SPLICING ALTERNATIVO EM Drosophila melanogaster: EFEITOS DA DOXORRUBICINA SOBRE O GENE p53

Transcrição

1 SPLICING ALTERNATIVO EM Drosophila melanogaster: EFEITOS DA DOXORRUBICINA SOBRE O GENE p53 ALTERNATIVE SPLICING IN Drosophila melanogaster: EFFECTS OF DOXORUBICIN ON THE p53 GENE Yasmin de Araújo Ribeiro (1) Alexandre Junio Borges Araujo (2) Maíra Pompeu Martins (3) Alexandre Azenha Alves de Rezende (4) Resumo O processamento alternativo do pré-mrna é um evento rigidamente regulado, pelo qual o número de mrnas que codificam diferentes isoformas de proteínas pode ser grandemente expandido. Drosophila melanogaster possui um único membro da família p53, e a atual anotação do genoma prevê quatro isoformas de mrna, com a formação de três proteínas. Devido à significativa conservação das características genéticas e fisiológicas, Drosophila melanogaster possui uma longa história como organismo genético de escolha para compreender as bases moleculares das doenças humanas. O gene p53 desempenha papel fundamental na resposta ao dano no DNA e apoptose e, avaliar a ocorrência de padrões alternativos de splicing em resposta à exposição à Doxorrubicina, um agente antineoplásico, pode gerar dados que levem a avaliar a modulação em resposta à droga durante o tratamento oncológico. O objetivo deste trabalho foi avaliar a ocorrência de splicing alternativo do gene p53 em Drosophila melanogaster, em resposta a diferentes concentrações de Doxorrubicina. Duas isoformas foram observadas em todas as condições testadas, apresentando um padrão de processamento que não corresponde ao processamento constitutivo de éxons, independente da concentração da droga ou tratamento. Palavras-chave: Antineoplásico; Expressão gênica; PCR; Supressor tumoral. Abstract Pre-mRNA alternative splicing is a tightly regulated event by which the number of mrnas coding different protein isoforms can be greatly expanded. Drosophila melanogaster has a single p53 family member, and the current genome annotation predicts four mrna isoforms with the formation of three proteins. Due to the significant conservation of genetic and physiological characteristics, Drosophila melanogaster has a long history as the genetic organism of choice to comprehend the molecular basis of human diseases. The p53 gene plays a key role in the response to DNA damage and apoptosis, and evaluate the occurrence of alternative splice patterns in response to Doxorubicin exposure, an antineoplastic agent, can generate data that lead to assess the modulation in response to the drug during oncologic treatment. The aim of this work was to evaluate alternative splicing occurrence in Drosophila melanogaster p53 gene, in response to different concentrations of Doxorubicin. Two isoforms were observed in the tested conditions, presenting a processing pattern not correspondent to constitutive exon splicing, regardless of drug concentration and treatment. Keywords: Antineoplasic; Gene expression; PCR; Tumor suppressor. 1 Graduanda em Ciências Biológicas,Faculdade de Ciências Integradas do Pontal, Universidade Federal de Uberlândia (FACIP/UFU); 2 Mestrando em Biotecnologia, PPIB/USP. 3 Doutora em Genética, FMRP/USP. 4 Professor Doutor em Genética e Bioquímica, FACIP/UFU.

