UTILIZAÇÃO DE POLPA DENTÁRIA COMO AMOSTRA-REFERÊNCIA REFERÊNCIA PARA ANÁLISE DE PERFIS GENÉTICOS DE DNA

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1 Universidade Estadual de Campinas Faculdade de Odontologia de Piracicaba UTILIZAÇÃO DE POLPA DENTÁRIA COMO AMOSTRA-REFERÊNCIA REFERÊNCIA PARA ANÁLISE DE PERFIS GENÉTICOS DE DNA Use of dental pulp as reference sampling for analysis of genetic profiles of DNA Talita Lima de Castro Piracicaba 2009

2 Introdução As técnicas da biologia e genética molecular têm mostrado um marcável desenvolvimento científico A identificação pelo DNA tem provado seu valor, principalmente quando o uso dos métodos de identificação tradicionais como as impressões digitais e as radiografias dentárias são ineficazes

3 Os testes de DNA podem ser realizados com qualquer tecido ou líquido orgânico Sangue, saliva, sêmen, urina, fluidos, pêlos, músculo, ossos, células descamativas, pele e tecidos de todos os órgãos Remualdo et al.,

4 Porém, quando fatores exógenos destrutivos estão presentes, tais como alta temperatura e pressão, o emprego dos tecidos fica limitado Boljuni J, 2007; Primorac et al., 2000; De Leo et al., 2000; Remualdo, Explosão do depósito de combustíveis de Buncefield,

5 Nessas situações, porém, a polpa dentária goza de proteção única Está envolta por dentina, cemento e esmalte, e protegida por tecido ósseo, muscular, conjuntivo Remualdo et al., 2005 e epitelial Representa excelente fonte de DNA genômico Silva et al., 2007

6 Schwartz et al. (1991) avaliaram fatores como: PH (3.7 e 10.0), Temperatura (4 C, 25 C, 37 C e incineração) Umidade (20, 66 e 98%) Tipo de solo em que foi enterrado (areia, barro, grama, submersão em água, ao ar livre) Períodos de inumação (uma semana a seis meses) Concluíram que as condições ambientais examinadas não afetam a habilidade de obter DNA humano da polpa dentária SCHWARTZ, T.R. et al. Characterization of deoxyribonucleic acid (DNA) obteined from teeth subjected to various environmental conditions. J Forensic Sci, v.36, n.4, p , 1991.

7 Hanaoka et al. (1995) avaliaram a extração de DNA a partir dos tecidos mineralizados do dente e da polpa de 50 dentes estocados em temperatura ambiente por no mínimo 336 dias Não houve correlação entre o período de armazenamento e a quantidade de DNA amplificado Os resultados obtidos a partir do sangue e da polpa dentária foram melhores que os dos tecidos duros dentais, pela análise de DNA genômico (VNTR) Conclusão: Foi possível encontrar DNA nas amostras HANAOKA, Y. et al. Fundamental and pratical study for DNA analysis using tooth as a source of DNA. Nihon Hoigaku Zasshi, v. 49, n.1, p.1-10, 1995

8 Smith et al. (1993) estocaram 20 terceiros molares (10 direitos e 10 esquerdos) em umidade e temperatura ambiente por 18 semanas Os molares direitos foram triturados, enquanto que os da esquerda foram seccionados a fim de fornecerem amostra para a análise gênica Concluíram que quando o dente é triturado, os resultados são maximizados Porém, a secção conservadora do dente provê amostras suficientes para a análise gênica, com a vantagem de preservar a estrutura dentária, possibilitando seu uso para outras finalidades posteriores (estudos radiográficos, comparativos e bioquímicos) SMITH, B. C. et al. A systematic approach to the sampling of dental DNA. J Forensic Sci. v.38, n.5, p , 1993.

