RELATÓRIO FINAL. C) Estudar os efeitos da radiação ionizante em alimentos perecíveis (morangos frescos).

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1 RELATÓRIO FINAL Nome: Telma da Piedade Silva Marques Documento de identificação: Cartão do Cidadão Nº: Morada: Rua Direita, nº 21, Louriceira de Baixo, Arranhó Bolsa: Bolsa de Investigação (Mestre) Início da bolsa: 01 de Julho de 2013 Fim da bolsa: 28 de Fevereiro de 2015 Projecto / Centro de custo: RD RECI/AAG-TEC/0400/2012/ARIAS / CR9310 Unidade: CTN Orientador científico: Sandra Cabo Verde O presente trabalho insere-se no âmbito do projecto RECI/AAG-TEC/0400/2012/ARIAS Aplicações da Radiação Ionizante para um Ambiente Sustentável (ARIAS). ACTIVIDADE CIENTÍFICA OBJECTIVOS Durante o período de bolsa do projecto RECI/AAG-TEC/0400/2012/ARIAS os trabalhos desenvolvidos foram: A) Implementar um Sistema de Gestão de Qualidade no LETAL; B) Recuperação do Acelerador Linear de Electrões (Linac) e monitorizar as condições ambientais e funcionais da Instalação de Radiações Ionizantes (IRIS); e C) Estudar os efeitos da radiação ionizante em alimentos perecíveis (morangos frescos). Os trabalhos foram realizados no Campus Tecnológico e Nuclear do Instituto Superior Técnico, sob a orientação da Investigadora Auxiliar Doutora Sandra Cabo Verde.

2 APRESENTAÇÃO E DISCUSSÃO DE RESULTADOS A. Sistema de Gestão de Qualidade (SGQ) Laboratório de Ensaios Tecnológicos em Áreas Limpas (LETAL) A implementação do SGQ no LETAL visa preparar a Acreditação deste laboratório multidisciplinar, numa perspectiva de melhoria contínua dos serviços prestados, fortalecendo a confiança dos clientes actuais (e futuros) nos ensaios realizados e potenciando a prestação de serviços. Para alcançar este objectivo foram elaborados novos procedimentos, impressos e regras de limpeza para as salas do LETAL, com base na política de Gestão de Qualidade do campus. Todos os documentos elaborados no âmbito da Acreditação foram revistos e corrigidos pelo responsável pela Gestão da Qualidade do Pólo de Loures (Doutora Irene Lopes) e colocados numa pasta online (\\itn.pt\storage\my\letal_qualidade) de acesso restrito e controlado. Foram elaborados no total 94 documentos para a Qualidade, entre eles constam instruções de trabalho, impressos, planos de calibração/manutenção e pastas com os certificados das intervenções efectuadas, inquéritos de satisfação (português e inglês), folha de cálculo para avaliação dos inquéritos de satisfação e registos de qualidade. B. Instalação de Radiações IonizanteS (IRIS) Os trabalhos desenvolvidos na IRIS tiveram como principal objectivo auxiliar a equipa responsável pela manutenção e operação do Acelerador Linear de Electrões (Linac). Trata-se de um equipamento muito complexo e sensível que tem requerido repetidas intervenções para o seu correcto funcionamento, durante todo o período da bolsa. Participei, nomeadamente, nas seguintes operações: limpeza de todos os componentes electrónicos e áreas adjacentes do Linac; regeneração da bomba iónica; regeneração do sistema de focagem de feixe; instalação da bending chamber com a janela de saída de feixe reparada; recolocação da blindagem da cabeça do Linac; manutenção curativa dos sistemas de refrigeração primária e secundário, e inicío dos testes de diagnóstico. Fui responsável pelo controlo e monitorização da temperatura e humidade relativa (HR) na área circundante do LINAC e sua blindagem pois estes parâmetros são fundamentais para o funcionamento de aceleradores de electrões. Segundo pesquisa bibliográfica, os limites estabelecidos para estes parâmetros são C (temperatura da sala) e entre 40 a 60 % de HR circundante. Após alguns melhoramentos na instalação de proteçção da área circundante do acelerador, o controlo destes parâmetros para níveis

