Métodos diagnósticos das doenças fúngicas pulmonares: aplicabilidade para o clínico. Profa. Dra. Rosemeri Maurici

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1 Métodos diagnósticos das doenças fúngicas pulmonares: aplicabilidade para o clínico Profa. Dra. Rosemeri Maurici

2 espécies de fungos Fungos dimórficos endêmicos Paracoccidioides brasiliensis Histoplasma capsulatum Blastomyces dermatitidis Coccidioides immitis Fungos leveduriformes Cryptococcus sp. Fungos filamentosos 300 espécies associadas à infecção respiratória Aspergillus sp.

3 Key Points Não há pesquisa sistemática por infecções fúngicas: qual o verdadeiro impacto? Viagens e mudanças climáticas modificações na distribuição geográfica exposição não limitada a áreas endêmicas Longevidade e condições crônicas algum grau de imunossupressão é parte do novo processo de envelhecimento Infect Dis Clin N Am 2016

4 Key Points Doenças fúngicas são difíceis de diagnosticar sintomas inespecíficos e não suspeitadas Diagnóstico requer amostras invasivas de tecidos Fungos nem sempre crescem em meios de cultura A identificação histopatológica é desafiadora Testes para anticorpos podem ter reação cruzada Testes cutâneos para infecções latentes não são disponíveis para uso rotineiro Infect Dis Clin N Am 2016

5 Key Points Amostras teciduais desafiador em trombocitopenia, desordens de coagulação ou insuficiência respiratória Doenças fúngicas pulmonares podem ocorrer em pacientes imunocomprometidos e imunocompetentes Infect Dis Clin N Am 2016

6 HIV/Aids Idosos Aumento do número de casos Receptores de transplantes Prematuros Aumento de susceptíveis? Uso de Imunomoduladores Neoplasias

7 HIV/Aids Idosos Aumento do número de casos Receptores de transplantes Prematuros Melhora no diagnóstico? Uso de Imunomoduladores Neoplasias

8 Doenças fúngicas tornaram-se muito Doenças importantes fúngicas tornaram-se na prática muito importantes na prática clínica diária clínica diária

9 Primeiro Método Diagnóstico Suspeita Clínica

10 When to consider the possibility of a fungal infection: an overview of clinical diagnosis and laboratory approaches Clin Chest Med 2017 Viagem ou exposição a regiões endêmicas. Infiltrados pulmonares que não se resolvem e febre a despeito de antibioticoterapia. Anormalidades de pele, SNC, genitourinário ou ósseas associadas. Neutropenia, malignidade hematológica, quimioterapia ou transplante. Estado emergente de imunocomprometimento (corticoesteróide, cirrose hepática, falência renal, DPOC ou DM).

11 Imunossupressão como Fator de Risco Alteração de Linfócitos T Neutropenia Blastomyces Coccidioides Cryptococcus Histoplasma Pneumocystis Aspergillus Fusarium Scedosporium Trichosporon Zigomicetos

12 Desafios no diagnóstico Não é fácil definir o significado de culturas positivas de sítios não estéreis A interpretação deve ser feita no contexto de fatores de risco, quadro clínico e achados de imagem Diagnóstico Presuntivo O uso de antifúngicos diminui o rendimento das culturas Orienta o sítio da amostra e os testes auxiliares no diagnóstico

13 DiagnósticoLaboratorial

14 Exame Micológico Processamento das Amostras Salina ou água destilada estéreis Formol Exame Histopatológico

15 Armazenamento Enviar imediatamente ao laboratório (para evitar a proliferação de outros organismos) se não for possível manter refrigerado a 4 graus Líquor manter em temperatura ambiente Material que teve contato com mucosa processar em 2 horas (escarro) Refrigeração no máximo 24 horas lembrando que retarda o crescimento fúngico

16 Processamento Usar a porção purulenta ou grumosa da amostra melhora o rendimento Separar a amostra em duas alíquotas: Microscopia KOH Cultura

17 Técnicas Diagnósticas Forma Direta Pesquisa do agente Elementos fúngicos Reação Imunológica Forma Indireta Busca da resposta do hospedeiro ao agente

