Estudo de QSAR aplicado a inibidores de PLK-2 (Polo-Like Kinase- 2) candidatos a antiparkinsonianos. Jéssica Tiemi Fukushima Kimura

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1 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Curso de Graduação em Farmácia-Bioquímica Estudo de QSAR aplicado a inibidores de PLK-2 (Polo-Like Kinase- 2) candidatos a antiparkinsonianos Jéssica Tiemi Fukushima Kimura Trabalho de Conclusão do Curso de Farmácia-Bioquímica da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo. Orientador: Prof. Dr Gustavo Henrique Goulart Trossini São Paulo 2017

2 SUMÁRIO Página Lista de Abreviaturas 1 RESUMO 2 1. INTRODUÇÃO 3 2. OBJETIVOS 6 3. MATERIAIS E MÉTODOS 6 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÃO BIBLIOGRAFIA 20

3 3 LISTA DE ABREVIATURAS PLK-2 DP SBDD Polo-Like Kinase-2 Doença de Parkinson Planejamento de fármacos baseado na estrutura do ligante, do inglês Structure-Based Drug Design LBDD Planejamento de fármaco baseado no ligante, do inglês Ligand-Based Drug Design QSAR Relação quantitativa de estrutura-atividade, do inglês Quantitative Structure Activity Relationship PLS HQSAR Quadrados mínimos parciais, do inglês Partial Least Squares Relação quantitativa de estrutura-atividade por hologramas, do inglês Hologram Quantitative Structure Activity Relationship 2D 3D CRC IC 50 Bidimensional Tridimensional Verificação de redundância cíclica, do inglês Cyclic Redundancy Check Concentração inibitória de 50%, do inglês Half Maximal Inhibitory Concentration A B C H Ch DA Átomos Ligações, do inglês Bond Conectividade Átomos de Hidrogênio Quiralidade, do inglês Chirality Doadores e Aceptores de Hidrogênio

4 4 RESUMO KIMURA, J. T. F. Estudo de QSAR aplicado a inibidores de PLK-2 (Polo-Like Kinase-2) candidatos a antiparksonianos Trabalho de Conclusão de Curso de Farmácia-Bioquímica Faculdade de Ciências Farmacêuticas Universidade de São Paulo, São Paulo, Palavras-chave: Parkinson; PLK-2; Inibidor; HQSAR. INTRODUÇÃO: A proteína pré-sináptica alfa-sinucleína é responsável pela reciclagem das vesículas pré-sinápticas e pelo armazenamento e compartimentalização dos neurotransmissores. Um dos fatores chave para a agregação da alfa-sinucleína, é a fosforilação de sua estrutura, que ocorre, principalmente, pela ação da enzima Polo-Like Kinase-2 (PLK-2), sendo um indicador para o desenvolvimento da Doença de Parkinson. O estudo de HQSAR é aplicado para descrever quantitativamente as relações entre a estrutura química de moléculas e as atividades biológicas por elas desempenhadas através da obtenção de hologramas. OBJETIVO: O projeto teve como objetivo utilizar a técnica de HQSAR, utilizando a meotologia de LBDD, a fim de obter modelos preditivos de atividade biológica e identificar os fragmentos moleculares que desempenham um papel importante para a atividade biológica. MATERIAIS E MÉTODOS: Para realização do estudo, foram analisadas 31 moléculas, que apresentam atividade inibitória sobre a enzima PLK-2, a partir dos valores de IC 50. Foram desenvolvidos modelos de QSAR 2D baseados em hologramas moleculares, bem como a análise estatística dos modelos obtidos. RESULTADOS: Um estudo estatístico, aliado à triagem e análise da atividade biológica das moléculas, permitiu obter resultados de distinção e tamanho do fragmento da molécula com indícios de alta capacidade de predição e robustez, podendo ser utilizado para o desenvolvimento de possíveis candidatos a testes experimentais. O modelo preditivo de melhor resposta biológica apresentou distinção A/B/C/H/Ch e tamanho de fragmento de 2 a 5, com valores de q 2 e R 2 iguais a 0,808 e 0,917, respectivamente. O valor de q 2 mostrou a distinção de fragmento molecular que mais contribuiu para a atividade biológica, bem como o tamanho do fragmento que melhor representa a relação estrutura-atividade. CONCLUSÃO: A associação dos resultados obtidos podem ser relevantes no planejamento de novos fármacos seletivos para a enzima PLK-2 e mais potentes para a Doença de Parkinson. Os modelos de HQSAR apresentaram uma função importante na predição de atividade biológica das moléculas, além de fornecer sugestões de quais fragmentos moleculares desempenham um papel importante para a atividade biológica. Os valores de q 2 e R 2 próximos de 1 indicaram um modelo de alta capacidade de predição de atividade biológica e capaz de predizer as contribuições essenciais na estrutura para desempenhar atividade biológica.

