrelated molecule IκB - Inhibitor of nuclear factor IL - Interleucina TGF - β - Transforming growth factor beta TGI - Tracto gastrointestinal LPS - Lipopolissacarídeo Th - T helper LRR - Leucine rich repeats TLR - Toll-like receptors MAP - Mycobacterium avium paratuberculosis MDP Muramyl dipeptide TL1A TNF family ligand TNF-α - Tumor necrosis factor alfa MHC-II - Major histocompatibility complex II Tollip - Toll-inhibitory protein MLCK - Myosin light chain kinase Tr - Células T reguladoras MP - Mercaptopurina VEB - Vírus Epstein Barr NBD - Nucleotid binding domain VIH Vírus da imunodeficiência humana NF-κB - Nuclear factor kappa B NK - Natural Killers OCTN - Organic Cation Transporter x

11 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Quadros Quadro 1 Hipóteses etiológicas na DC 9 Quadro 2 Pontos chave: O tabaco e as suas implicações na DC 15 Quadro 3 Pontos chave: As mutações nos genes NOD2/CARD15 e as suas implicações na DC 21 Quadro 4 Pontos chave na tolerância oral 29 Quadro 5 Funções da microflora intestinal 43 Quadro 6 Evidências que implicam as bactérias comensais no desenvolvimento da DC 48 Quadro 7 Argumentos a favor da relação do MAP com a DC 50 Quadro 8 Argumentos contra a relação do MAP com a DC 51 Quadro 9 Terapêuticas em investigação na DC 70 Tabelas Tabela 1 Exemplos de genes associados com a DC e respectivas funções 17 Tabela 2 Citocinas produzidas pelo sistema imunitário inato na DC 31 Tabela 3 Citocinas produzidas pelo sistema imunitário adaptativo na DC 34 Tabela 4 Diferenças entre os microorganismos intestinais de indivíduos normais e com DC 45 xi

12 Figuras Figura 1 Interacção entre os vários factores responsáveis pelo desenvolvimento da DC 10 Figura 2 Diferentes respostas à lesão intestinal 11 Figura 3 Estrutura do gene NOD2/CARD15 18 Figura 4 Mecanismos responsáveis pela activação do NF-κB e suas consequências a nível de transcrição genética 19 Figura 5 Estrutura dos receptores TLR 22 Figura 6 Vários tipos de TLR e respectivos ligandos 23 Figura 7 Implicações das variantes alélicas do NOD2 e TLR na DC 25 Figura 8 Mecanismos de tolerância oral na DC 27 Figura 9 Activação do sistema imunitário adaptativo na DC e suas funções 35 Figura 10 Defeitos da imunorregulação na DC 36 Figura 11 Barreira epitelial íntegra vs barreira epitelial alterada 39 Figura 12 Estrutura das Tight junctions 40 Figura 13 Activação da MLCK na DC 41 Figura 14 Figura 15 Distribuição dos diferentes tipos de bactérias pelos segmentos do TGI Acção da flora comensal na atenuação das respostas próinflamatórias induzidas por bactérias patogénicas Figura 16 Composição anormal da microflora intestinal e seus efeitos 46 Figura 17 Mycobacterium avium paratuberculosis 49 xii

13 Figura 18 E. coli 52 Figura 19 Figura 20 Mecanismos de lesão da bactéria ECAI nas células epiteliais intestinais Comparação da expressão do CEACAM6 em indivíduos normais e naqueles com DC Figura 21 Mecanismo de acção dos probióticos 65 Figura 22 Alvos terapêuticos futuros na DC 76 ÍNDICE GERAL Agradecimentos..iii Resumo. v Abstract......vii Lista de siglas...ix Lista de ilustrações.xi Desenvolvimento..1 Capítulo I Material e Métodos Justificação do tema Objectivos da dissertação.3 Capítulo II Perspectiva histórica.4 Capítulo III Con siderações gerais Definição Epidemiologia Etiologia e patogénese.. 7 xiii

14 3.1.4 Características clínicas 9 Capítulo IV A influência dos factores ambientais..13 Capítulo V A genética e a sua relação com a patogénese da DC NOD2/CARD TLR 22 Capítulo VI Tolerância oral 26 Capítulo VII O papel do sistema imunitário na DC Imunidade inata Imunidade adaptativa Resposta das células B e T Apoptose celular...37 Capítulo VIII Disfunção da barreira epitelial...38 Capítulo IX O papel dos microorganismos na patogénese da DC Microflora intestinal Agentes patogénicos específicos Mycobacterium avium paratuberculosis Escherichia coli aderente invasiva Bactérias psicotrópicas Vírus.55 xiv

15 Capítulo X Tratamento médico baseado na patogénese Aminossalicilatos Glucocorticóides Antibióticos Imunossupressores Terapêuticas biológicas Probióticos e prebióticos Terapêuticas nutricionais Perspectivas futuras e conclusões Perspectivas futuras de tratamento Inibição das citocinas inflamatória Anticorpos anti-tnf α Adalimumab Humicade Certolizumab pegol Etanercept/Onercept Anticorpos anti-il Anticorpos anti-ifn-γ Anticorpos contra o receptor IL Estimulação de citocinas anti-inflamatórias Inibição de moléculas de adesão Outros tratamentos..74 Conclusões.. 77 Bibliografia. 79 xv

16 DESENVOLVIMENTO

17 CAPÍTULO I 1.1 Material e Métodos A pesquisa dos artigos realizou-se entre 15 de Abril de 2008 e 15 de Janeiro de 2009, recorrendo-se para tal à base de dados da PubMed/MEDLINE, e-medicine, Interscience, sites do American Journal of Gastroenterology, World Journal of Gastroenterology, The New England Journal of Medicine, The Gut, Inflammatory Bowel Disease, Nature, Journal of Imunology e The Lancet As palavras-chave utilizadas foram: Inflammatory bowel disease, Crohn s disease, NOD2/CARD15, TLR, pathogenesis, etiology, Mycobacterium avium paratuberculosis, innate immunity, cytokines, oral tolerance, dysbiosis, probiotics. Procedeu-se posteriormente à selecção dos artigos, mais relevantes desde 1993 a 2008 em língua inglesa e portuguesa, tendo-se ainda utilizado os artigos referenciados noutros trabalhos. Foram incluídos artigos de revisão, estudos prospectivos e ensaios clínicos. Recorreu-se ainda a alguns livros da área da Medicina Interna e Gastrenterologia, nomeadamente o livro do Grupo de Estudos da Doença Inflamatória Intestinal. 1.2 Justificação do tema A DC, tradicionalmente considerada comum no mundo ocidental, tem vindo a aumentar consideravelmente a sua incidência. Desde a sua descrição há várias décadas, que a investigação dos mecanismos patogénicos permitiu a aquisição de novos 2

18 conhecimentos e novas realidades, com consequências importantes na forma de abordagem da doença, sua terapêutica e da qualidade de vida dos doentes. No entanto, a etiologia e patogénese continuam desconhecidas, apesar dos avanços tecnológicos e científicos nesta área, o que tem contribuído para que a DC continue a ser uma doença sem cura e com elevados custos sociais e financeiros. Há, por isso, grande necessidade de se apostar em mais trabalhos científicos e estudos que revelem quais os mecanismos verdadeiramente responsáveis pelo desencadeamento e progressão da doença. Só com estas descobertas será possível, no futuro, o desenvolvimento de novas terapêuticas cujo objectivo primordial será a cura da doença. Com este trabalho, pretende-se que todos aqueles que trabalham no dia-a-dia com a DC, fiquem a par dos mais recentes avanços na área da etiologia e patogénese da doença, pois só assim conseguirão ajudar a melhorar a qualidade de vida dos doentes. Foram estes motivos que me levaram a escolher este tema para a realização do trabalho. 1.3 Objectivos da dissertação O presente trabalho pretende dar a conhecer a problemática da DC, enfatizando os seus aspectos mais actuais. Assim os objectivos são vários: Discutir as possíveis etiologias da DC; Realçar a importância dos factores genéticos, ambientais, sistema imunitário, epitélio intestinal e microflora para a patogénese da doença; Dar a conhecer os grandes avanços que têm sido alcançados no que diz respeito ao conhecimento dos mecanismos responsáveis pelo desenvolvimento da DC e quais as suas implicações nas terapêuticas futuras e melhoria da qualidade de vida. Dar a conhecer as perspectivas futuras no tratamento da DC 3

19 CAPÍTULO II 2.1 Perspectiva histórica A DC foi descrita pela primeira vez há cerca de quatrocentos anos atrás. Em 1612, Gullielmus Fabricius Hildenus verificou na autópsia de um rapaz com dor subhepática que o cego estava contraído e invaginado no íleon, de tal forma que não era possível que o conteúdo intestinal passasse para o cólon. Ao extrair o cego, este estava ulcerado e fibrótico (1). No início do século XIX, Combe e Saunders descreveram o caso de um homem com queixas abdominais crónicas que na autópsia demonstrava espessamento, inflamação e estenoses do íleon (2). Foi, no entanto, o clássico artigo de Crohn et al, já no século XX, que definitivamente definiu esta entidade que se viria a denominar DC (3). Com o conhecimento de maior número de casos, o interesse dirigiu-se não só para a clínica mas também para as complicações, estratégias terapêuticas e busca de critérios de diagnóstico. Surgiram especulações etiológicas que incluíam infecções bacterianas, distúrbios psicológicos, deficiências nutricionais e alergia gastrointestinal (2). Com o aparecimento dos corticóides, antibióticos, e imunossupressores, abriram-se novos horizontes terapêuticos e incentivaram-se as novas descobertas na segunda metade do século XX. Em Portugal, os dados relativos a esta doença são bastante mais difíceis de encontrar. Embora sem provas fidedignas, mas baseando-se em suspeitas clínicas, pensa-se que, entre 1870 e 1880, o escritor Eça de Queiroz terá sofrido de DC que lhe provocou diarreia crónica sanguinolenta, má absorção e fístulas anais e que terá sido a causa de morte em 1900 (3). 4