18 Diagnóstico direto pesquisa do agente Exame micológico Exame direto Cultivo Detecção de antígenos Prova do látex Galactomanana (1,3)β-D-Glucan Detecção de DNA fúngico Reação em cadeia da polimerase Exame histopatológico Grocott, mucicarmin de Mayer, Fontana-Masson Diagnóstico indireto pesquisa da resposta do hospedeiro Exames de imagem Raio-X, Tomografia computadorizada Pesquisa de reação imunológica Testes intradérmicos Imunodifusão ELISA Para garantir melhor rendimento diagnóstico, múltiplos testes são frequentemente usados simultaneamente Adaptado JPB 2009

19 Exame Micológico Direto Consiste em avaliar a amostra clínica microscopicamente entre lâmina e lamínula, utilizando reagentes e/ou corantes para a visualização das estruturas fúngicas. Pode ser conclusivo em algumas situações: pneumocistose, paracoccidioidomicose, criptococose e bola fúngica aspergilar. Na maioria das vezes não é suficiente.

20 Material Quantidade Reagentes/Corantes Lavado broncoalveolar ml Prata e calcoflúor Escarro 5-10 ml N-acetilcisteína ou hidróxido de sódio ou sputumlysin, calcoflúor Sangue (heparinizado) ml Prata, Giemsa, calcoflúor Líquor 3-5 ml Nigrosina, calcoflúor Pus e exsudatos 3-5 ml Hidróxido de potássio, prata, Kinyoun, Gram Tecido 1-5 mm Prata, hidróxido de potássio (acrescido de tinta Parker) Medula óssea 0,2 ml Prata, hidróxido de potássio (acrescido de tinta Parker) Urina ml Direto, calcoflúor J Bras Pneumol. 2009;35(9):

21 Cultura Resultado demorado (?) A maioria dos fungos que causam doenças humanas pode ser isolada em até 7 dias (fungos leveduriformes e filamentosos) Fungos dimórficos necessitam de um tempo maior de incubação (duas/três semanas) para o aparecimento de estruturas características

22 Exame Histopatológico Diagnóstico direto pesquisa do agente (coloração de Grocott) Auxílio no diagnóstico indireto avaliação da reação tecidual (HE) é inespecífica não sendo suficiente para diagnosticar etiologicamente Histopatologia com demonstração do agente nos tecidos é fundamental para o diagnóstico de micoses oportunísticas, confirmando que o fungo isolado no cultivo não corresponde a um contaminante.

23 Aspergilose Micose Tropismo tecidual Reação Forma Parasitária Paracoccidioidomicose Histoplasmose Zigomicose Pulmões, seios paranasais, vasos sanguíneos Pulmões, adrenal, transição mucocutânea, músculo estriado, tecido linfoide Pulmões, baço, linfonodos, fígado, medula óssea, pele Pulmões, seios paranasais, vasos sanguíneos, tecido subcutâneo, TGI Supurativa Mista piogênica e granulomatosa, hiperplasia pseudoepiteliomatosa, granuloma sarcoide Histiocítica, granuloma com necrose caseosa, granuloma sarcóide, granuloma com calcificação Artrite trombótica, granuloma sarcóide Hifas hialinas septadas com ramificação a 45 graus Elemento leveduriforme esférico multibrotante (15 a 30 µm) Elemento leveduriforme pequeno unibrotante (2-5 µm) Hifas hialinas raramente septadas, de 5 a 20 µm de diâmetro com ramificação de 90 graus Criptococose SNC, pulmões Sem reação, granuloma sarcóide Levedura frequentemente encapsulada (4-6 µm) Pneumocistose Pulmões Granuloma sem necrose caseosa com células gigantes dispersas, granuloma com calcificação central, exsudato alveolar espumoso, espessamento intersticial por edema e infiltrado mononuclear Elementos fúngicos apresentam-se como ascos contendo ascósporos J Bras Pneumol. 2009;35(9):

24 DiagnósticoLaboratorial Detecção de Antígenos

25 Prova do Látex Para antígenos capsulares do Cryptococcus sp. S 95% e E 98% Soro, líquor, urina e LBA são úteis para realização desse teste A prova consiste em homogeneizar a amostra clínica do paciente com uma partícula inerte (látex) sensibilizada com anticorpo antiantígeno capsular de Cryptococcus sp. Resultados falso-negativos: Cryptococcus sp. deficiente de cápsula ou excesso de antígeno na amostra (efeito pró-zona).