5 5 1. INTRODUÇÃO A Doença de Parkinson (DP) foi descrita pela primeira vez em 1817, por James Parkinson, que nomeou a doença como uma paralisia agitante. Esta doença, é uma desordem neurológica degenerativa e progressiva no Sistema Nervoso Central, afetando o sistema motor e promovendo rigidez muscular, tremor involuntário e dificuldade de iniciar movimentos. A incidência da doença compreende aproximadamente 1% da população com mais de 60 anos, no entanto, em casos genéticos raros, pode acometer pessoas com idade inferior (BRAVO, NASSIF, 2006). Esta doença decorre devido à destruição generalizada de uma região da substância negra, a pars compacta, responsável por enviar fibras nervosas dopaminérgicas, que apresentam papel inibitório, para o núcleo caudado e o putâmen. Desta forma, a destruição destas fibras em pacientes parkinsonianos permite que esses núcleos fiquem ativos, levando a uma saída contínua de sinais excitatórios para o sistema de controle motor corticoespinhal, provocando assim, os principais sintomas da doença (GUYTON, HALL, 2006). A etiologia da doença de Parkinson ainda não está bem esclarecida, entretanto fatores ambientais e genéticos podem ser decisivos para seu entendimento. Com relação aos fatores genéticos, podemos citar a descoberta de diferentes genes associados ao desenvolvimento de formas familiares da doença de Parkinson. Dentre eles, estão os que codificam as seguintes proteínas: α- sinucleina, parkin, DJ-1, PINK-1 e LRRK2. Além disso, recentes descobertas implicam que problemas como disfunção mitocondrial, dano oxidativo, acúmulo anormal de proteínas e fosforilação de proteínas podem ser mecanismos moleculares chave que comprometem a função neuronal de dopamina e, consequentemente, contribuem para o desenvolvimento da doença (THOMAS, BEAL, 2007). A alfa-sinucleína é uma proteína pré-sináptica com papel importante na reciclagem de vesículas sinápticas, armazenamento e compartimentalização de neurotransmissores. Devido sua estrutura química, apresenta uma propensão para formação de agregados, sendo estes, os principais componentes dos corpos

6 6 de Lewy. Isso sugere um papel importante dos agregados de alfa-sinucleína na patogenicidade da doença (GUYTON, HALL, 2006). Um dos fatores chave para a agregação da alfa-sinucleína, é a fosforilação de sua estrutura, que ocorre, principalmente, pela ação da enzima Polo-Like Kinase-2 (PLK-2), sendo um indicador para o desenvolvimento da doença (AUBELE et al., 2013). A enzima Polo-Like Kinase apresenta um papel importante na regulação do ciclo celular e sua inibição, teoricamente, poderia causar toxicidade para as células do indivíduo tratado. Entretanto, estudos mostraram que a inibição seletiva da enzima PLK-2 não causou genotoxicidade em ratos, podendo ser um excelente alvo farmacológico a ser explorado para o tratamento da doença de Parkinson (FITZGERALD et al., 2013). Avaliando esse potencial farmacológico este projeto visou uma nova proposta de tratamento para a doença de Parkinson e, apesar do processo de desenvolvimento de novos fármacos ser um processo dispendioso e demorado, diferentes alternativas se mostram viáveis, sendo as técnicas de planejamento computacionais (in silico) um robusto e potente aliado. De maneira geral, os métodos in silico se baseiam em propriedades físico-químicas e interações entre estrutura e atividade para gerar modelos de triagem a fim de maximizar os recursos e acelerar o desenvolvimento de novos fármacos (MARTINS, FERREIRA, 2013). O planejamento de fármacos pode utilizar duas principais metodologias, o SBDD (Structure-Based Drug Design) ou o LBDD (Ligand-Based Drug Design). O SBDD leva em consideração a estrutura macromolecular do alvo ou do complexo ligante-receptor. Já o LBDD é aplicado quando a estrutura alvo não é conhecida, mas a estrutura do ligante é conhecida, permitindo a exploração de propriedades e séries de ligantes bioativos (GUIDO, ANDRICOPULO, OLIVA, 2010). O estudo de QSAR (Quantitative Structure Activity Relationship) busca estabelecer uma relação matemática, por meio de uma equação de reta, para associar a atividade biológicas com as propriedades físico-químicas de uma determinada classe de compostos (NETO et al., 2006).