3 aceitáveis/recomendados ficou simplificado. Consequentemente, o processo de degradação dos equipamentos e componentes existentes ficou controlado/retardado, ajudando na manutenção, recuperação dofuncionamento do Linac. C. Efeito da radiação ionizante em alimentos perecíveis Morangos frescos Os estudos de irradiação de alimentos perecíveis visaram a sua exposição a várias doses de radiação gama, de modo a obter um produto final seguro do ponto de vista microbiológico, sem prejuízo das propriedades sensoriais, organolépticas e conteúdo em compostos fenólicos. Descontaminação e conservação Os ensaios efectuados para a descontaminação e conservação de alimentos frescos tem como principal objectivo estimar a inactivação da população microbiana presente antes (0 kgy contaminação inicial) e após o tratamento a várias doses (0,5; 1,5 e 3,0 kgy) de radiação gama (fonte de cobalto-60). Após os estudos de inactivação, a população microbiana resistente à irradiação foi caracterizada quantitativamente (unidades formadoras de colónias UFC) e qualitativamente (tipificação fenotípica). Os procedimentos de análise, desde a preparação das amostras até à caracterização fenotípica, encontram-se representados esquematicamente na Figura 1. Figura 1 Esquema representativo do procedimento de análise da população microbiana presente em morangos frescos antes e após irradiação gama.

4 Log UFC/g morango Neste trabalho experimental foi ainda estudada a inactivação da população microbiana ao longo do tempo (t = 0 dias e t = 5 dias após a irradiação) a temperaturas de refrigeração, de modo a avaliar o potencial extensão do tempo de prateleira de morangos frescos. De uma forma generalizada, assume-se que a inactivação microbiana por um agente letal segue uma cinética exponencial. Especificando para a radiação ionizante, esta cinética caracteriza-se por um decréscimo exponencial do número de sobreviventes em função da dose absorvida. O logaritmo do número estimado de sobreviventes da população microbiana de morangos frescos em função da dose absorvida encontra-se representado na Figura 2. Segundo os resultados obtidos, a microbiota das amostras analisadas segue uma cinética de inactivação exponencial observando-se um decréscimo de aproximadamente 88% da população microbiana após irradiação a 1,77 kgy. Para a microbiota das amostras armazenadas a 4 C durante 5 dias verificou-se uma cinética de inactivação sigmoidal e um decréscimo de 89% para a dose de 1,77 kgy. A eficiência do tratamento para a dose mais elevada (3,72 kgy) foi de 97% logo após irradiação, e de 96% cinco dias após a irradiação. 6,0 Curva de Sobrevivência 5,0 4,0 3,0 y = -0,4317x + 4,2871 R² = 0,9754 2,0 1,0 0,0 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 Dose (kgy) Figura 2 Curva de sobrevivência para a população microbiana dos morangos logo após a irradiação (t = 0 dias) (15<n<18; α = 0,05). Com o objectivo de verificar se a tendência de inactivação se mantinha ao longo do tempo (reprodutibilidade), estes ensaios foram repetidos em Nas Figuras 3 e 4 encontram-se representados o logaritmo do número

5 Log (UFC/g morango) Log (UFC/g morango) de sobreviventes para t=0 dias e para t=5 dias após a irradiação, respectivamente. Com o objectivo de simplificar a representação gráfica da população sobrevivente, admitiu-se que as doses para ambos os anos estudados eram iguais às doses teóricas (0,5; 1,5 e 3,0 kgy). As doses absorvidas reais em 2014 foram 0,75; 1,61 e 2,61 kgy. 6,00 Sobreviventes t=0 4,00 2,00 0,00 0,0 0,5 1,5 3,0 Dose (kgy) Figura 3 Comparação da população microbiana sobrevivente após irradiação (t=0 dias) com várias doses (9<n<24; α = 0,05). 6,00 Sobreviventes t=5 4,00 2,00 0,00 0,0 0,5 1,5 3,0 Dose (kgy) Figura 4 Comparação da população microbiana sobrevivente 5 dias após irradiação (t=5 dias) com várias doses (16<n<23; α = 0,05). Pela observação das Figuras 3 e 4 verificou-se que a cinética de inactivação exponencial mantem-se para os dois anos amostrados, sendo que em 2014 a eficiência do tratamento para a dose mais elevada (2,61 kgy) foi de 96% para o tempo zero dias e de 93% para a análise cinco dias após a irradiação. Os resultados obtidos apontam para um ligeiro aumento da contaminação microbiana em 2014, para ambos os tempos analisados,