26 Galactomanana Componente da parece celular do Aspergillus sp. Falso negativos tratamento com anti-fúngico. Resultados falso-positivos: piperacilinatazobactam e amoxacilina-clavulanato, histoplasmose ou blastomicose. GM sérica serve como índice prognóstico com redução demonstrando melhores desfechos. GM é detectada uma semana antes do início das manifestações clínicas de aspergilose invasiva. Análise seriada pode antecipar o diagnóstico em 6 a 14 dias em pacientes neutropênicos resultados positivos em duas amostras consecutivas confirma o diagnóstico.

27 Galactomanana para o diagnóstico de Aspergilose Pulmonar Crônica LBA / Ponto de Corte 0,4: Sensibilidade 77,2 Especificidade 77,0 Sangue / Ponto de Corte 0,7: Sensibilidade 66,7 Especificidade 63,5 GM no LBA deve ser usada para diagnóstico de CPA Chronic pulmonary aspergillosis: rationale and clinical guidelines for diagnosis and management. Eur Respir J 2016

28 (1,3)β-D-Glucan (1,3)-β-D-Glucan não é específico para Aspergillus Útil como screening sensibilidade de 100% e especificidade de 80% BG tem VPN para excluir infecção fúngica

29 Como GM e (1,3)Beta-D-Glucan deveriam ser usados para o diagnóstico de Aspergilose? GM é recomendado para o diagnóstico de IA quando usado em certas subpopulações de pacientes (malignidades hematológicas, transplante de células hematopoiéticas) (Forte recomendação/evidência de alta qualidade)

30 Como GM e (1,3)Beta-D-Glucan deveriam ser usados para o diagnóstico de Aspergilose? GM não é recomendada para screening de rotina no sangue em pacientes recebendo tratamento ou profilaxia anti-fúngica, mas pode ser usado em amostras broncoscópicas (Forte recomendação/evidência de alta qualidade)

31 Como GM e (1,3)Beta-D-Glucan deveriam ser usados para o diagnóstico de Aspergilose? GM não é recomendado para screening em receptores de transplante de órgãos sólidos ou pacientes com doença granulomatosa crônica (Forte recomendação/evidência de alta qualidade)

32 Como GM e (1,3)Beta-D-Glucan deveriam ser usados para o diagnóstico de Aspergilose? Uma vez feito o diagnóstico, GM sérica pode ser usada para monitorar resposta terapêutica Redução de GM após 2 semanas de tratamento antifúngico em pacientes com resposta clínica concordante demonstra melhor sobrevida Falha em reduzir GM com o tratamento = avaliar adequabilidade da escolha do antifúngico.

33 Como GM e (1,3)Beta-D-Glucan deveriam ser usados para o diagnóstico de Aspergilose? Testes séricos para (1,3)Beta-D-Glucan é recomendado para diagnóstico de IA em pacientes de alto risco (malignidades hematológicas, transplante de células hematopoiéticas), mas não são específicos para Aspergillus (Forte recomendação/evidência de moderada qualidade).

34 Invasive Aspergillosis: current strategies for diagnosis and management Sugestão de combinação de GM e Reação em Cadeia da Polimerase (PCR): Amostras de sangue GM tem > E que PCR LBA PCR tem > S que GM GM + PCR = sensibilidade de 98% Inf Dis Clin North Am 2016

35 Testes chave em amostras respiratórias para pacientes com infiltrado cavitário ou nodular em pacientes imunocompetentes Teste Força da Recomendação Qualidade da Evidência Microscopia direta para hifas (positiva é um forte indicador de infecção) A II Cultura para fungo (escarro ou LBA) A III Histologia A II Cultura para fungos (aspiração transtorácica) B II PCR para Aspergillus (secreção respiratória) C II

36 Contribuição do antígeno para o diagnóstico de CPA População Intenção Intervenção Força de Recomendação Infiltrado pulmonar cavitário ou nodular em pacientes imunocompetentes Diagnóstico de exclusão de CPA Qualidade da Evidência Comentários Antígeno no LBA B II Antígeno foi avaliado no LBA Antígeno (sérico) C II e sérico, mas não no escarro Antígeno (escarro) Sem dados Sem dados