7 7 Estudos de QSAR são amplamente aplicados no planejamento de fármacos com o intuito de descrever uma relação quantitativa entre as estruturas químicas moleculares e suas respectivas atividades biológicas. Dessa forma, é possível avaliar as propriedades físico-químicas (por exemplo, caráter eletrônico, estereoquímica, lipofilicidade, doação e acepção de ligações de hidrogênio, constante de acidez, entre outros) (ALMEIDA et al., 2010) a fim de obter moléculas com potencial perfil terapêutico (TAVARES, 2004). A regressão por quadrados mínimos parciais PLS (Partial Least Squares) é comumente utilizada no estudo de QSAR, no qual obtém-se modelos matemáticos por meio da regressão linear entre os descritores moleculares e suas respectivas atividades biológicas. Os modelos obtidos devem apresentar um bom valor de predição (q 2 > 0,5) (GOLBRAIKH, TROPSHA, 2002), além de serem validados, dando indícios que não foram obtidos ao acaso e apresentaram valores robustos. (MARTINS, FERREIRA, 2013). A técnica de HQSAR (Hologram Quantitative Structure Activity Relationship) emprega hologramas moleculares gerados pela fragmentação da estrutura 2D da molécula, permitindo definir a quantidade dos tipos de fragmentos que originam seus descritores. A partir da codificação da estrutura 2D, é possível correlacionar a similaridade e as características moleculares - como, eletronegatividade, tamanho de ligação, volume dos substituintes, peso melocular - com a atividade biológica (BROWN, MARTIN 1996). Os fragmentos gerados são correlacionados com os dados de atividade biológica - considerando que a predição de atividade biológica é dada por -log IC 50 = pic 50 -, através do método estatístico dos mínimos quadrados parciais (PLS Partial Least Squares) juntamente com uma validação cruzada (YE, DAWSON, 2009). Os fragmentos são mapeados e codificados por números inteiros a partir de um algoritmo específico (CRC Cyclic Redundancy Check), sendo que cada número é usado para marcar o fragmento alocado no holograma molecular. Para obter a similaridade química das moléculas, foi realizado o mapeamento dos fragmentos (fingerprint), utilizando o princípio da determinação da presença ou não de características estruturais específicas (BROWN, MARTIN

8 8 1996). No HQSAR, apenas as estruturas 2D e a atividade biológica são utilizadas como dados de entrada e, diferente dos métodos 3D, não necessita da geração de conformações bioativas, nem de alinhamento molecular (HURST, HERITAGE, 1997). No entanto, algumas informações 3D são incorporadas na codificação dos hologramas, como a hibridização e a quiralidade. O modelo obtido por HQSAR depende do tamanho do holograma a natureza individual dos fragmentos gerados e, consequentemente, as informações contidas nestes fragmentos que podem diferenciar pelo tamanho do fragmento e distinção do fragmento. O tamanho do fragmento é determinado por valores pré-fixados de número de átomos que um fragmento pode conter. Além disso, a distinção do fragmento descreve as informações presentes nos mesmos, levando em consideração a estrutura molecular original, com relação aos descritores: átomos (A), ligações (B), conectividade (C), átomos de hidrogênio (H), quiralidade (Ch) e DA (doadores e receptores de hidrogênio). Utilizando a técnica de HQSAR, é possível obter um modelo quantitativo da relação estrutura-atividade 2D, por meio da construção de hologramas dos fragmentos moleculares, fornecendo valores preditivos de atividade biológica. Dessa forma, a partir da combinação interativa de, no mínimo, dois parâmetros de distinção, são identificados os grupos ou padrões químicos que contribuem para a atividade da molécula. 2. OBJETIVO O objetivo deste projeto foi desenvolver um modelo de HQSAR para moléculas com ação inibitória da PLK-2 para auxiliar na otimização do planejamento de fármacos antiparkinsonianos. Dessa forma, seria possível relacionar os fragmentos estruturais 2D das moléculas com os valores de predição de atividade biológica. 3. MATERIAIS E MÉTODOS Para realização do estudo, foram selecionadas 31 moléculas, retiradas da literatura (AUBELE et al., 2013), que apresentam atividade inibitória sobre a