20 Em 1947, Maria Rosa publicou a sua dissertação de doutoramento sobre ileíte regional: Doença de Crohn, uma tese extremamente importante para o conhecimento da DC, tendo em conta a pouca informação existente acerca desta entidade no nosso país. Este trabalho estudou dez casos com várias formas de ileíte regional, desde os aspectos estenosantes aos fistulizantes, todos operados e com exames histopatológicos (3). Vários outros artigos foram publicados, como é o caso do artigo Doença de Crohn de António Saturnino Gentil Roque, em 1957 (3). Na década de 70, Ermelinda Camilo introduziu, no Hospital de Santa Maria, alimentações entérica e parentérica em doentes com DC e foram organizadas consultas específicas para a DII (3). Em 1994 Tavarela Veloso impulsionou a criação da APDI (3). Já no século XXI foi criada uma organização muito importante: o Grupo de Estudos da DII (3). Desde o ano 2000 que foram desenvolvidas consultas individualizadas da DII em vários hospitais, nomeadamente: Castelo Branco, Covilhã, Viseu, Vila Real, entre outros, o que indica a necessidade crescente de diagnosticar e tratar esta doença (3). Apesar da publicação de um número cada vez maior de trabalhos de pesquisa sobre a DC, esta doença continua a ser um desafio pois ainda pouco se sabe sobre a sua etiologia e patogénese. 5

21 CAPÍTULO III 3.1 Considerações gerais Definição A DC é uma doença inflamatória crónica transmural e segmentar que pode atingir qualquer parte do TGI, desde a boca até ao anús, com localização preferencial a nível do íleon terminal. Caracteriza-se pela formação de ulcerações, fístulas, estenoses e granulomas, e evolui caracteristicamente por períodos de agravamento e remissão. Envolve um amplo espectro de manifestações extra-intestinais Epidemiologia A DC pode ocorrer em qualquer idade, mas apresenta uma distribuição bimodal. O maior número de casos surge tipicamente na segunda e terceira década de vida, ocorrendo um outro pico, embora mais pequeno, entre os 60 e 80 anos (4). Poderá ser mais frequente em mulheres (relação M/H é 1:1 até 1.8:1) e ocorre sobretudo, em classes socioeconómicas mais elevadas (5). Existe uma variação de acordo com o grupo étnico: os judeus são mais afectados que os não judeus caucasianos e estes mais que os hispânicos e asiáticos (4). Destacam-se como factores de risco o tabaco e os CO. A apendicectomia que tem um papel protector na CU, na DC não desempenha qualquer protecção (4). O início e severidade da DC são aumentados pelo tabaco, como demonstrado pelo aumento das intervenções cirúrgicas e uso de imunossupressores, maiores recorrências pós-cirúrgicas e taxas de mortalidades mais elevadas em indivíduos fumadores (6). 6

22 Caracteriza-se pela existência de um padrão de agregação familiar, uma vez que os familiares em primeiro grau de indivíduos afectados têm cinco vezes mais probabilidade de virem a desenvolver a doença (7). A incidência varia de acordo com a área geográfica, o que poderá sugerir a intervenção de factores ambientais. A taxa de incidência da DC a nível mundial é de 0,1-16/10 5 habitantes (8). As maiores taxas são observadas na Europa ocidental e do norte, assim como nos EUA, enquanto as mais baixas são registadas em África, América do Sul e Ásia (8). É, por isso, mais comum nos países desenvolvidos e industrializados, apontando-se a urbanização como um possível factor de risco (8). Apesar disso, a incidência tem vindo a aumentar em áreas outrora consideradas com baixas taxas de incidência, o que poderá estar relacionado com adopção de um estilo de vida mais ocidental: alterações na dieta, hábitos tabágicos e maior exposição à poluição e químicos industriais (5). A prevalência da DC nos EUA é de 26,0-198,5/10 5 habitantes e a incidência é de 3,1-14,6/10 5 habitantes (8). Na Europa, a prevalência é 8,3-214/10 5 habitantes e a incidência de 0,7-9,8/10 5 habitantes (8). A incidência aumentou cerca de dez vezes na última metade do século na Europa e EUA (9). Em Portugal, ignora-se quantos doentes existirão com DC, mas é provável que existam mais de 7000 casos de DII e menos de (3) Etiologia e patogénese Apesar da intensa investigação nesta área, a etiologia ainda é desconhecida. Por isso, várias hipóteses foram propostas (10) (Tabela 1): 7

23 Desregulação da resposta imunitária na DC, as respostas imunitárias inata e adaptativa são inadequadas, com incapacidade de reconhecimento e eliminação dos antigénios bacterianos, activação exagerada e diminuição da apoptose das células Th1 e inactivação de células Tr. Como resultado ocorre uma perda da tolerância à flora comensal e o desenvolvimento de mecanismos inflamatórios exagerados. Defeitos na função de barreira da mucosa intestinal Alterações nas tight junctions, na produção de muco, de IgA e defensinas e o aumento da permeabilidade contribuem para uma inflamação persistente característica da DC. Disbiose uma alteração no balanço entre os microorganismos protectores e agressivos da microflora intestinal altera a homeostasia, tendo como consequência uma inflamação intestinal crónica em indivíduos susceptíveis. Infecção patogénica persistente a DC é desencadeada por diversos agentes patogénicos específicos, entre os quais: MAP, ECAI, Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica e paramixovírus. Apesar de todas estas teorias contribuírem para a compreensão da patogénese da DC, a hipótese mais consensual postula que a esta doença resulta de uma interacção entre factores genéticos, ambientais, sistema imunitário, microorganismos e epitélio intestinal (9) (Figura 1). 8

24 Hipóteses etiológicas na DC Desregulação da resposta imunitária Defeitos na função de barreira da mucosa intestinal Disbiose Infecção patogénica persistente Quadro 1 Hipóteses etiológicas na DC. Tabela traduzida e adaptada de: Sartor RB. Bacteria in Crohn Disease: mechanisms of inflammation and therapeutics implications. J Clin Gastroentrol 2007 May/Jun;41:37-43 Os factores genéticos alteram a função de barreira do epitélio intestinal, as respostas imunitárias e eliminação bacteriana (11). Numa situação normal, uma lesão ou inflamação da mucosa desencadeada, por exemplo, por factores ambientais, é rapidamente controlada devido a uma resposta imunitária adequada e reparação do defeito epitelial (10). No entanto, em indivíduos geneticamente predispostos, verifica-se uma perda da tolerância oral, incapacidade para remover as bactérias invasoras, de diminuir as respostas pró-inflamatórias e de reparar a mucosa, o que origina uma activação contínua e excessiva das respostas imunitárias adaptativas efectoras e uma inflamação crónica desencadeada por organismos patogénicos e comensais (10) (Figura2) Características clínicas De acordo com a classificação de Vienna (1998), esta doença pode ser definida pela localização (íleon terminal, cólon, íleon-cólon e TGI superior), pelo padrão de doença (não-estenosante, não-penetrante, estenosante, penetrante) ou idade do doente (<40 anos; 40 anos) (12). 9

25 Figura 1- Interacção entre os vários factores responsáveis pelo desenvolvimento da DC. A DC resulta da interacção da genética e ambiente com os microorganismos, sistema imunitário e epitélio intestinal. Os factores genéticos regulam as respostas imunitárias e a função de barreira do epitélio intestinal e a eliminação bacteriana. Fonte: Braun J, Wei B. Body Traffic: Ecology, Genetics, and Immunity in Inflammatory Bowel Disease. Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis. 2007;2: Relativamente à localização, 30-40% dos casos é limitada ao ID, 40-55% envolve o ID e cólon e 15-25% têm apenas colite (4). O recto é frequentemente poupado e, em 75% dos indivíduos com doença do ID, o íleon terminal está envolvido na maioria dos casos (4). Os sinais e sintomas variam de leve a grave e de acordo com a localização (4) : 10

26 Figura. 2 Diferentes respostas à lesão intestinal. Em situações normais, uma lesão na mucosa é rapidamente reparada por respostas imunitárias adequadas, mantendo-se a tolerância aos microorganismos comensais. Em indivíduos susceptíveis, há uma incapacidade de eliminar as bactérias e de reparar o epitélio intestinal, o que origina uma activação contínua e excessiva das respostas imunitárias adaptativas efectoras. Fonte: Sartor RB. Bacteria in Crohn Disease: mechanisms of inflammation and therapeutics implications. J Clin Gastroentrol 2007 May/Jun;41: Ileocolite - Episódios recorrentes de dor crónica, febre de baixo grau, diarreia, perda de peso, obstrução intestinal, formação de fístulas para o intestino adjacente, pele, vagina e bexiga; Jejunoileíte má absorção (hipocalcémia, hipomagnesémia, coagulopatia, hipoalbuminémia, anemia megaloblástica), diarreia, esteatorreia, fracturas vertebrais (por hipocalcémia, deficiência de Vitamina D e utilização prolongada de corticóides), entre outros; 11