37 Diagnóstico por anticorpos da CPA População Intenção Intervenção Força da Recomendação Qualidade da Evidência Comentários Infiltrado pulmonar cavitário ou nodular em pacientes imunocompetentes Diagnóstico de exclusão de CPA Anticorpos IgG para Aspergillus Precipitinas para Aspergillus A II Padronização incompleta do teste de precipitinas e IgG A II A maioria dos testes são in-house e pobremente validados Anticorpos IgM para Aspergillus D III Poucos dados Anticorpos IgA para Aspergillus D III Intervenção no contexto de asma, ABPA ou pacientes com FC Anticorpos IgE para Aspergillus B II Frequentemente detectável em CCPA independente da condição de base, com um aumento da IgE total

38 DiagnósticoLaboratorial Testes Sorológicos

39 Testes Sorológicos Maior limitação dos testes sorológicos é imunossupressão humoral (receptores de transplante que recebem inibidores do ciclo celular) Paracoccidioidomicose (imunodifusão) S e E 95%

40 Imunodifusão Formação de imunocomplexos que precipitam, formando uma linha visível macroscopicamente (soro, LCR, urina). Utilizado para a pesquisa de anticorpos nas micoses causadas por H. capsulatum, P. brasiliensis e Aspergillus sp. Resultados falso-negativos imunossuprimidos. J Bras Pneumol. 2009;35(9):

41 Imunodifusão A imunodifusão para o diagnóstico de histoplasmose resulta em duas linhas de precipitação conhecidas como bandas H e M. A banda H é diagnóstica de doença e é detectada em 10-25% das amostras positivas. A banda M não distingue infecção prévia de infecção ativa e é encontrada em mais de 75-85% das amostras positivas.

42 Fixação do Complemento Baseada na via clássica de ativação do complemento. Soro do paciente é aquecido para inativar os fatores inatos do complemento e depois misturado e incubado com antígeno do agente infeccioso de interesse. Componentes do complemento de porquinho da índia são adicionados e incubados. Na presença de Acs específicos será formado um complexo e inativará o complemento. Hemácias de carneiro sensibilizadas com hemolisina são adicionadas. Se não houver hemólise há anticorpos específicos.

43 DiagnósticoLaboratorial Técnicas Moleculares

44 Reação em Cadeia da Polimerase Amplificação enzimática de regiões de DNA in vitro. Primers reconhecem e hibridizam de modo específico com sequências-alvo de DNA (gene 18S ribossomal) as moléculas são copiadas multiplicadas de modo exponencial. O produto final é analisado por eletroforese em um gel de agarose. Esse produto final pode ser utilizado no sequenciamento genômico.

45 MALDI-TOF mass spectrometry Semiautomatizado para identificação de isolados bacterianos. A colônia é desnaturada com laser e libera proteínas e estas são aceleradas com eletricidade e o tempo de deslocamento é avaliado. Isto é comparado com uma base de dados por software gênero e espécie.

46 Combinação ideal para o diagnóstico de uma infecção fúngica pulmonar 1. Evidência clínica e alteração radiológica 2. Isolamento e identificação fúngica compatíveis 3. Demonstração de elementos fúngicos invadindo o tecido 4. Semelhança micromorfológica do fungo isolado às características observadas no histopatológico ou no exame direto 5. Resposta imunológica ao fungo identificado 6. Exame Histopatológico

47 Key Points Técnicas sorológicas em adição aos métodos de detecção de antígenos, continuam a ser usados rotineiramente para o diagnóstico de infecções fúngicas Novas técnicas tem sido desenvolvidas com boa performance Identificação do fungo de isolados de cultura por métodos moleculares podem ser utilizados

48 Key Points Valorizar o isolamento de um fungo procedente de: Amostra que mostrou resultado positivo ao exame microscópico Fluidos corporais estéreis, biópsias ou peças operatórias, urina de sondagem ou cistoscopia Imunossuprimidos Paciente em uso de antibióticos por longo tempo, em UTI, sob VM, cateterismo ou outra manipulação Paciente de hemodiálise ou debilitado com algum sintoma ou sinal de doença infecciosa independente do tipo de amostra clínica

49 Key Points Têm importância as culturas de fungos: Dimórficos Isolados mais de uma vez, do mesmo tipo de amostra coletada em dias diferentes Isolados de ponta de cateter (alimentação parenteral, infusões venosas)

50 Nenhum teste imunológico é superior ao isolamento do fungo ou à sua identificação DiagnósticoLaboratorial física de espécimes ou pela histologia Zoilo Pires de Camargo

51 Lembrar que os fungos não trazem somente coisas boas...

52 Obrigada.