9 9 enzima PLK-2. Ao estabelecer o grupo de moléculas foram avaliadas a variedade biológica, distribuição de valores de atividade, e a variedade química, de modo a obter modelos o mais fidedigno possível para representar a inibitória na enzima PLK-2. Figura 01. Estrutura molecular base utilizada nos modelos (5,6,7,8- tetrahidropteridina) Pirimidina Piperazina Os dados de atividade biológica foram demonstrados a partir dos valores de pic 50 (-log IC 50 ), calculados a partir dos valores de IC 50 (Inhibitory Concentration, referente à concentração de uma molécula que induz à metade de sua atividade máxima, ou seja, inibição de 50%), retirados do artigo de referência (AUBELE et al., 2013). Dessa forma, um estudo de QSAR foi utilizado para estabelecer a relação entre estreutura química e atividade biológica do conjunto de dados. Figura 02. Estruturas 2D das moléculas do estudo e seus respectivos valores de IC 50 Molécula 1 Molécula 2 Molécula 3 Molécula 4 IC 50 1,45 µm IC 50 13,2 µm IC 50 0,306 µm IC 50 1,21 µm

10 10 Molécula 5 Molécula 6 Molécula 7 Molécula 8 IC 50 0,253 µm IC 50 0,167 µm IC 50 0,551 µm IC 50 4,24 µm Molécula 9 Molécula 10 Molécula 11 Molécula 12 IC 50 0,195 µm IC 50 0,008 µm IC 50 0,064 µm IC 50 0,085 µm Molécula 13 Molécula 14 Molécula 15 Molécula 16 IC 50 0,194 µm IC 50 0,481 µm IC 50 0,386 µm IC 50 0,390 µm Molécula 17 Molécula 18 Molécula 19 Molécula 20 IC µm IC 50 7,2 µm IC 50 4,22 µm IC 50 3,75 µm

11 11 Molécula 21 Molécula 22 Molécula 23 Molécula 24 IC 50 27,3 µm IC 50 55,9 µm IC 50 7,23 µm IC 50 17,6 µm Molécula 25 Molécula 26 Molécula 27 Molécula 28 IC 50 11,1 µm IC 50 18,2 µm IC µm IC 50 42,9 µm Molécula 29 Molécula 30 Molécula 31 IC 50 8,71 µm IC µm IC µm * Os substituintes das moléculas apresentam-se em azul. Com as moléculas selecionadas, as estruturas dos 31 compostos foram desenhadas em 2D no software ChemDraw 14.0 para, posteriormente, realizar a carga de minimização de energia mecânica no software Spartan, a fim de obter a