27 Colite cólicas abdominais, diarreia, mal-estar, hematoquézias, febre de baixo grau, estenoses e fístulas Doença perianal incontinência fecal, formação de estenoses, fístulas e abcessos. Doença gastroduodenal náuseas, vómitos, dor epigástrica, gastrite e formação de fístulas. Porque é uma doença crónica, desenvolve-se com períodos em que a doença é activa e causa sintomatologia, seguida por períodos de remissão. Para a melhoria qualidade de vida, tem contribuído a utilização de vários tipos de terapêuticas: aminossalicilatos, glucocorticóides, antibióticos, imunossupressores, terapêuticas biológicas e cirurgia. O crescente conhecimento sobre a patogénese da DC tem sido importante para a pesquisa de novos tratamentos, podendo no futuro não só melhorar as recidivas mas fundamentalmente tratá-las. 12

28 CAPÍTULO IV 4.1 A influência dos factores ambientais Durante o último século, ocorreram grandes alterações nos tipos de doenças que afectam os seres humanos: as doenças infecciosas que durante anos foram as principais causas de morbimortalidade, foram ultrapassadas pelas doenças neoplásicas e as inflamatórias crónicas (de que é exemplo a DC), o que poderá ser explicado pelos progressos sociais e económicos e o aumento da industrialização (13). A hipótese higiénica foi proposta para explicar esta mudança. Considera que a melhoria da higiene através de um melhor acesso a água canalizada, a alimentos não contaminados, a produtos de higiene, vacinação e a redução do agregado familiar contribuem para que os indivíduos não sejam expostos precocemente aos antigénios dos microorganismos (13;14). Como consequência, desenvolvem-se respostas imunitárias inapropriadas, incapazes de responder eficazmente aos agentes bacterianos patogénicos com os quais o indivíduo entra em contacto mais tardiamente, surgindo assim, processos inflamatórios anormais ou possivelmente a DC (13;14). Entre os diversos factores que condicionam o aparecimento da DC, os ambientais são dos menos compreendidos (15). Vários factores de risco ambientais são considerados: dieta, status social e geográfico, stress, microflora intestinal, alteração da permeabilidade intestinal, apendicectomia, CO, AINES e tabaco, sendo este o melhor exemplo da influência do ambiente no desenvolvimento da DC (13). O consumo de tabaco aumenta o risco de desenvolver DC, as complicações como as estenoses ou as fístulas, a frequência dos surtos da doença, a necessidade de cirurgia e de consumo de corticóides e imunossupressores e a sua descontinuação condiciona melhorias 13

29 significativas (16). O tabaco também condiciona a localização da doença: nos fumadores: existe uma maior prevalência da doença no íleon que no cólon (16). Existem várias explicações. Uma, mais simplista, considera que a nicotina tem mais efeitos no ID porque aqui atinge maiores concentrações e outra, mais provável, refere existirem diferenças na patofisiologia da doença no cólon e no ID (17). No entanto, nem todos os estudos são concordantes em relação aos efeitos do tabaco no desenvolvimento da DC. Assim, por exemplo, Aldhous MC et al consideram que, embora o tabaco esteja relacionado com a localização da doença, não influencia directamente o seu comportamento, pois não está associado com o tempo de desenvolvimento da doença estenosante, penetrante ou com o tempo da primeira cirurgia (17). É sim a localização da doença que determina directamente estes parâmetros. A doença do ID apresenta maior desenvolvimento de estenoses, assim como necessidade de cirurgia (17). Os efeitos do consumo passivo do tabaco na DC são bastante mais controversos. No entanto, Mahid SS et al verificaram que os indivíduos que desenvolvem DC têm uma maior exposição passiva ao fumo do tabaco antes do nascimento mas também durante a infância (18). Portanto, o consumo passivo e activo do tabaco é um factor de risco importante no desenvolvimento desta doença. O tabaco afecta a imunidade humoral e celular. A nicotina tem um efeito inibitório nas células Th2, que predominam na CU, e não tem qualquer efeito nas células Th1, características na DC, o que explica porque o tabaco é um factor protector na primeira (19). No entanto, a nicotina diminui a produção de IgA, a capacidade de fagocitose pelos macrófagos e os mecanismos antioxidantes, altera a microcirculação (diminui a capacidade de vasodilatação dos vasos inflamados, originando uma isquémia e perpetuação da fibrose e ulceração) e aumenta o potencial trombótico associado com a lesão vascular, contribuindo desta forma para a patogénese da DC (16). A tabela 2 faz um resumo das implicações do tabaco na DC. 14

30 Pontos chave O tabaco e as suas implicações na DC O consumo de tabaco passivo e activo aumenta o risco de desenvover DC As complicações e a frequência de surtos são superiores nos fumadores Nos fumadores, existe uma maior prevalência da doença a nível do íleon O tabaco condiciona um aumento na necessidade de cirurgia e um maior consumo de corticóides e imunossupressores, diminui a capacidade de fagocitose pelos macrófagos, a produção de anticorpos, a permeabilidade intestinal e altera a microcirculação. Quadro 2- O tabaco e as suas implicações na DC. Outros agentes ambientais, tais como os CO e os AINES, têm sido estudados no sentido de estabelecer uma relação com a DC. Embora esta relação não seja directa, as mulheres que tomam CO têm um risco duas vezes superior de desenvolver DC (13). Em relação aos AINES, já existe uma clara associação uma vez estes fármacos aumentam a probabilidade de desenvolver novo surto de doença naqueles em remissão clínica (13). O aumento da permeabilidade intestinal é um factor importante na patogénese da DC. Condiciona o aumento da captação de antigénios e a estimulação excessiva do sistema imunitário, o que tem como consequência a perpetuação do processo inflamatório (15). Em suma: embora exista uma forte relação entre os factores ambientais e a DC, nenhum deles isoladamente é capaz de condicionar o seu desenvolvimento, sendo também necessária a presença de genes para que esta doença se possa manifestar (13). 15

31 CAPÍTULO V 5.1 A genética e a sua relação com a patogénese da DC A D.C. é uma doença poligénica complexa, o que significa que vários genes contribuem para o seu desenvolvimento. Uma série de evidências demonstram a importância da genética na D.C: A existência de um padrão de agregação familiar: os familiares de primeiro grau de indivíduos com D.C. têm um risco 5 vezes superior de desenvolver esta doença (7) ; Existência de concordância no tipo e local da doença em membros de famílias com múltiplos membros afectados (20). A identificação de vários genes associados com a D.C.(Tabela 1) Maior taxa de concordância da doença em gémeos monozigóticos (37-58%) (5) que dizigóticos (3.9-18%) (5). No entanto, o facto da concordância entre gémeos monozigóticos ser de apenas 37-58% indica que os genes sozinhos não são suficientes para produzir a doença. Ao longo de vários anos, e ainda actualmente, múltiplos genes têm sido estudados no sentido de determinar a sua ligação à D.C. Foi em 1996, que Hugot et al relataram pela primeira vez a existência de um gene (NOD2/CARD15) com localização no locus IBD1 do cromossoma 16 (21). Subsequentemente novos estudos foram realizados, permitindo confirmar os achados de Hugot et al mas também descobrir novos loci (até à data cerca de 9 IBD1-9) associados não só com a D.C. mas também com a CU. 16

32 Genes associados com a DC Gene Cromossoma Função NOD2/CARD15 16 Produção de citocinas inflamatórias e antiinflamatórias; manutenção da homeostasia intestinal/tolerância oral; produção de defensinas TLR4 9 Produção de citocinas inflamatórias; manutenção da homeostasia intestinal/tolerância oral; manutenção da função de barreira do epitélio intestinal OCTN1(SLC22A4)/ OCTN2 (SLC22A5) 5 Transportadores proteicos para catiões orgânicos e carnitina (co-factor essencial na oxidação dos ácidos gordos); manutenção da integridade do epitélio intestinal DLG5 10 Manutenção da integridade da barreira epitelial e regulação do crescimento celular PPARG 3 Inibidor intracelular do NF-κB Tabela 1- Exemplos de genes associados com DC e respectiva função.tabela adaptada e traduzida de: Sartor RB. Mechanisms of Disease: pathogenesis of Crohn s disease and ulcerative colitis. Nature 2006 Jul;3(7): Estes genes têm funções importantes na regulação da imunidade inata, integridade da barreira epitelial e eliminação microbiana e/ou homeostasia (11). De seguida são descritas as alterações genéticas que mais contribuem para explicar a patogénese da DC NOD2/CARD15 O gene NOD2/CARD15, foi o primeiro gene que se descobriu estar associado à DC. Codifica uma proteína com o mesmo nome, expressa nos macrófagos, neutrófilos, 17

33 linfócitos B e T, CD, células de Paneth e CEI (22). A sua constituição está representada na figura 3. Figura 3- Estrutura do gene NOD2/CARD15. O gene é formado por dois CARD- CARD2 e CARD15, uma região designada NBD e uma outra designada LRR. As mutações SPN12, SPN13 e SPN8, localizadas no domínio LRR estão associadas com o desenvolvimento da DC. Fonte: Lakatos PL. Recent trends in the epidemiology of inflammatory bowel diseases: up or down?. World J Gastroenterol 2006 October 14;12(38): O NOD2/CARD15 é um receptor de reconhecimento padrão citoplasmático do sistema imunitário inato, cujo domínio LRR é responsável pelo reconhecimento intracelular de produtos bacterianos de que é exemplo o PTG, encontrado na membrana de quase todas as bactérias (11). O CARD está envolvido na activação do NF-κB. Através do seu domínio LRR, liga-se ao MDP que é o componente biologicamente activo do PTG (11). Após a interacção com outras proteínas, o NF-κB é activado, com a consequente produção de moléculas de adesão (ICAM-1), citocinas pró-inflamatórias (IL-1, TNF-α, IL-6, IL-12; IL-18) anti-inflamatórias (IL-10) e quimiocinas (IL-8) (22) (Figura 4). O NOD2/CARD15 é também responsável pela expressão de várias moléculas protectoras essenciais para uma eficaz eliminação bacteriana: as defensinas (22). Produzidas pelas células de Paneth (um tipo de CEI especializadas), as defensinas são péptidos antibióticos naturais que representam um importante mecanismo de defesa da 18