6 no entanto estas diferenças não são significativas visto que se encontram dentro do intervalo de confiança de cada conjunto de resultados. O aumento da população microbiana presente em 2014 poderá estar relacionado com factores intrínsecos da própria amostra (e.g. maior actividade da água; elevado teor em nutrientes) ou com factores extrínsecos (e.g. maior distância temporal entre a colheita e a amostragem; temperaturas de transporte e/ou armazenamento dos retalhistas inadequadas). A frequência relativa obtida para dos isolados microbianos antes da irradiação (n 2013=5089 e n 2014=6772) encontra-se apresentada na Tabela 1. Tabela 1 Tipos morfológicos com maior frequência relativa nos ensaios de contaminação inicial (0 kgy) dos morangos em 2013 e Tipos morfológicos Cocos, gram +, catalase + 53% 1% Leveduras 37% 49% Fungos filamentosos 2% 49% Como podemos verificar pelos resultados obtidos, o tipo morfológico que apresenta valores menos discrepantes para ambos os anos são as leveduras. Estes microrganismos estão descritos como flora natural de morangos frescos. Por outro lado, os tipos morfológicos cocos, gram+, catálase+ e fungos filamentosos têm frequências assimétricas, isto é, quando apresenta um valor elevado o outro tem um valor insignificante. Esta observação poderá estar relacionada com diversos factores, tais como a variedade dos morangos, a sua proveniência, as condições de cultivo e o estado de maturação, que exercem grande influência na microbiota natural dos morangos. A caracterização qualitativa (tipificação fenotípica) dos isolados microbianos logo após a irradiação aponta para uma maior sobrevivência à dose mais elevada ( 3 kgy) de dois tipos morfológicos, nomeadamente as leveduras ( 67% em 2013 e 28% em 2014) e de fungos filamentosos ( 33% em 2013 e 71% em 2014) (Figura 5 e 6).

7 Dose absorvida (kgy) Dose absorvida (kgy) 3,0 kgy 1,5 kgy 0,5 kgy 0 kgy 0% 20% 40% 60% 80% 100% Frequência relativa (%) Cocos, gram +, catalase + Cocos, gram +, catalase - Cocos, gram -, catalase + Cocos, gram -, catalase - Bacilos, gram +, endósporos + Bacilos, gram +, endósporos -, catalase + Bacilos, gram +, endósporos -, catalase - Bacilos, gram -, oxidase + Bacilos, gram -, oxidase - Leveduras Fungos filamentosos Figura 5 Frequência relativa dos tipos morfológicos isolados em 2013 para cada dose absorvida (n= 5089). 3,0 kgy 1,5 kgy 0,5 kgy 0 kgy 0% 20% 40% 60% 80% 100% Frequência relativa (%) Cocos, gram +, catalase + Cocos, gram +, catalase - Cocos, gram -, catalase + Cocos, gram -, catalase - Bacilos, gram +, endósporos + Bacilos, gram +, endósporos -, catalase + Bacilos, gram +, endósporos -, catalase - Bacilos, gram -, oxidase + Bacilos, gram -, oxidase - Leveduras Fungos filamentosos Figura 6 Frequência relativa dos tipos morfológicos isolados em 2014 para cada dose absorvida (n= 6772).

8 Os resultados obtidos estão de acordo com o documentado na literatura, visto que os fungos (filamentosos e leveduras) são o tipo de microrganismo com maior prevalência neste tipo de alimentos, e são descritos como radioresistentes. Tal como foi referido anteriormente, a microbiota natural dos morangos depende da variedade, condições de cultura, estado de maturação, logo a microbiota sobrevivente também poderá ser influenciada por isso. Em suma, os ensaios realizados em 2013 e em 2014 apontam para a eficácia da descontaminação microbiana dos morangos frescos por radiação gama. Assim, e quando comparado com os métodos de descontaminação frequentemente utilizados, a aplicação da radiação gama conduz a uma mais-valia relativamente ao tempo de prateleira de produtos perecíveis, sem evidente prejuízo das suas características sensoriais. Segundo a Food and Drug Administration e o Bureau of Foods Irradiated Food Committee mais de 90% dos compostos radiolíticos presentes em alimentos irradiados não são significativamente diferentes dos detectados em alimentos submetidos a tratamentos convencionais (e.g. aquecimento, secagem, congelamento). A aplicação das tecnologias de radiação ionizante como uma ferramenta de segurança alimentar poderá impulsionar a variedade, disponibilidade e aceitabilidade de alimentos para doentes imunodeprimidos, bem como para outros grupos com necessidades dietéticas especiais, visto que existem actualmente várias limitações no acesso e disponibilidade de alimentos adequados. Actividade antioxidante Em sistemas biológicos, um antioxidante é uma substância com capacidade de reduzir eficazmente um prooxidante, com formação simultânea de produtos com baixo ou nenhum nível de toxicidade (Magalhães, et. al 2008). A oxidação nos sistemas biológicos ocorre devido à acção dos radicais livres no organismo, que são espécies químicas com um electrão desemparelhado, o que lhes confere grande afinidade electrónica e, portanto, grande reactividade. A formação de radicais livres pode dever-se a processos endógenos processos bioquímicos associados ao metabolismo; ou a processos exógenos reacções metabólicas provocadas pela exposição a agentes externos ao organismo (Soares, 2002). Muitos alimentos que fazem parte da dieta quotidiana são ricos em antioxidantes que promovem a prevenção e/ou redução das lesões causadas pelos radicais livres nas células. Os antioxidantes podem ter acção directa na neutralização das acções dos radicais livres ou participar indirectamente nos sistemas enzimáticos com essa função (Moreira & Mancini-Filho, 2004).