12 12 otimização da geometria de todos os átomos das moléculas (distância, rotação e ângulo da ligação) através de parâmetros semiempíricos da metodologia de cálculo quântico PM6. O estudo de HQSAR foi realizado na plataforma Sybyl-X 2.1, e consiste de três passos principais: obtenção de fragmentos estruturais de cada uma das moléculas do grupo teste com maior potencial de atingir o alvo desejado; alocação dos fragmentos no holograma e exclusão de seis moléculas aleatoriamente; e a correlação com os dados biológicos. Após a caracterização dos 31 compostos, foi atribuída uma classificação em quatro grupos clusters de acordo com os valores de pic 50. A partir da sequência obtida, foi possível selecionar 20% de cada grupo de clusters, de modo que houvesse igual representação dos grupos como conjunto teste, a ser utilizado durante as validações externas do modelo. O modelo de HQSAR foi gerado no Sybyl utilizando a metodologia estatística de validação interna leaving one out. Dessa forma, foi possível realizar uma avaliação da capacidade de generalização dos resultados pelo modelo por meio de uma validação cruzada dos resultados. Para que os modelos fossem gerados, foram obtidos hologramas a partir de fragmentos distintos em função de seus átomos (A), ligações (B), conectividade (C), átomos de hidrogênio (H), quiralidade (Ch) e DA (doadores e receptores de hidrogênio). Foi avaliada a combinação de campos que geraria melhor resultado atrelado ao princípio da parcimômia, no qual se confrontam os maiores valores de q 2 obtidos com o menor valor de campos necessários para obter os valores de correlação linear (LOWIS, 19997). Tabela 2. Parâmetros de distinção dos fragmentos no estudo de HQSAR Distinção dos fragmentos Definição Átomos (A) Distinção com base nos tipos de átomos Ligações (B) Distinção com base nos tipos de ligação

13 13 Conectividade (C) Átomos de Hidrogênio (H) Quiralidade (Ch) DA (Doadores e Receptores de Hidrogênio) simples, dupla, tripla ou aromática Diferenciação de acordo com a hibridização atômica dos fragmentos Diferenciação com base na presença e número de átomos de hidrogênio Distinção dos fragmentos de acordo com a presença de centros quirais (assimétricos) Diferenciação de acordo com a presença de átomos aceptores ou doadores de ligações de hidrogênio Para estudos de HQSAR, primeiramente deve-se separar os grupos de moléculas em grupos teste e grupos treino, de modo que esses grupos apresentem características homogêneas, ou seja, ambos os grupos deverão possuir características dos mais ativos e dos de menor atividade, para uma possível validação externa. Dessa forma, foi utilizado dois tipo de divisão análise estatística das atividades biológicas das moléculas com os valores de pic 50, com relação aos valores preditos, e os observados no estudo, previamente calculados no programa Sybyl 2.0 (AUBELE et al., 2013). Tabela 3. Carga residual com relação à atividade biológica (pic 50 ) das moléculas utilizadas no estudo Molécula pic 50 Valor predito Valor Carga observado residual 1 2, ,908-0, , ,713 2,966-1, , ,265 3,176-0, , ,288 3,538-0, , ,598 3,308 0, , ,276 2,98 0, , ,663 3,865 0,496

14 14 8 2, ,704 3,312 0, , ,685 4,086 0, , ,538 3,987-0, , ,758 3,494 0, , ,987 2,764-1, , ,135 4,14 0, , ,334 3,36 0, , ,334 3,322 0, , ,869 2,675-0, , ,843 3,167 1, ,919 1,72-0, , ,898 1,728 0, , ,637 2,792-0, , ,442 0,997 0, , ,353 1,636-0, , ,829 1,572 0, , ,882 1,93-0, , ,091 1,954 0, , ,451 1,335 0, ,212 1,506-0, , ,642 1,76-0, , ,722 1,483 0, ,154 1,324-0, ,164 1,34-0,176 Gráfico 1. Distribuição da carga residual das moléculas

15 Carga Residual 15 1,500 1,000 0,500 y = -0,0001x + 0,0604 R² = 4E-06 0,000-0, Número da Molécula -1,000-1,500 De acordo com a distribuição da carga residual das moléculas, a linha de tendência obtida apresenta um baixo coeficiente angular, pois as estruturas moleculares são muito semelhantes e apresentam variações de R1 e R2 muito próximas. O gráfico mostra o efeito dos substituintes R1 e R2 na carga residual da molécula, sendo as moléculas analisadas com menor carga residual (tendendo a zero) apresentam maior atividade biológica. No entanto, foram observadas moléculas com alto valor residual, mas com elevada atividade biológica. Dessa forma, foi realizada a divisão dos clusters no grupo treino na qual foi empregada a técnica de QSAR - e no grupo teste - utilizado para a avaliação da capacidade de predição das propriedades biológicas destas moléculas que não foram incluídas na calibração do modelo de QSAR, envolvendo moléculas de diferentes faixas de atividade -, de modo que esta distribuição abrangesse as moléculas. A definição do grupo treino e grupo teste ocorreu de modo que as moléculas foram selecioadas de todas as regiões de distribuição do Gráfico 1 para obter uma representatividade do espaço biológico, ou seja, a distribuição dos valores de resposta biológica das moléculas buscou ser equivalente em ambos os grupos, pois, assim, é possível verificar a consistência destes grupos e a