34 imunidade inata, uma vez que eliminam rapidamente os microorganismos, ajudando assim a prevenir a invasão bacteriana da mucosa intestinal e mantendo uma homeostasia intestinal (22). Figura 4 Mecanismos responsáveis pela activação do NF-κB e suas consequências a nível da transcrição genética A ligação de endotoxinas (PTG) ao NOD2 origina, através de uma cascata de proteínas, a activação do NF-κB que, após a migração para o núcleo, é responsável pela produção de citocinas pró/anti-inflamatórias, quimiocinas e defensinas. Fonte: Elson CO. Genes, microbes and T cells New Therapeutics targets in Crohn s disease. N Engl J Med 2002 Feb 21; 346(8):

35 As mutações no gene NOD2/CARD15 estão presentes em até 30% dos indivíduos com DC (23). Os portadores heterozigóticos têm o risco aumentado de doença de cerca de 2-4 vezes e os homozigóticos de cerca de vezes (24). Existem três mutações a nível do gene NOD2/CARD15 que estão associadas com a susceptibilidade para a D.C.: L1007fsinsC-SNP13; R702W-SNP8 e G908R- SNP12 (25). Mais de 90% destas mutações estão localizadas a nível do domínio LRR, o que indica que poderão ter importantes consequências no que diz respeito ao reconhecimento bacteriano (24). Além disso, estes polimorfismos podem alterar a produção de defensinas e citocinas. Existem vários modelos propostos para explicar a forma como as mutações no NOD2 podem estar relacionadas com a DC. No entanto, ainda não estão totalmente compreendidas e muitas das explicações que surgem são mesmo paradoxais. Pensa-se que as diferentes mutações originam diferentes fenótipos, que vão desde uma perda a um aumento de função do NOD2/CARD15 (26). Como é que uma perda de função, ou seja, uma incapacidade de responder aos produtos bacterianos desencadeia respostas inflamatórias? Sabe-se que, as mutações que estão associadas a uma perda de função originam uma diminuição da produção das defensinas. Isto permite que as bactérias proliferem e atravessem a barreira epitelial, entrando em contacto com as CAA da mucosa, responsáveis pela indução de uma resposta inflamatória Th1 exagerada (22). Além disso, estas mutações têm outras importantes consequências: diminuição do reconhecimento bacteriano e da produção de citocinas (IL-1; IL-8) e quimiocinas o que origina um defeito na eliminação das bactérias invasoras e a aumento da susceptibilidade para infecções (23) ; diminuição de citocinas anti-inflamatórias (IL-10) pelas CD e consequente perda de respostas 20

36 reguladoras; diminuição do reconhecimento das bactérias comensais, o que evita o desenvolvimento de tolerância à microflora comensal e o desencadeamento de respostas inflamatórias exageradas (23). No entanto, estas teoria ainda são muito especulativas e não explicam de forma definitiva a patogénese da doença. A perda de função do NOD2 aumenta a susceptibilidade para infecções por Listeria monocytogenes (26). A teoria do aumento da função foi suportado por estudos em modelos animais que possuíam uma mutação muito idêntica à variante L1007fsinsC (26). Nestes estudos, demonstrou-se um aumento da activação do NF-κB e elevação da secreção do IL-1 pelos macrófagos, o que contribuiria para um processo inflamatório característico da DC (22). No entanto, os macrófagos de doentes com Crohn e que possuem a variante L1007fsinsC não têm uma aumento da secreção de IL-1 (26). O Quadro 3 faz um resumo das implicações do gene NOD2/CARD15 e respectivas mutações na DC. Pontos chave As mutações no gene NOD2/CARD15 e as suas implicações na DC Três mutações no NOD2/CARD15 estão associadas com o desenvolvimento da DC: L1007fsinsC-SNP13; R702W-SNP8 e G908R-SNP12 As mutações podem originar perda ou ganho de função do NOD2 Activação excessiva do NF-κB em modelos animais aumenta a produção de citocinas inflamatórias, o que contribui para a lesão do epitélio intestinal; no entanto esta hipótese ainda não está comprovada em humanos A diminuição da activação do NF-κB origina uma diminuição da produção das defensinas, defeito no reconhecimento de bacteriano e de produção de IL-10. Quadro 3 Pontos chave: As mutações no gene NOD2 e suas implicações no desenvolvimento da DC 21

37 Tem sido sugerido que as mutações no gene NOD2/CARD15 influenciam o fenótipo da doença. Estão associadas com o aparecimento mais precoce da DC, com doença localizada a nível do íleon e doença fibro-estenosante (23). Os achados relativos ao papel das mutações do NOD2 são contraditórias e mais estudos são necessários para compreender o seu papel na patogénese da DC TLR Os TLR constituem uma família de cerca de onze receptores transmembranares. A sua estrutura está representada na figura 5. São expressos na superfície dos monócitos, macrófagos, CD e CEI (24). A função de cada um dos TLR e as possíveis interacções entre eles e os ligandos não bacterianos ainda não está completamente definida. Figura. 5- Estrutura dos receptores TLR. Os TLR são receptores transmembranares constituídos por um domínio LRR, um domínio TIR e uma região transmembranar curta (não representada na figura). Duas mutações D299G e T3991 localizadas no domínio LRR, poderão estar associadas com respostas imunitárias desreguladas aos produtos microbianos. O LRR é responsável pelo reconhecimento bacteriano e o TIR pela activação de toda a cascata de eventos que desencadeia a activação do NF-κB. Fonte: Cario E. Bacterial interactions with cells of intestinal mucosa: Toll-like receptors and NOD2. Gut 2005 Apr 19;54:

38 Tal como as proteínas NOD, são receptores de reconhecimento padrão do sistema imunitário inato da mucosa, que reconhecem diferentes classes de produtos microbianos e desempenham um importante papel no desencadeamento da resposta imunitária inata, na homeostasia intestinal e controlo da infecção através da activação do NF-κB (Figura 4) e produção de citocinas inflamatórias (22). Para além de reconhecerem os microorganismos patogénicos, são essenciais na identificação da microflora comensal e indução da tolerância oral (13). A interacção das bactérias comensais com os TLR (nomeadamente o TLR2 e TLR4) contribuiu para a manutenção da integridade da barreira epitelial através da produção de factores tecidulares protectores, IL-6 e TNF (27). Embora estas citocinas estejam associadas com o desencadeamento de mecanismos inflamatórios, também desempenham um papel protector (27). Diferentes padrões moleculares activam selectivamente diferentes TLR, tal como representado na figura 6 (22). Figura.6- Vários tipos de TLR e respectivos ligandos. O TLR2 é um receptor para o peptidoglicano, o TLR3 para dsrna, o TLR 4 para os LPS e o TLR-5 para a flagelina bacteriana. Fonte: Cario E. Bacterial interactions with cells of intestinal mucosa: Tolllike receptors and NOD2. Gut 2005 Apr 19;54:

39 A compartimentalização subcelular dos TLR é um determinante crítico da resposta imunitária (22). In vivo, o TLR5 está localizado no pólo basolateral e no apical, no entanto, o basolateral é o único a responder à flagelina com a produção de citocinas inflamatórias. Isto significa que, apenas os microorganismos com capacidade invasiva e não as bactérias comensais, desencadeiam uma resposta inflamatória. Assim, o TLR5 da superfície basolateral tem a capacidade de detectar a invasão de uma grande quantidade de microorganismos numa fase precoce, desde que a flagelina atinja este pólo da célula (28). Num indivíduo normal, as CEI expressam sobretudo TLR3 e TLR5, enquanto o TLR2 e TLR4 estão presentes em menor quantidade, o que permite que estas células minimizem a resposta às bactérias comensais e que, portanto, co-habitem com uma elevada concentração destas bactérias (29). No entanto, na DC, existe uma diferença de expressão do TLR 4 e TLR3. O TLR3 está significativamente diminuído na DC activa (30), enquanto o TLR4 está muito aumentado, o que significa que vai haver uma resposta exagerada em relação à microflora intestinal (30). O TLR2 e TLR5 permanecem inalterados. O gene do TLR4 está localizado no cromossoma 9. Duas mutações que foram observadas no TLR4 - Asp299Gly e Thr399Il - estão associadas com o desenvolvimento da DII em populações caucasianas (24). Tal como no NOD2, poderá haver uma diminuição ou ganho de função. A primeira é responsável pelo aumento da susceptibilidade a infecções, perda de tolerância às bactérias comensais e diminuição da integridade da barreira epitelial (22). O ganho de função, origina o desenvolvimento de respostas pró-inflamatórias excessivas em resposta a concentrações fisiológicas de LPS (22). 24