9 EAG (mm) Os ensaios efectuados para a avaliar a actividade antioxidante de alimentos frescos têm como principal objectivo estimar os efeitos da radiação gama (fonte de cobalto-60) no conteúdo em compostos fenólicos presentes antes (0 kgy referência) e após o tratamento às doses 0,5; 1,5 e 3,0 kgy. O estudo da capacidade antioxidante foi efectuado utilizando dois solventes (acetona e metanol) para a extracção dos compostos fenólicos e três metodologias: 1) conteúdo em compostos fenólicos totais método Folin-Ciocalteu; 2) capacidade antioxidante de redução férrica método de FRAP; e 3) reacção de sequestração do radical DPPH. Estes ensaios foram efectuados apenas para o tempo de zero dias após a irradiação. 1) Compostos Fenólicos Totais A determinação dos compostos fenólicos totais foi realizada segundo o método colorimétrico de Folin- Ciocalteu (Waterhouse, 2002), que se baseia na redução dos ácidos fosfomolíbdico e fosfotúngstico pelos compostos fenólicos presentes na amostra, produzindo um complexo de coloração azul. Assim as substâncias redutoras podem ser quantificadas e são expressas em equivalentes de ácido gálico (EAG mm). Este método de Folin-Ciocalteu não é específico porque espécies redutoras presentes podem interferir com os resultados obtidos. Os ensaios de quantificação do conteúdo em compostos fenólicos nos morangos frescos foram realizados com dois solventes orgânicos - acetona e metanol (Figura 7), com o objectivo de verificar qual dos extractos seria mais indicado para esta análise. 10,00 Fenólicos Totais 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 Acetona Dose (kgy) Metanol Figura 7 Conteúdo em fenólicos totais para os diferentes extractos (2014, t=0dias; n=3; α=0,05). Os resultados obtidos sugerem que, para as amostras não irradiadas, a extracção dos compostos fenólicos totais com acetona (8,16 EAG mm) foi mais eficiente que com o metanol (4,55 EAG mm). Verificamos ainda

10 Actividade antioxidante (mm FeSO 4.7H 2 O) que com o aumento da dose absorvida, a diferença observada entre os solventes para as amostras não irradiadas é cada vez menos evidente e para a dose mais alta ( 3kGy) a quantidade de compostos fenólicos totais extraídos dos morangos é muito semelhante. Este comportamento poderá estar relacionado com uma maior afinidade dos fenólicos com a acetona, facilitando a sua extracção de uma forma geral, bem como com os efeitos da radiação gama em estruturas fenólicas mais complexas, ou seja, à medida que aumentamos a dose absorvida podem ocorrer mais quebras nos compostos mais complexos levando à sua degradação ou originando compostos mais simples que têm menor afinidade com a acetona. A relação dos extractos metanólicos com a dose absorvida sugere que a radiação gama não afecta significativamente o conteúdo em compostos fenólicos totais. 2) Capacidade Antioxidante de Redução Férrica O método FRAP (Benzie & Strain, 1996) baseia-se na capacidade dos compostos antioxidantes reduzirem o complexo férrico-tripiridiltriazina (Fe 3+ TPTZ) à forma ferroso-tripiridiltriazina (Fe 2+ TPTZ) em meio ácido (ph 3,6). O complexo reduzido apresenta uma cor azul intensa (azul da Prússia), cuja intensidade é medida espectrofotometricamente, e que está relacionada com a concentração de espécies antioxidantes redutoras presentes na solução, sendo os resultados expressos em actividade antioxidante do sulfato ferroso (mm FeSO 4.7H 2O) (Figura 8). As limitações do método FRAP são a especificidade do mecanismo de reacção e a existência de compostos na amostra que interferem com a medição (absorverem no mesmo comprimento de onda). 20,00 FRAP 15,00 10,00 5,00 0,00 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 Dose (kgy) Acetona Metanol Figura 8 Actividade oxidante para os diferentes extractos (2014, t=0dias; n=3; α=0,05).