16 16 capacidade preditiva dos modelos. Em seguida, foi realizada uma inspeção visual, na qual foram analisados os valores de pic 50 a fim de separar as moléculas mais ativas das de menor atividade. Com isso, a separação entre grupo teste e treino foi mais robusta. Para fazer a divisão dos clusters, optou-se por uma divisão em quatro grupos, fazendo uma média entre o menor e o maior valor encontrados de pic 50 para determinar o intervalo a ser utilizado. Cálculo: Maior valor de pic 50 : 5,09691 Menor valor de pic 50 : 1 Número de grupos de clusters: 4 Considerando 1 o menor valor de pic50, sendo o início do intervalor dos clusters Intervalo de clusters = (IC 50 maior + IC 50 menor) 1 Número de grupos de clusters (5, ) 1 Intervalo de clusters = 4 Intervalo de clusters 1,2 Após a divisão, foram selecionados aleatoriamente 6 valores de pic 50 (dados hachurados na Tabela 4), correspondendo a aproximadamente 20% do total de dados a serem testados (grupo teste). Outro grupo teste (equivalente a 20% dos valores) foi gerado utilizando o programa Sybyl, a partir da construção de um Structure Similarity Map. Os seis pontos mais distantes no gráfico, cuja estrutura e valor de pic 50 eram muito diferentes das outras, foram aqueles selecionados para teste. As moléculas restantes (80% dos valores) correspondem ao grupo treinamento, que foi posteriormente utilizado para as análises de HQSAR. Tanto os resultados obtidos pelo mapa Structure Similarity Map, quanto por seleção aleatória foram considerados para dar seguimento às análises. Tabela 4. Divisão das moléculas em clusters utilizando como critério os valores de pic 50

17 17 Molécula Grupos de Clusters Intervalos de Clusters pic , , , ,2 26 1, , , , , , , , , , , , , ,3-3,5 7 3, , , , , , , , ,6-4,8 6 3, , ,9-6,1 5, RESULTADOS E DISCUSSÃO

18 18 Ao todo, 31 moléculas foram submetidas ao estudo de QSAR 2D, a fim de estabelecer relações entre estrutura e atividade. Para a criação do modelo foi utilizada a técnica de QSAR 2D denominada HQSAR. Esta técnica correlaciona as atividade biológicas de cada análogo em relação às diversas características comuns entre todas as moléculas da série analisada, fornecendo, assim, informações com relação a quais grupos ou padrões químicos contribuem mais ou menos para a atividade biológica, sendo capaz de estender as observações encontradas para moléculas que não foram usadas para a calibração do modelo. O parâmetro pic 50 foi utilizado como variável dependente para estabelecer o modelo que melhor representava a relação entre atividade biológica e estrutura molecular. O modelo foi gerado por meio de regressão por mínimos quadrados parciais (PLS). Neste, o conjunto original de dados é comprimido, gerando um número pequeno de variáveis denominadas componentes principal. Estas têm a vantagem de serem independentes (ortogonais) entre si e, portanto, a correlação entre as variáveis não limita sua aplicabilidade. A primeira análise foi realizada por meio de uma combinação interativa de no mínimo dois parâmetros de distinção átomos (A); ligações (B); conectividade (C); átomos de hidrogênio (H); quiralidade (Ch); doador/receptor (DA). Durante a construção dos modelos, foi obtido o valor de correlação por validação cruzada o qual faz referencia a predição biológica (q 2 ), coeficiente de correlação que representa a linearidade dos dados (R 2 ), erro padrão de validação (SEV), número de átomos (N). Para estabelecimento da robustez e poder preditivo do modelo criado foram utilizados os parâmetros q 2 e R 2 ; já o parâmetro SEV foi utilizado para avaliar o erro do modelo gerado. Tabela 5. Valores obtidos com os modelos gerados pelo grupo treinamento (80% dos valores) Número do Modelo Distinção do Fragmento q 2 SEV R 2 SEE HL N 13 A/H/Ch 0,825 0,535 0,973 0,