40 Como conclusão, podemos afirmar que os TLR têm pelo menos duas funções distintas: protecção contra a infecção e controlo da homeostasia e, que estas funções dependem, respectivamente, do reconhecimento de microorganismos patogénicos e comensais (27). Isto explica porque razão as citocinas aqui produzidas estão envolvidas quer na defesa quer na reparação tecidular (27). No entanto, mais estudos serão necessários para confirmar o papel dos TLR e respectivas mutações na patogénese da DC. A figura 6 descreve as implicações das variantes alélicas do NOD2 e TLR na DC. Figura 7 - Implicações das variantes alélicas do NOD2 e TLR na DC. Em indivíduos saudáveis, o TLR aumenta a função de barreira do epitélio intestinal e a tolerância oral e o NOD2 contribui para a eliminação de microorganismos e diminuição da invasão bacteriana devido à produção de defensinas. Na DC, as mutações no TLR e NOD2 alteram todas estas funções. Fonte: Cario E. Bacterial interactions with cells of intestinal mucosa: Toll-like receptors and NOD2. Gut 2005 Apr 19;54:

41 CAPÍTULO VI 6.1 Tolerância oral Num ambiente como o intestino, o sistema imunitário da mucosa tem de ter a capacidade de manter a tolerância às bactérias comensais e aos alimentos, mas também desenvolver respostas de defesa perante os agentes patogénicos. Vários autores consideram que, na DC, esta capacidade está diminuída e que, portanto, existe uma perda da tolerância oral (31). A tolerância oral em indivíduos normais é mediada essencialmente pelas CEI, células Tr, linfócitos B e CD que secretam IL-10, IFN-α/β e TGF-β (11). As CEI são de enorme importância para a manutenção desta tolerância. Com as suas tight junctions, com a produção de muco, de imunoglobulinas e de defensinas, impedem o contacto directo dos antigénios bacterianos comensais com o tecido folicular e o consequente desenvolvimento de respostas inflamatórias. Além disso, as células M, um tipo de CEI especializadas, transportam os antigénios para as CD e outras CAA que, por sua vez, vão induzir uma resposta imunitária ou uma tolerância oral ao estimular as células TCD4 + efectoras (Th1/Th17) ou as células Tr, respectivamente (32) (Figura8). Em condições fisiológicas, as CD produzem sobretudo IL-10, IFN-α/β e TGF-β que estimulam a acção das células Tr, contribuindo para a homeostasia intestinal (9). Na DC, as CD produzem mais IL-12, uma importante citocina que activa as células Th1, responsáveis pelas respostas inflamatórias (13). 26

42 IL-12;IL23 IL-10; INFα/β; TGF-β Th1/Th17 Tr Figura 8 Mecanismos de tolerância oral na DC. As CEI produzem muco, IgA e defensinas. As células M transportam os antigénios para as CD e outras CAA que, por sua vez, os apresentam às células T imaturas, a nível das placas de Peyer. As CD estimulam o desenvolvimento de uma resposta imunitária ou de tolerância ao promoverem as células T efectoras ou Tr, respectivamente. A IL-10, o IFNα/β e o TGF-β desencadeiam a formação de células Tr, o que contribui para a homeostasia intestinal. Fonte: Figura adaptada de: O Hara AM, Shanahan F. The gut flora as a forgotten organ. EMBO 2006 Feb 23;7: Vários mecanismos moleculares asseguram a tolerância via TLR, nas CEI e outras CAA (22) : Diminuição da expressão do TLR2 e TLR4, o que limita o desencadeamento de respostas imunitárias aos antigénios das bactérias comensais; Expressão do TLR5 apenas na membrana basolateral; Reguladores externos expressos pelas CEI que suprimem a acção dos TLR Tollip, SIGIRR e PPARG Activação do PPARG pelas bactérias comensais, o que tem como consequência a diminuição da expressão do NF-κB mediada pelo TLR e uma 27

43 atenuação da inflamação do cólon. Esta molécula tem potente actividade antiinflamatória e está diminuída na DC (9). Assim, qualquer distúrbio a nível destes receptores contribui para uma perda da tolerância imunitária, constituindo por isso, importantes alvos numa terapêutica futura. Como se pode verificar, as próprias bactérias comensais são também essenciais na manutenção da tolerância oral. Na DC verifica-se alteração na microflora intestinal. O balanço entre as células TCD4 + efectoras e as células Tr é essencial para a manutenção da homeostasia da mucosa (33). Os principais tipos de células Tr são as células Tr CD4 + /CD25 +, Tr1, células Th3 e as células TCD8 + /CD28 -. Estas células, através da produção das citocinas IL-10 e TGF-β, inibem a produção de IL inflamatórias pelos macrófagos e diminuem a activação das células Th1 e de CAA, podendo constituir terapêuticas potenciais em doenças induzidas por este tipo de células (33). Em indivíduos normais, existe um equilíbrio entre as células TCD4 + efectoras e as Tr. No entanto, na DC verifica-se ocorre um desequilíbrio entre estes dois tipos de células: as primeiras com respostas inflamatórias excessivas e as segundas com actividade de supressão inflamatória diminuída (33). Polimorfismos no gene NOD2/CARD15 originam um defeito no reconhecimento da flora, o que contribui para a diminuição da tolerância oral. O quadro 4 faz um resumo dos principais mecanismos responsáveis pela indução da tolerância oral. 28

44 Pontos chave Tolerância oral A tolerância oral em indivíduos normais é mediada pelas CEI, células Tr, linfócitos B, CD e bactérias comensais As CEI, com as suas tight junctions, produção de muco, imunoglobulinas e defensinas, impedem o contacto directo dos antigénios bacterianos comensais com o tecido folicular e o consequente desenvolvimento de respostas inflamatórias. As CD estimulam as células Tr devido à produção de IL-10, IFN-α/β e TGF-β Existem diversos mecanismos qua asseguram a tolerância via TLR As bactérias comensais activam o PPARG, o que impede activação do NF-κB e a produção de citocinas pró-inflamatórias A existência de um equilíbrio entre células Tr e efectoras permite a manutenção da homeostasia intestinal Todos estes mecanismos estão alterados na DC Quadro 4 Pontos chave na tolerância oral 29

45 CAPÍTULO VII 7.1 O papel do sistema imunitário na DC Os grandes avanços científicos nas últimas décadas permitiram um profundo conhecimento no que diz respeito às alterações imunitárias observadas na DC. E sem dúvida que essas alterações são enormes. Embora os factores genéticos e ambientais contribuam em larga medida para os distúrbios imunológicos observados nesta doença, a compreensão dos mecanismos imunitários ajuda-nos a definir novas bases de tratamento (33) Imunidade inata A descoberta da associação da DC com mutações a nível dos genes NOD2/CARD15 e TLR, cujos produtos são encontrados em células da imunidade inata, fez aumentar o interesse por este tipo de resposta imunitária (13). Activação do NF-κB estimula a expressão de diversas moléculas relevantes para a patogénese da DC: IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, IL-23, TNF-α, moléculas de adesão e moléculas co-estimuladoras (CD40, CD80, CD86) (26) essenciais para a interacção entre os vários elementos do sistema imunitário, nomeadamente para activação das células T. Na DC, os macrófagos e as CD não só estão aumentadas em número, como também expressam de forma exagerada TLR2 e TLR4, moléculas co-estimuladoras e produzem mais citocinas pró-inflamatórias como IL-12 e IL-6, com a consequente activação de células Th1 (13). Além disso, as CD produzem menos IL-10, o que diminui as respostas reguladoras (23). A tabela 2 representa os vários tipos de citocinas inflamatórias predominantemente produzidas pelo sistema imunitário inato. 30

46 Grupos de citocinas inflamatórias produzidas pelo sistema imunitário inato na DC Citocina Células produtoras Células alvo Efeitos IL-1 Monócitos/ macrófagos, Todas as células Aumenta a produção de fibroblastos; células moléculas de adesão; epiteliais; células B recrutamento de neutrófilos e macrófagos; aumento da produção hepática de proteínas de fase aguda IL-6 Monócitos/macrófagos; Células T; células B, Aumento da produção de fibroblastos; células células epiteliais; proteínas de fase aguda; epiteliais e endoteliais monócitos/macrófagos diferenciação e crescimento das células T e B IL-8 Monócitos/macrófagos; Neutrófilos; célulast; Induz a migração de neutrófilos, células T; neutrófilos; monócitos/macrófagos; monócitos e célulast; aderência fibroblastos; células células endoteliais e dos neutrófilos às células endoteliais e epiteliais basófilos endoteliais e a libertação de histamina pelos basófilos IL-12 Macrófagos, CD, Células T e NK Induz a formação de células Th1 neutrófilos; e aumenta a actividade das IL-18 Macrófagos Células T e B; macrófagos IL-23 CD; Células Th17 monócitos/macrófagos TNF-α Monócitos/macrófagos; Todas as células mastócitos; basófilos, excepto os eritrócitos eosinófilos; NK, células B, célulast, células epiteliais células citotóxicas TCD8+ Aumenta a produção de IFN-γ; aumenta a citotóxicidade das NK Estimula a produção de IL-17, TNF-α e IL-6 Aumento da citotóxicidade dos leucócitos; aumento da função das NK; induz a produção de citocinas pró-inflamatórias e de proteínas de fase aguda; recrutamento de neutrófilos; produção de moléculas de adesão; activação da coagulação Tabela 2- Citocinas inflamatórias produzidas pelo sistema imunitário inato na DC. Fonte: Tabela traduzida de. Fauci AS, Braunwald E, Isselbacher KJ, Wilson JD, Martin JB, Kasper DL, et al, editors. Harrison s principles of internal medicine. 17th ed. New York: McGraw Hill, Health; Professions Division;