9 Justificativa Atualmente não há uma uniformização dos protocolos a serem empregados na extração do DNA a partir da polpa dentária Não se tem claro se a utilização desse tecido como fonte de material genético produz resultados satisfatórios para o propósito da identificação humana

10 Objetivos Objetivo principal: Avaliar a viabilidade da utilização de amostras biológicas provenientes da polpa dentária para obtenção de perfis genéticos de DNA de corpos nãoidentificados. Objetivos secundários: - Analisar a capacidade da polpa de prover amostras com número de alelos suficientes para permitir uma identificação segura; - Comparar os resultados desse trabalho com resultados provenientes de extração de DNA em ossos constantes dos processos de análise realizados pelo Laboratório de DNA Criminal da PC-ES nos anos de 2006 a 2008.

11 Material e Método

12 Local da pesquisa Departamento Médico-Legal Laboratório de DNA Criminal da Polícia Civil do Espírito Santo

13 Características gerais da população a estudar 50 corpos que derem entrada no DML - Vitória no período estipulado Sexo feminino e masculino Após exame antropológico, serão incluídos apenas os cadáveres cuja idade seja acima de 18 anos

14 Critérios de Inclusão Cadáveres em avançado estado de decomposição Cadáveres carbonizados Ossadas Que, após a realização dos procedimentos normais (identificação datiloscópica e identificação antropológica) permanecerem na condição de corpos não-identificados.

15 Critérios de Exclusão Idade abaixo de 18 anos aproximadamente, (calculada pelo médico legista através de exame antropológico) Cadáveres já identificados

16 Coleta e acondicionamento do material Radiografia Extração de um dente de cada cadáver Armazenamento em recipientes plásticos estéreis, na câmara fria, a -4ºC. Identificação com número da amostra, RG/IML do cadáver e data

17 Coleta do material Retirar da superfície externa do dente, com cureta, placa bacteriana ou cálculo Lavar cuidadosamente com água deionizada

18 Coleta do material Cortar o dente horizontalmente, perpendicular ao seu eixo, ao nível da porção cervical Disco de corte em baixa rotação

19 Coleta do material Curetar as paredes da câmara, recolhendo o tecido da polpa ali aderido

20 O material será acondicionado in natura em eppendorf Identificação, catalogação e armazenamento das amostras

21 Fase I: Extração A extração seguirá o protocolo de Budowle et al. (1995) modificado, utilizado rotineiramente pelo Laboratório de DNA Criminal da Polícia Civil do ES.

22 Fase I: Extração Os STR loci a serem estudados são os comumente utilizados pelo CODIS (combined DNA index system) do FBI, entre eles o TPOX, D3S1358, D5S818, FGA, CSF1PO, D7S820, D8S1179, THO1, VWA, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, e a amelogenina.

23 Fase II: Amplificação pela PCR Fase onde o DNA é amplificado através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) 2n de ciclos

24 Fase III: Eletroforese capilar Seqüenciador de DNA do Laboratório de DNA Criminal do Espírito Santo O software a ser utilizado para monitorar o processo de eletroforese será o Foundation Data Colection, e para a interpretação dos dados, utilizaremos o Gene Mapper.

25 Análise dos perfis genéticos e validação dos resultados Material biológico remanescente: será descartado segundo as normas de biossegurança adotadas no Laboratório de DNA Criminal. Não haverá formação de bancos de tecidos ou dados

26 Resultados Esperados O presente trabalho busca: Demonstrar a importância da polpa dentária na identificação humana, e sua capacidade de prover número de alelos suficientes para permitir uma identificação segura. Apontar vantagens do uso da polpa dentária como amostra-referência em relação ao osso, ao analisar a viabilidade, a praticidade e eficácia, bem como a maior rapidez nos resultados e menores custos. Ampliar o campo de atuação dos odontolegistas dentro dos Laboratórios de DNA e dos Institutos Médico- Legais, visto que as atividades apresentadas exigem a capacidade técnica dos cirurgiões-dentistas.