11 Tal como observámos para a quantificação dos compostos fenólicos, na actividade antioxidante determinada pelo método de FRAP o extracto que apresenta valores mais elevados foi o efectuado com acetona. Os resultados obtidos com o extracto metanólico ao longo das várias doses estudadas apresentam valores muito semelhantes, sugerindo que o metanol não é o solvente mais indicado para esta determinação. 3) Reacção de Sequestração do Radical DPPH O método DPPH é colorimétrico baseado na determinação da capacidade antiradicalar de um composto face ao radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) (Brand-Williams, Cuvelier, & Berset, 1995). Por acção de um composto antioxidante, o radical DPPH é reduzido passando à sua forma estável DPPH-H (difenil-1-picrilhidrazina). Esta reacção é monitorizada espectrofotometricamente pela alteração da cor violeta (DPPH) para amarelo (DPPH-H) até ser atingido um patamar. A quantificação da actividade antioxidante foi efectuada através da percentagem de inibição (sequestração) do radical DPPH (com concentração conhecida) por comparação com um branco, para ambos os extractos (Figura 10), até ser atingido um patamar. Figura 9 Percentagem de inibição do radical DPPH para os extractos de acetona e metanol (2014, t=0dias; n=3; α=0,05). Os resultados obtidos sugerem que não existem diferenças significativas entre os dois extractos efectuados e a percentagem de inibição do radical DPPH. Pela observação da Figura 9 verificamos que para este ensaio e para as doses em estudo, o comportamento é muito semelhante. As determinações efectuadas por três metodologias diferentes e com dois solventes de extracção sugerem que a radiação gama tem efeitos mais visíveis para nas reacções de Folin-Ciocalteu e de FRAP

12 comparativamente com a reacção do radical DPPH. Esta observação poderá estar relacionada com efeitos secundários da radiação, isto é, quebra de grandes moléculas e/ou radiólise da água dos morangos, que vão originar electrões livres que podem para actuar como espécies redutoras. A acetona parece ser o solvente mais indicado para os ensaios efectuados.

13 OUTRAS ACTIVIDADES 1. Arguente das provas destinadas à obtenção do grau de Mestre em Gestão Integrada da Qualidade, Ambiente e Segurança da aluna Carolina de Moura e Sá. Exposição profissional a citóstáticos - Definição de pontos críticos para o estudo da contaminação de superfícies num Hospital de Dia. Instituto Superior de Educação e Ciência Universitas. Lisboa, 25 Julho D. Darčanova, A. Beganskienė, T. Silva, J. Lancastre, P. Santos. Sterilisation of Inked Paper using Gamma-Irradiation. 11th International Conference of Lithuania's Chemists - Analytical, Environmental, Inorganic Chemistry and Materials Science. Vilnius, 27 Setembro, Poster. 3. Membro da Comissão Científica e da Comissão de Organização do Regional Training Course on Microbiological Aspects of Sterilization Validation Process. IAEA TC Project RER/1/011 - Introducing and Harmonizing Standardized Procedures for Radiation Technologies. Bobadela Portugal, 2-6 Dezembro Aula de Sistemas de Gestão da Qualidade Fundamentos teóricos de HACCP e caso prático. Mestrado em Microbiologia Aplicada. Faculdade de Ciências Universidade de Lisboa, 30 Maio, Assistente convidada. 5. T. Silva, R. Melo, S. Cabo Verde, F.M.A. Margaça. Effects of ionizing radiation on agro-industrial wastewater. International Congress on Water, Waste and Energy Management July Porto, Portugal. Poster. 6. Formação em Protecção e Segurança Radiológica, no âmbito do WP4 Education and Training in Radioprotection do projecto Aplicações da Radiação Ionizante para um Ambiente Sustentável (ARIAS) Outubro Classificação final: 18,5 valores. 7. D. Guerreiro, T. Silva, M. Meneses, J. Madureira, R. Melo, S. Cabo Verde, F. M. A. Margaça. Gamma Radiation Effects on Microbial Inactivation and Antioxidant Activity of Cherry Tomatoes. International Symposium on Food Safety and Quality: Applications of Nuclear and Related Techniques - IAEA CN Novembro Viena, Áustria. Poster. 8. Participação no projecto "Radiation treatment of wastewater for reuse with particular focus on wastewaters containing organic pollutants" (IAEA - CRP F23029) ( ). (Telma da Piedade Silva Marques)