47 Note-se que, embora estas citocinas sejam também produzidas por outros tipos de células, o seu aumento na DC deve-se, sobretudo, ao sistema imunitário inato. As células de Paneth também têm um contributo importante. Na DC, a mutação do gene NOD2 diminui a produção das defensinas por estas células, o que reduz a resistência contra os microorganismos entéricos. As moléculas de adesão, de que são exemplo a ICAM-1 e as integrinas, são essenciais para a migração dos leucócitos para o foco inflamatório. A sua produção está aumentada na DC. O TNF-α é um dos mediadores mais importantes nesta doença. É produzido por vários tipos de células e tem entre outras funções, a produção de moléculas de adesão e citocinas inflamatórias, apoptose celular, recrutamento de neutrófilos para os locais de inflamação, activação da coagulação e indução da formação de granulomas (34). Vários estudos demonstraram um aumento do TNF- α no soro, fezes e mucosa intestinal de indivíduos com DC (33). Um desequilíbrio entre a secreção e a inibição do TNF-α poderá estar implicado na patogénese da doença (35). O bloqueio do TNF-α por anticorpos monoclonais (infliximab) diminui as respostas Th1, sendo por isso usado como uma forma de tratamento eficaz na DC moderada a severa, com melhorias em termos clínicos e endoscópicos (26). O TL1A, recentemente identificado como membro da família do TNF-α, está aumentado na DII (31). É produzido pelas CD e actua nas células TCD4+, onde estimula a produção de IFN-γ (31). Mutações no gene do TL1A aumentam a susceptibilidade para a DC (31). 32

48 O sistema imunitário inato tem um importante papel no controlo da invasão das bactérias luminais e na prevenção de respostas pró-inflamatórias de longa duração (23). Qualquer falha nestes mecanismos pode estar na origem da DC Imunidade adaptativa O sistema imunitário adaptativo desempenha um papel essencial na patogénese da DC. A natureza das respostas imunitárias e o tipo de citocinas produzidas está sob o controlo genético e determina as características do processo inflamatório (31) Respostas das células T e B Dois tipos de células TCD4 + efectoras, Th1 e Th2, causam uma inflamação crónica intestinal, predominando na DC um padrão de respostas Th1 e na CU o padrão Th2. A IL-12 produzido por CAA induz a formação de células Th1 produtoras de IFNγ, IL-2 e TNF-α. Por sua vez a IL-4 estimula a produção de IL-5 e IL-10 pelas células Th2 (31). Os principais tipos de citocinas inflamatórias produzidas na DC pelo sistema imunitário adaptativo estão representados na tabela 3. Para a inflamação na DC, contribui uma resposta exagerada das células Th1 aos componentes da microflora intestinal (11). Estas células, têm entre outras funções, o aumento da expressão de moléculas MHC-II nas CAA, a activação de células T citotóxicas (TCD8+), activação de macrófagos e a produção de IgG pelos linfócitos B (36) (Figura 9). 33

49 Citocinas inflamatórias produzidas pelo sistema imunitário adaptativo na DC Citocinas Células produtoras Células alvo Efeitos IFN-γ Células Th e NK Todas as células Regula a activação dos macrófagos e NK; estimula a secreção de Ig pelas células B; aumenta a expressão de moléculas MHC-II; estimula a produção de células Th1 IL-17 Células TCD4+ Fibroblastos, endotélio e epitélio Aumento da secreção de citocinas que estimulam as respostas Th1; Tabela 3- Grupo de citocinas inflamatórias produzidas pelas respostas imunitárias adaptativas na DC. Tabela traduzida e adaptada de Fauci AS, Braunwald E, Isselbacher KJ, Wilson JD, Martin JB, Kasper DL, et al, editors. Harrison s principles of internal medicine. 17th ed. New York: McGraw Hill, Health; Professions Division; Para além deste tipo de respostas imunológicas, existe outra que se tem vindo a dar cada vez mais atenção: IL-23/IL-17. Estas citocinas estão aumentadas nos tecidos de indivíduos com D.C. (26). A IL-23, produzido pelas CAA, tais como as CD e macrófagos, estimula a produção de IL-17, TNF-α e IL-6 pelas células Th17 (31) (Figura9). A IL-17 tem uma potente actividade pró-inflamatória que induz a produção de citocinas que aumentam as respostas Th1, quimiocinas, factores de crescimento (G-CSF, GM-CSF, IL-6) e moléculas de adesão pelas células epiteliais, endoteliais e fibroblastos (37). Embora se considere que a DC seja mediada por células Th1 devido aos elevados níveis de IL-12 e IFN-γ detectados, novos achados sugerem que a IL-23 é uma citocina chave na inflamação intestinal (31). Num estudo realizado por Yen D et al, verificou-se que, em modelos animais, o desenvolvimento de colite estaria suprimido pela deficiência de IL-23 mas não de IL-12 e que a administração de IL-23 acelera o início de colite (38). Esta supressão é devida à subsequente inibição da IL

50 Apesar destes resultados, o papel das células Th1 não deve ser excluído, uma vez que a IL-12/IFN-γ e a IL-23/IL-17 são vias paralelas na DC. No entanto, elas são mutuamente exclusivas, uma vez que o IFN-γ suprime a IL-17 e vice-versa (26). IL-23 IL-12; IL-18 Activation of Th17 cells TNF-α; IL-17 ; IL-6 Figura 9 Activação do sistema imunitário adaptativo na DC e suas funções. As CD ou outras CAA produzem IL-12 e IL-23, citocinas responsáveis pela activação de células Th1 e Th17, respectivamente. As células Th1, pela produção de várias IL, nomeadamente a IL-2, TNF-α e IFN-γ, estimulam a acção células citotóxicas TCD8+, dos macrófagos e a produção de IgG pelos linfócitos B. As células Th17 produzem IL-17, TNF-α e IL-6. A IL-17 é responsável pela produção de citocinas que promovem as respostas Th1, de quimiocinas, factores de crescimento (G-CSF, GM-CSF, IL-6) e moléculas de adesão pelas células epiteliais, endoteliais e fibroblastos Figura adaptada de Fauci AS, Braunwald E, Isselbacher KJ, Wilson JD, Martin JB, Kasper DL, et al, editors. Harrison s principles of internal medicine. 17th ed. New York: McGraw Hill, Health; Professions Division;

51 Sendo assim, quer a resposta Th1 quer o eixo IL-17/IL-23 devem ser considerados da maior importância para a patogénese da DC. A diminuição das células Tr, tal como referido anteriormente, contribui para o desenvolvimento de uma resposta inflamatória excessiva. Para além das alterações nas células T, também as células B se encontram afectadas. A produção de IgG, principalmente o IgG2, está aumentada a nível sistémico assim como na mucosa intestinal de doentes com Crohn (13). A figura seguinte faz um resumo das alterações imunitárias na DC Figura 10 Defeitos da imunorregulação na DC. Respostas imunitárias inatas inadequadas, quer pelas CAA ou pelas CEI, induzem respostas inflamatórias através da secreção de quimiocinas e IL pró-inflamatórias. Disfunção das células Tr ou CAA originam respostas T agressivas. Fonte: Sartor RB. Microbial influences in inflammatory bowel diseases. Gastroenterol 2008;134:

52 7.1.3 Apoptose celular Um aspecto importante a ter em consideração quando se fala dos mecanismos imunológicos na DC, diz respeito à capacidade de expansão das células TCD4 + efectoras. Em virtude do grande estado de activação destas células, um aumento da apoptose é necessário para manter a homeostase imunitária intestinal. Na DC ocorre uma diminuição dessa susceptibilidade à apoptose. Num estudo realizado por Ina K et al, verificou-se que nos doentes com Crohn, as células T são mais resistentes à apoptose induzida pelo antigénio Fas, TNF, óxido nítrico e pela deprivação de IL-2 (39). Estas anormalidades são devidas a uma alteração do balanço Bcl-2/Bax na mucosa. O Bcl-2 contribui para a protecção contra a apoptose enquanto o Bax a promove. Na DC, expressão do Bax está diminuída e a de Bcl-2 aumentada (39). A insuficiente apoptose pode interferir com os mecanismos reguladores da tolerância à microflora intestinal e originar uma acumulação de células TCD4 + efectoras, o que contribui para a inflamação crónica característica da DC. 37

53 CAPÍTULO VIII 8.1 Disfunção da barreira epitelial intestinal Num indivíduo normal, as bactérias são eficazmente excluídas do contacto com o sistema imunitário da mucosa por uma barreira epitelial intacta. Desta barreira fazem parte as células epiteliais, tight junctions, muco, IgA e as defensinas que, juntamente com outros factores luminais tais como ácido gástrico, enzimas pancreáticas, ácidos biliares e peristaltismo, contribuem para evitar lesões na mucosa intestinal (Figura11) (10). Em situações normais, qualquer lesão na mucosa é rapidamente reparada por mecanismos de restituição. São os defeitos na barreira epitelial que vão permitir que o tecido folicular seja exposto a uma quantidade excessiva de antigénios bacterianos, com a consequente produção de citocinas pró-inflamatórias (Figura 11) (26). Evidências do aumento da permeabilidade intestinal são encontradas em indivíduos com DC. As tight junctions (Figura 12) são formadas por uma variedade de proteínas de que são exemplo: a ocludina, moléculas de adesão juncionais e claudinas que determinam quais as moléculas que atravessam a barreira epitelial (40). Na DC foram identificadas alterações nestas proteínas (40). Alterações nas tight junctions permitem que os microorganismos ultrapassem a barreira epitelial e contactem com as células imunitárias. Factores inflamatórios como o IFN-γ, TNF-α e IL-13 alteram as tight junctions e são responsáveis pela diminuição da função da barreira epitelial (40). 38