19 19 22 A/B/C/H/Ch 0,824 0,536 0,971 0, A/B/C/H 0,816 0,548 0,981 0, A/C/H/Ch 0,805 0,523 0,886 0, A/H 0,804 0,538 0,914 0, A/B/H 0,798 0,533 0,879 0, A/C/H 0,798 0,575 0,972 0, A/H/Ch/DA 0,77 0,582 0,891 0, A/B/C/H/Ch/DA 0,759 0,628 0,96 0, A/H/DA 0,755 0,617 0,93 0, A/C/Ch 0,751 0,639 0,981 0, A/C 0, ,973 0, A/C/H/Ch/DA 0,727 0,635 0,873 0, A/B/C/H/DA 0,712 0,651 0,862 0, A/B/C/DA 0,71 0,689 0,958 0, A/C/H/DA 0,705 0,66 0,878 0, A/B/C/Ch 0,699 0,701 0,983 0, A/B/C 0,698 0,667 0,883 0, A/C/DA 0,698 0,704 0,946 0, A/Ch/DA 0,666 0,72 0,884 0, A/Ch 0,646 0,722 0,841 0, A/B/Ch 0,597 0,751 0,777 0, A/B/DA 0,587 0,78 0,829 0, A/B 0,557 0,788 0,772 0, A/DA 0,511 0,849 0,807 0, Parâmetros utilizados para a definição dos fragmentos: A átomos; B ligações; C conectividade; H átomos de hidrogênio; Ch quiralidade; DA receptores e doadores de ligações de hidrogênio. q² coeficiente de validação cruzada interna pelo método de leaving one out SEV Desvio padrão de validação R² Coeficiente de regressão linear SEE Desvio padrão estimado HL Comprimento do Holograma N Principais componentes da análise de mínimos quadrados parciais De acordo com os resultados presentes na Tabela 5, os modelos 13 e 22 apresentaram os maiores valores de q 2, altos valores de linearidade R 2 e baixos valores de desvio padrão de validação SEV, apresentando variações no tamanho do fragmento entre os modelos.

20 20 A distinção do fragmento foi uma característica decisiva na resposta biológica da molécula, pois, apesar de terem o mesmo comprimento de holograma (HL) o valor de q 2 apresentado pelo modelo 10 foi menor do que os valores obtidos pelos modelos 13 e 22 selecionados. Os modelos gerados na Tabela 5 permitiram a predição da atividade biológica das moléculas que não passaram pela validação, representados por 20% das moléculas (grupo teste) contidas no grupo inicial presente na Tabela 3. Dessa forma, a partir dos valores de q 2, foi possível obter a distinção dos fragmentos moleculares que mais contribuíram para a atividade biológica. Tabela 6. Melhores modelos obtidos que apresentaram maiores valores de q 2 Número do Modelo Distinção do Fragmento q 2 SEV R 2 SEE HL N 13 A/H/Ch 0,825 0,535 0,973 0, A/B/C/H/Ch 0,824 0,536 0,971 0, Os modelos 13 e 22 foram validados, sendo avaliados os mesmos parâmetros analisados anteriormente, porém com a adição do item tamanho do fragmento, a fim de estabelecer uma relação de estrutura-atividade. Foram testados fragmentos com distância de quatro ligações em razão do ângulo direto com o átomo de carbono (C). Tabela 7. Testes dos tamanhos de fragmentos dos modelos 13 e 22 com distância de 4 ligações Número do Modelo Distinção 13 A/H/Ch Tamanho do Fragmento q 2 SEV R 2 SEE HL N 1-4 0,685 0,719 0,903 0, ,671 0,696 0,856 0, ,721 0,625 0,852 0, ,651 0,735 0,903 0,