2 1 Introdução Drosophila melanogaster é um dos organismos mais intensamente utilizados em estudos de processos biológicos, incluindo estudos genéticos. Embora não muito semelhante a humanos, está bem estabelecido que a maioria dos mecanismos biológicos e vias fundamentais que controlam o desenvolvimento e sobrevivência são conservados entre estas duas espécies (JENNINGS, 2011). Um dos focos principais em estudos genéticos na atualidade é o desenvolvimento de neoplasias. Para um fenótipo neoplásico é necessário que alterações gênicas resultem na ativação de oncogenes e na inativação de genes supressores tumorais, como o gene p53, um fator de transcrição que atua mediando funções celulares incluindo apoptose, autofagia e reparo de DNA. Em células cancerígenas, a expressão anormal das isoformas de p53 está associada diretamente à formação e progressão do câncer, podendo o processamento alternativo estar associado à resposta ao tratamento (SURGET et al., 2014). O splicing alternativo do pré-mrna é um ponto de controle genético finamente regulado e extremamente flexível nos organismos, que possibilita às células, criar isoformas de proteínas com funções diferentes, ou até mesmo opostas, a partir de um único gene. Em D. melanogaster foi identificado um único membro da família p53, capaz de codificar para múltiplas isoformas com funções especializadas (DAVID e MANLEY, 2010; ZHANG et al., 2015). Diversos estudos correlacionam positivamente a ação de drogas antineoplásicas na modulação de splicing alternativo, alterando a sensibilidade da célula à quimioterapia e causando, frequentemente, a superexpressão de isoformas antiapoptóticas ou supressão de isoformas pró-apoptóticas. A Doxorrubicina é um exemplo de agente antineoplásico capaz de modular a expressão de diferentes isoformas transcritas de genes (SOLIERet al., 2004; REHMAN et al., 2015). Propomos no presente trabalho avaliar a ocorrência de processamento alternativo do gene p53 de D. melanogaster em resposta à droga Doxorrubicina (DXR), comumente utilizada no tratamento de neoplasias, avaliando aspectos que podem, potencialmente, contribuir para a biologia do tumor.

3 2 Materiais e Métodos Larvas de terceiro estágio ( horas) de D. melanogaster provenientes de cruzamentos utilizados para o Teste para Detecção de Mutação e Recombinação Somática (Somatic Mutation and Recombination Test - SMART) em células de asas de D. melanogaster: cruzamento padrão (Standard - ST) e cruzamento de alta ativação metabólica (High Bioactivation- HB) foram submetidas a tratamento crônico (aproximadamente 48 horas) com cinco concentrações de DXR: 1,6 mm, 1,2 mm, 0,8 mm, 0,4 mm ou 0,2 mm. Controle negativo (CN - água destilada) e positivo (CP - tratado com Etil carbamato a 10mM) foram incluídos nas análises. Após o tratamento, procedeu-se extração do RNA das amostras utilizando TRIzol Reagente (Thermo Fisher Scientific Inc., CA, USA) de acordo com o protocolo do fabricante. A integridade do material genético foi verificada em gel de agarose 1,5% em condição desnaturante e a concentração determinada através da leitura de absorbância a 260 nm. O RNA foi convertido em cdna com o Kit iscript cdna Synthesis Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) de acordo com protocolo do fabricante e utilizado em análises de splicing alternativo em regiões do gene p53 de D. melanogaster (dp53). A ocorrência de splicing foi verificada por RT-PCR e os resultados visualizados em gel de agarose. 3 Resultados e Discussão Splicing ou processamento corresponde ao evento de retirada dos introns e posterior junção dos exons, formando o mrna maduro. Dos eventos de splicing alternativo decorre a formação de diferentes mrnas que podem codificar um número expandido de isoformas proteicas, como resultado de um processamento diferenciado. Os eventos de splicing do pré-mrna é uma etapa crítica na regulação pós-transcricional da expressão gênica, que gera uma expansão significativa do proteoma funcional de organismos eucarióticos com número de genes limitado. A ocorrência de splicing alternativo pode resultar na inclusão ou retirada de exons, retenção de introns, modulação no processamento das porções 5 ou 3, gerando formas variáveis de mrna que atuam sobre diferentes processos celulares, inclusive determinando o desenvolvimento de tipos de canceres específicos (WILL e LÜHRMANN, 2011; LEE e RIO, 2015).