54 b Figura 11 Barreira epitelial íntegra vs barreira epitelial alterada. a Imunorregulação - Da barreira epitelial intestinal fazem parte as CEI, a camada de muco, as Igs e as defensinas. Todos estes factores contribuem para evitar lesões na mucosa intestinal. b- Disfunção da barreira epitelial - Quando existe uma alteração na barreira intestinal, as células efectoras TCD4+ são expostas a uma quantidade excessiva de antigénios bacterianos, o que origina uma resposta imunitária destrutiva e lesão tecidular. Figura adaptada de Braun J, Wei B. Body Traffic: Ecology, Genetics, and Immunity in Inflammatory Bowel Disease. Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis. 2007;2:

55 Figura 12- Estrutura das Tight junctions. Fonte: junction O TNF-α e a IL-13 para além de estimularem a expressão de uma tight junction específica, a claudina 2 que, de forma directa, aumenta a permeabilidade intestinal devido à formação de poros na membrana celular (40), também desencadeiam a apoptose das CEI. O TNF-α e o IFN-γ diminuem a expressão da ocludina (que diminui a passagem de moléculas na barreira epitelial) e estimulam a MLCK responsável pela fosforilação da miosina, o que altera os componentes do citoesqueleto das tight junctions (41) (Figura13). Terapêutica anti-tnf-α permite restaurar a integridade do epitélio e diminuir a apoptose dos enterócitos (33). Num estudo realizado em 2007 por Zeissig S et al, verificou-se que, na DC, a claudina 2 está aumentada e as proteínas que reforçam a barreira epitelial claudina 5, claudina 8 e ocludina têm a sua expressão diminuída (42). 40

56 Figura 13 Activação da MLCK na DC. O TNF-α e o IFN-γ produzidos pelos macrófagos (6) e células Th1 CD4+ (4), estimulam a MLCK responsável pela fosforilação da miosina, o que altera os componentes do citoesqueleto das tight junctions. Fonte: As CEI constituem uma barreira física à passagem de microorganismos e produzem factores que excluem as bactérias da lâmina própria muco, IgA, IgG e as defensinas. Mutações no gene NOD2 diminuem a sua produção, tendo como consequência o aumento da susceptibilidade às infecções. Além disso, alterações nos receptores TLR e na flora comensal reduzem a função de protecção da barreira epitelial. Dois genes associados com a DC e que afectam a permeabilidade da mucosa foram identificados: OCTN e DLG5. As mutações no gene do OCTN diminuem a oxidação dos ácidos gordos e aumentam o transporte de catiões orgânicos para o interior da célula, o que promove a lesão celular, enquanto as mutações no gene DLG5 alteram a produção de proteínas envolvidas na manutenção da integridade epitelial (25). Resumindo: A manutenção da função da barreira epitelial é essencial para a homeostasia intestinal e qualquer factor que altere esta barreira favorece o desenvolvimento de respostas inflamatórias. 41

57 Capítulo IX 9.1 O papel dos microorganismos na patogénese da DC Microflora intestinal A microflora intestinal é constituída por um conjunto complexo de bactérias essenciais para a saúde normal de um indivíduo. A sua concentração e complexidade aumentam do estômago até ao cólon, onde são atingidas as mais altas concentrações de bactérias ( organismos/grama) (43) (Figura 14). Figura 14 Distribuição dos diferentes tipos de bactérias pelos segmentos do TGI. O seu número e complexidade aumentam do estômago ao cólon. Fonte: Sartor RB. Microbial influences in inflammatory bowel diseases. Gastroenterol 2008;134:

58 Mais de 99% de todos estes microorganismos pertencem a quatro divisões de bactérias (43) : Firmicutes (64%), Bacteroidetes (23%), Proteobacteria (8%), e Actinobacteria. Os géneros Clostridium, Streptococcus e Lactobacillus constituem o primeiro grupo; a E.coli pertence à divisão Proteobacteria e do último fazem parte os géneros Actinomyces, Corynebacterium e Bifidobacterium. A microflora intestinal forma uma barreira de defesa natural e exerce numerosos efeitos protectores, estruturais e metabólicos no epitélio intestinal, tal como indicado no quadro 5. Funções da microflora intestinal Síntese de aminoácidos e vitaminas (folatos, biotina, Vitamina Ke vitaminas do complexo B) Produção de ácidos gordos de cadeia curta (butirato) a partir de fibras da dieta (Clostridium e Bifidobacterium). Estes ácidos gordos têm características antiangiogénicas e anti-proliferativas e constituem a principal fonte de energia dos enterócitos (43) Atenuação das respostas pró-inflamatórias induzidas por bactérias patogénicas, devido ao aumento do PPARG (fig.15) (44) Indução e manutenção das células reguladoras TCD4+CD25+ (45) Manutenção da integridade do epitélio intestinal através da interacção com os receptores TLR (46) Produção de factores anti-microbianos, por exemplo acido láctico e bacteriocinas (32) Quadro 5- Funções da microflora intestinal 43

59 Figura 15- Acção da flora comensal na atenuação das respostas pró-inflamatórias induzidas por bactérias patogénicas. As bactérias patogénicas activam a quinase IκB, promovem a degradação do IκBα e a migração nuclear das sub-unidades p55 e p65 do NF-κB. Algumas bactérias comensais activam o PPARG que impede activação do NF-κB devido à exportação nuclear de uma das suas subunidades, o p65. Outras bactérias comensais inibem a degradação do IκBα e a activação da quinase IκBα Fonte: O Hara AM, Shanahan F. The gut flora as a forgotten organ. EMBO 2006 Feb 23;7: Apesar de todas estas importantes funções, os microorganismos que constituem a flora intestinal podem ser responsáveis pelo desenvolvimento da DC em indivíduos geneticamente predispostos e no contexto de uma desregulação imunitária. Desde que vários modelos animais geneticamente alterados não desenvolvem colite na ausência de microorganismos, que cada vez mais a microflora intestinal tem sido considerada como 44

60 um dos mais importantes factores no desenvolvimento da DC (47). No entanto, o papel exacto da microflora ainda não está totalmente estabelecido. Existem algumas diferenças na composição da microflora em indivíduos com DC comparativamente com indivíduos saudáveis (Tabela 4). Indivíduos normais Elevada biodiversidade Microbiota estável Aumento dos agentes comensais Indivíduos com DC Baixa biodiversidade Disbiose Aumento de agentes patogénicos Elevada quantidade de Firmicutes Diminuição da quantidade de Firmicutes Tabela 4- Diferenças entre os microorganismos intestinais de indivíduos normais e com DC. Tabela traduzida de: Shih DQ et al Na DC, a redução da biodiversidade em cerca de 30-50% resulta de uma diminuição das bactérias anaeróbias normais tais como Bacteroides fragilis, Bacteroides vulgatus, Eubacterium e Lactobacillus (26). Para além do Lactobacillus, verifica-se uma redução de bactérias do género Clostridium (47), importantes produtoras de butirato, o que tem consequências no aumento da fragilidade do epitélio intestinal (Figura16). A biodiversidade é importante, porque permite que vários processos, como por exemplo, a produção ou quebra de nutrientes sejam asseguradas e, além disso, evita flutuações caóticas das subpopulações bacterianas, o que impede a lesão da mucosa intestinal (26). Vários agentes patogénicos são aqui encontrados com maior frequência e estão associados com o desenvolvimento da DII: Pectinatus, Sutterella, Fusobacterium, 45

61 Verrucomicrobium, Clostrodia, Mycobacterium paratuberculosis, Listeria monocytogenes e Helicobacter hepaticus (26). Esta alteração na composição da microflora intestinal é designada disbiose. Gera-se um desequilíbrio entre as espécies comensais e as bactérias agressivas, o que contribui para o desenvolvimento de um ambiente pró-inflamatório e uma inflamação intestinal crónica em indivíduos susceptíveis (11) (Figura16). Figura 16 Composição anormal da microflora intestinal e seus efeitos. A diminuição da produção de bactérias protectoras que produzem butirato pode aumentar a permeabilidade intestinal. Por sua vez, o aumento das bactérias agressivas estimula o desenvolvimento de respostas imunitárias patogénicas ou o aumento de metabolitos tóxicos como o hidróxido sulfúrico que bloqueia a produção de butirato e aumenta a permeabilidade intestinal. Fonte: Sartor RB. Microbial influences in inflammatory bowel diseases. Gastroenterol 2008;134:

62 Vários componentes da dieta podem alterar a composição das bactérias comensais, o que pode explicar o aumento da incidência da DC na última metade do século XX (11). Apesar das diferenças encontradas na microflora, é preciso ter em atenção que a disbiose em pacientes com DC pode não ser a causa, mas simplesmente reflectir as diferentes condições ecológicas que surgem como resultado da mucosa intestinal inflamada (26). Vários estudos realizados consideram que a microflora comensal normal é essencial para o desenvolvimento de uma colite experimental: a inflamação não se desenvolve em ambientes estéreis, mas uma vez introduzida a flora normal, uma inflamação é rapidamente desencadeada (13). Existem um conjunto de evidências que implicam as bactérias comensais na patogénese da DC e estão descritas no Quadro 6. Porque ocorre uma resposta anormal às bactérias comensais normais ainda não está totalmente claro, mas perturbações no seu reconhecimento (por mutações no gene NOD2 e TLR) poderá ser uma das explicações. Concluindo: apesar das importantes funções, as bactérias comensais têm também um importante contributo para a patogénese da DC, embora ainda não totalmente estabelecido Agentes patogénicos específicos Uma das hipóteses etiológicas para o desenvolvimento da DC considera que esta doença é causada por uma infecção persistente por um microorganismo específico. Vários agentes patogénicos tais como Chlamydia trachomatis, Mycobacterium paratuberculosis, CMV, E.Coli, Listeria monocytogenes, Yersinia, Helicobacter, Saccharomyces cerevisiae, Pseudomonas maltophilia, Mycobacterium Kansasii, 47