21 21 22 A/B/C/H/Ch 1-4 0,695 0,671 0,87 0, ,808 0,532 0,917 0, ,763 0,591 0,885 0, ,68 0,704 0,89 0, Analisando os valores obtidos na Tabela 7, o modelo 22, com distinção A/B/C/H/Ch e tamanho do fragmento de 2 a 5 obteve os melhores resultados. Os valores elevados de q 2 e R 2 (0,808 e 0,917, respectivamente) e o menor valor de SEV (0,532) demonstraram que o modelo para fragmentos de tamanho 2-5 possui alta capacidade de predição e robustez, podendo ser utilizado para o desenvolvimento de possíveis candidatos a testes experimentais, sendo realizada, assim, uma triagem e um direcionamento para moléculas com maior probabilidade de atividade biológica considerável. Observou-se que os parâmetros dos fragmentos influenciaram na qualidade do modelo, como o comprimento do holograma (HL), variando com os números de posições que os fragmentos são alocados no holograma; tamanho dos fragmentos, de acordo com o número de átomos que compõem o fragmento; e a distinção do fragmento, que incluem as características moleculares que distinguem um fragmento do outro. Baseada na análise pela técnica de HQSAR, os parâmetros de distinção e tamanho do fragmento foram os que mais contribuíram para os melhores resultados. O tamanho do fragmento de 2 a 5 indica a variação de átomos que o fragmento deve conter para compor o holograma, sendo preditivo para o encaixe no sítio inibitório da enzima PLK-2. Ao considerar a estrutura molecular original, a distinção do fragmento em átomos (A), ligações (B), conectividade (C), átomos de hidrogênio (H) e quiralidade (Ch) indicam a composição estrutual da molécula que estabelecem determinadas propriedades físico-químicas da molécula. Tabela 9. Modelo com melhor resposta biológica Número do Modelo Distinção Tamanho do Fragmento q 2 SEV R 2 SEE HL N

22 22 22 A/B/C/H/Ch 2-5 0,808 0,532 0,917 0, Imagem 1. Estrutura 2D da estrutura que melhor representa o modelo de HQSAR Imagem 2. Mapa de contribuição da estrutura que melhor representa o modelo de HQSAR

23 23 A estrutura que melhor representa o modelo de HQSAR foi representada graficamente na forma de um mapa de contribuição atômica, no qual a representação da contribuição atômica para a atividade biológica foi indicada por cores. As cores verde e amarelo no mapa de contribuição indica a contribuição positiva destes grupos para a resposta biológica, e as regiões em cinza indicam uma contribuição neutra (SALUM, 2009). 6. CONCLUSÃO A técnica de HQSAR mostrou resultados estatísticos significativos, possibilitando a criação de modelos capazes de predizer quais as características estruturais mais adequadas para a construção de moléculas que atuem como inibidores da enzima PLK-2. O modelo quantitativo da relação estrutura-atividade 2D por construção de hologramas (HQSAR) gerou resultados representativos, considerando que a validação interna, externa e os testes adicionais apresentaram valores de acordo com os parâmetros aceitáveis. Os modelos de HQSAR apresentaram uma função importante na predição de atividade biológica das moléculas, além de fornecer sugestões de quais fragmentos moleculares desempenham um papel importante para a atividade biológica. Esta informação pode ser obtida por meio do cálculo individual de cada átomo ou fragmento das moléculas, podendo ser avaliadas através de mapas de contribuição para a atividade do composto. Os valores de q 2 e R 2 resultaram em valores próximos de 1 e indicaram uma alta capacidade de predição, aliada a um baixo potencial de erro. Os resultados obtidos mostram potenciais candidatos a fármacos e com possível ligação ao sítio inibitório da enzima PLK BIBLIOGRAFIA 1. AUBELE, D. L.; HOM, R. K.; ADLER, M.; GALEMMO, R. A.; BOWERS, S.; et al. Selective and Brain-Permeable Polo-like Kinase-2 (Plk-2) Inhibitors That Reduce

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26 26 São Paulo, 29 de setembro de Data e assinatura do aluno(a) Data e assinatura do orientador(a)