4 Na avaliação da ocorrência de splicing alternativo em D. melanogaster em resposta à exposição a DXR, analisamos uma região flanqueando 875 pb na sequência do pré-mrna de dp53. Após o splicing constitutivo, a região correspondente amplificaria 434 pb (Figura 1). FIGURA 1. Representação de introns e exons da porção do gene dp53 analisada. A. Indicação dos três primeiros éxons, incluindo as porções intrônicas, do pré-mrna de p53. B. Representação do processamento constitutivo do gene. Por nossos resultados, próximo à porção correspondente a 100 pb, observa-se dois amplicons: um, com menor intensidade (indicado pela seta azul, Figura 2) correspondendo a uma amplificação de aproximadamente 110 pb, e um segundo amplicon contendo menos de 100 pb, mais intenso, indicado pela seta vermelha (Figura 2). FIGURA 2 - M: Marcador de Peso Molecular (Ladder 100 PB, Ludwig Biotecnologia, Brasil); 1: HB DXR 1,6 mm; 2: HB DXR 1,2 mm; 3: HB DXR 0,8 mm; 4: HB DXR 0,4 mm; 5: HB DXR 0.2 mm; 6: HB CN; 7: HB CP; 8. ST DXR 1,6 mm; 9: ST DXR 1,2 mm; 10: ST DXR 0,8 mm; 11: ST DXR 0,4 mm; 12: ST DXR 0,2 mm; 13: ST CN; 14: ST CP. 15: HB DXR 1,6 mm (réplica); 16: HB DXR 1,2 mm (réplica); 17: HB DXR 0,8 mm (réplica); 18: HB DXR 0,4 mm (réplica); 19: HB DXR 0.2 mm (réplica); 20: HB CN (réplica); 21: HB CP (réplica); 22: ST DXR 1,6 mm (réplica); 23: ST DXR 1,2 mm (réplica); 24: ST DXR 0,8 mm (réplica); 25: ST DXR 0,4 mm (réplica) Observamos um padrão de processamento que não corresponde ao splicing constitutivo em todas as condições testadas, independente da concentração da droga ou do tratamento realizado. O amplicon contendo 110 pb corresponde à junção dos éxons I e III (Figura 1),

5 enquanto o amplicon mais intenso, indicado na Figura 2 pela seta vermelha, corresponde, aproximadamente, ao tamanho do exon III, demonstrando que as larvas de terceiro estágio de D. melanogaster, nas condições testadas, processam o pré-mrna retirando o exon II, de forma não dependente da droga testada. Nossos resultados confirmam a ocorrência de processamento alternativo do gene p53 de D. Melanogaster, sendo que o padrão observado não permite associar o evento à disponibilidade da droga DXR. A avaliação da modulação deste gene em outros estágios de desenvolvimento de D. melanogaster poderá auxiliar no entendimento do uso diferencial de exons observado. 4 Conclusão O padrão de processamento observado para dp53 em larvas de terceiro estágio não está relacionado à disponibilidade da droga DXR ou às demais condições analisadas. Este padrão pode ser dependente de fatores não avaliados, como o estágio de desenvolvimento de D. melanogaster. 5 Referências DAVID, C. J.; MANLEY, J. L. Alternative pre-mrna splicing regulation in cancer: pathways and programs unhinged. Genes & development, v. 24, n. 21, p , JENNINGS, B. H. Drosophila a versatile model in biology & medicine. Materials Today, v. 14, n. 5, p , LEE, Y.; RIO, D. C. Mechanisms and regulation of alternative pre-mrna splicing. Annual review of biochemistry, v. 84, p , REHMAN, S. U.; HUSAIN, M. A.; SARWAR, T.; ISHQI, H. M.; TABISH, M. Modulation of alternative splicing by anticancer drugs. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA, v. 6, n. 4, p , SOLIER, S.; LANSIAUX, A.; LOGETTE, E.; WU, J.; SORET, J.; TAZI, J.; BAILLY, C.; DESOCHE, L.; SOLARY, E.; CORCOS, L. Topoisomerase I and II inhibitors control caspase- 2 pre-messenger RNA splicing in human cells. Molecular Cancer Research, v. 2, n. 1, p , SURGET, S.; KHOURY, M. P.; BOURDON, J. Uncovering the role of p53 splice variants in human malignancy: a clinical perspective. OncoTargets and therapy, v. 7, p. 57, 2014.

6 WILL, C. L.; LÜHRMANN, R. Spliceosome structure and function. Cold Spring Harbor perspectives in biology, v. 3, n. 7, p. a003707, ZHANG, B.; ROTELLI, M.; DIXON, M.; CALVI, B. R. The function of Drosophila p53 isoforms in apoptosis. Cell death and differentiation, v. 22, n. 12, p. 2058, 2015.