63 Chlamydia Trachomatis, têm sido apontados como possíveis causas (48). No entanto, ainda existe muita controvérsia nesta relação. Evidências que implicam as bactérias comensais no desenvolvimento da DC (42) Na maioria dos estudos com modelos animais, a inflamação intestinal não se desenvolve na ausência de bactérias comensais As lesões na DC ocorrem principalmente nos segmentos com as mais altas concentrações de bactérias: íleon e cólon Os antigénios bacterianos estimulam respostas das células Th1 e Th17 Na DII existe uma grande concentração de bactérias em contacto com o epitélio intestinal O desvio cirúrgico do trânsito intestinal previne o reaparecimento da DC; a sua restauração induz recorrência Modulação da flora entérica com antibióticos e probióticos atenua a inflamação Quadro 6 - Evidências que implicam as bactérias comensais no desenvolvimento da DC. Adaptado e traduzido de: Sartor RB. Microbial influences in inflammatory bowel diseases. Gastroenterol 2008;134: Mycobacterium avium paratuberculosis O MAP (Figura17) é o agente que mais tem sido alvo de investigações no sentido de se estabelecer alguma relação com a DC. É uma micobactéria atípica, que causa a doença de Johne, uma infecção sistémica e uma inflamação crónica do intestino 48

64 que afecta os ruminantes e outros animais, e que é muito idêntica à DC. Mas os resultados dos vários estudos realizados têm sido controversos. Há quase 90 anos que a comunidade científica ainda discute este problema, não conseguindo chegar a nenhum consenso. Por isso, nos quadros seguintes (Quadros 7 e 8) são apresentados os argumentos a favor e contra esta associação, Figura 17 Mycobacterium avium paratuberculosis. Fonte: reunidos por Sartor RB e adicionando-se outros também relevantes. Embora existam evidências que nos permitem afirmar que o MAP não está implicado na DC, existem outras que não nos permitem excluir com toda a certeza a possibilidade desta associação. Sartor RB considera que, para por fim a todas estas especulações, é essencial o desenvolvimento de estudos cuidadosamente planeados, com técnicas de detecção sensíveis e específicas e postos em prática por investigadores sem ideias pré-concebidas sobre este tema, no sentido de determinar se esta bactéria é a causa da DC em indivíduos geneticamente predispostos ou, se pelo contrário, apenas coloniza a mucosa ulcerada destes doentes, não sendo a responsável pelo desencadear da inflamação (49). Além disso, seria fundamental uma melhor compreensão da relação do MAP com a DC e do benefício da utilização de agentes anti-micobacterianos e apostar em investigações sobre a influência do NOD2/CARD15 na infecção ou na eliminação intracelular do MAP (49). Tendo em consideração que a prevalência da DC tem vindo a aumentar, torna-se pois imperativo resolver este paradigma. 49

65 Argumentos a favor Semelhanças clínicas e patológicas entre a DC e a doença de Johne O ADN da bactéria foi detectada em doentes com DC por métodos de cultura, PCR e FISH. Hemoculturas positivas do MAP em indivíduos com DC. Anticorpos contra proteínas do MAP foram identificados na DC. Identificação da bactéria em amostras de leite materno, leite de vaca pasteurizado e seus derivados Mais de 70% dos indivíduos com DC são portador de pelo menos uma mutação no gene NOD2/CARD15 e estão infectados com o MAP (50). Uma deficiente função do gene permite a aderência e invasão epitelial e resulta numa clearance ineficaz do microorganismo Respostas terapêuticas a uma combinação de fármacos anti-tuberculostáticos que incluem antibióticos macrólidos Quadro 7- Argumentos a favor da associação do MAP com a DC. Tabela adaptada e traduzida de Sartor RB. Does Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis cause Cronh s disease? Gut 2005;54:

66 Argumentos contra Diferenças clínicas e patológicas entre a DC e Doença de Johne Falta de suporte epidemiológico em relação à transmissibilidade da infecção. Proliferação do MAP com a terapêutica anti-tnf-α e corticoterapia e com a infecção concomitante por VIH Ausência de diferenças na serologia entre os pacientes com DC (37,8%), CU (34,7%) e os casos controlo (33,6%) (51) Incapacidade de detecção da membrana celular micobacteriana pela coloração imunohistoquímica Variabilidade na detecção do MAP por PCR 0-100% na DC e CU Ausência de respostas terapêuticas aos antibióticos anti-micobacterianos tradicionais As mutações no gene NOD2/CARD15 estão associadas com uma doença fibro-estenosante e de aparecimento precoce, localizada preferencialmente a nível do íleon. No entanto, o MAP foi detectado pincipalmente a nível do cólon, não se encontrando associado nem com DC mais precoce nem com doença estenosante. Os resultados positivos obtidos em vários estudos que comprovam a associação do MAP com a DC, podem ser devidos à identificação de sequências de outras bactérias, sequências essas que também são encontradas noutros ambientes e micobactérias (52) O MAP pode contaminar os meios de cultura ou as várias sequências de ADN obtidas por PCR. Qiurke P verificou que os seus resultados positivos não eram confirmados quando utilizava métodos que evitavam a contaminação pela bactéria (53). Quadro 8 - Argumentos contra a relação do MAP com a DC. Tabela adaptada e traduzida de Sartor RB. Does Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis cause Cronh s disease? Gut 2005;54:

67 Escherichia coli aderente - invasiva A E.coli (Figura18) é uma bactéria gram-negativa com importantes funções na manutenção da homeostasia intestinal e que raramente causa doença. No entanto, existem algumas estirpes patogénicas que têm a capacidade de desencadear potentes repostas inflamatórias. Vários estudos demonstraram a associação da DC com uma estirpe de E.coli com propriedades invasivas ECAI - LF82 (54;55). Foi identificada em 65% de todas as ressecções do íleon e em 36% das biópsias do íleon terminal em indivíduos com DC (43). Figura 18- E. coli. Fonte: Esta bactéria adere através das pili tipo 1 à CEACAM6 que, na DC, é expressa de forma patológica pelas CEI (52). Após esta adesão, a interacção da flagelina com o TLR5 dos enterócitos, desencadeia a libertação de quimiocinas (IL-8) e a consequente migração de leucócitos. A capacidade invasiva das bactérias permite-lhes ultrapassar a barreira epitelial e multiplicar-se no interior dos macrófagos onde induzem a produção de TNF-α e IFN-γ (Figura19). A acção destas citocinas nos enterócitos, juntamente com a invasão pela bactéria, induz a sobre-expressão da CEACAM6 na superfície da mucosa, o que amplifica a colonização e inflamação (43) (Figura 19). A ECAI está envolvida na formação de granulomas: pensa-se que a bactéria induz a formação de células gigantes multinucleadas através da fusão dos macrófagos e estimula o recrutamento de linfócitos, formando-se agregados de células muito idênticos aos granulomas epitelióides (52). 52

68 INF-γ Figura 19- Mecanismos de lesão da bactéria ECAI nas CEI. (1)- A expressão anormal da CEACAM6 na mucosa do íleon de indivíduos com DC permite (2) que a ECAI possa aderir à mucosa (3) e invadi-la (4). A interacção da flagelina com o TLR5 dos enterócitos, desencadeia a libertação de quimiocinas e a consequente migração de macrófagos. Após a invasão do epitélio, as bactérias multiplicam-se no interior dos macrófagos (5), onde estimulam a produção de TNF-α e IFN-γ (6). Estas citocinas, juntamente com a invasão bacteriana, estimulam a expressão da CEACAM 6 na superfície epitelial. Figura adaptada de: Barnich N, Darfeuille- Michaud A. Role of bactéria in the etiopathogenesis of inflammatory bowel disease. Worlf J Gastroenterol 2007 Nov 14;13(42): Em indivíduos geneticamente predispostos, a bactéria ECAI está altamente associada a uma lesão da mucosa do íleon devido a uma expressão aumentada da CEACAM6 neste segmento (56) A diminuição da produção de defensinas pelas mutações no NOD2, juntamente com o aumento da expressão da CEACAM6, facilitam a colonização das bactérias e o desenvolvimento de processos inflamatórios tão característicos da DC (56) (Figura 20). 53

69 Figura 20 Comparação na expressão da CEACAM6 em indivíduos normais e naqueles com DC. Doentes com aumento da expressão da CEACAM6 e com mutações no NOD2, são aqueles com maior probabilidade de lesão epitelial. Fonte: Barnich N, Darfeuille-Michaud A. Role of bactéria in the etiopathogenesis of inflammatory bowel disease. Worlf J Gastroenterol 2007 Nov 14;13(42): Bactérias psicotrópicas A hipótese da corrente fria considera que a DC resulta do aumento da exposição a microorganismos que sobrevivem a baixas temperaturas bactérias psicotrópicas, de que são exemplo a Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica, Clostridium botulinum e Bacillus cereus (48). A utilização da refrigeração na preparação e armazenamento dos alimentos teve como consequência o aumento da ingestão destes microorganismos. Vários estudos demonstraram a presença da Yersinia enterocolítica ou Yersinia. pseudotuberculosis em doentes com Crohn, embora considerem que mais trabalhos sejam necessários para confirmar esta hipótese (57). A Yersinia enterocolítica estimula a libertação de citocinas inflamatórias, invade as placas de Peyer, estimula a produção de microabcessos e a ulceração do epitélio intestinal (52). Em relação ao envolvimento da Listeria monocytogenes, mais estudos são necessários para confirmar a sua relação com 54