27 Cronograma de Execução da Pesquisa Meses 1 e 2: Realização dos testes-piloto Meses 3, 4, 5, 6, 7: Coleta, acondicionamento e processamento das amostras Meses 8 e 9: Análise e tabulação dos resultados Meses 10 e 11: Conclusão do projeto e redação final Mês 12: Apresentação * A execução do projeto somente terá início após a aprovação pelo CEP

28 Referências Bibliográficas Alvarez García A, Muñoz I, Pestoni C, Lareu MV, Rodríguez-Calvo MS, Carracedo A. Effect of environmental factors on PCR-DNA analysis from dental pulp. Int J Legal Med. 1996; 109(3): Alimena LJM, Jesus-Garcia Filho R, Toledo SRC, Alves MTS, Petrilli AS, De Luca Junior G, et al. Protocolo de um banco de tecidos neoplásicos. Rev Bras Ortop. 2008; 43(3): Andelinovic Š, Sutlovic D, Ivkošic IE, Škaro V, Ivkošic A, Paic F, Rezic B, Definis-Gojanoviæ M, Primorac D. Twelve-year Experience in Identification of Skeletal Remains from Mass Graves. Croat Med J. 2005; 46(4): Boljuni J. DNA Analysis of Early Mediaeval Individuals from Zvonimirovo Burial Site in Northern Croatia: Investigation of Kinship Relationships by Using Multiplex System Amplification for Short Tandem Repeat Loci. Croat Med J. 2007; 48:

29 Referências Bibliográficas Budowle B, Baechtel FS, Comey CT, Giusti AM, Klevan L. Simple protocols for typing forensic biological evidence: chemiluminescent detection for human DNA quantitation and restriction fragment length polymorphism (RFLP) analyses and manual typing of polymerase chain reaction (PCR) amplified polymorphisms. Electrophoresis 1995; 16(9): De Leo D, Turrina S, Marigo M. Effects of individual dental factors on genomic DNA analysis. Am J Forensic Med Pathol 2000; 21(4): Drancourt M, Aboudharam G, Signoli M, Dutour O, Raoult D. Detection of 400 year old Yersinia pestis DNA in human dental pulp: An approach to the diagnosis of ancient septicemia. Proc Natl Acad Sci. 1998; 95: Pötsch L, Meyer U, Rothschild S, Schneider PM, Rittner C. Application of DNA techniques for identification using human dental pulp as a source of DNA. Int J Legal Med. 1992; 105:

30 Referências Bibliográficas Primorac D, Anðelinoviæ Š. Identification of human remains from mass graves found in Croatia and Bosnia and Herzegovina. In: Zabit C, editor. Proceedings of the 10th International Symposium on Human Identification; 1999 Sep 29 Oct 2; Lake Buena Vista, FL, USA. Madison, WI: Promega Corporation. In press Primorac D, Schanfieldi MS, Primorac D. Application of Forensic DNA Testing in the Legal System. Croatian Med J. 2000; 41: Remualdo VR. Avaliação de três métodos de extração de DNA de dentes humanos submetidos ao calor [Dissertação de Mestrado]. São Paulo: Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo; Remualdo VR, Nunes FD, Hirata MH, Melani RFH, Oliveira RN. Análise do STR-F13A01 e MPSs do mtdna para fins de identificação humana: comparação de três métodos de extração de DNA de dentes submetidos ao calor. RPG Rev Pós Grad. 2005; 12(4): Remualdo VR, Oliveira RN. Analysis of Mitochondrial DNA From the Teeth of a Cadaver Maintained in Formaldehyde. Am J Forensic Med Pathol. 2007; 28:

31 Referências Bibliográficas Schwartz TR, Schwartz EA, Mieszerski L, McNally L, Kobilinsky L. Characterization of deoxyribonucleic acid (DNA) obtained from teeth subjected to various environmental conditions. J Forensic Sci. 1991; 36: SENASP. Padronização de Exames de DNA em Perícias Criminais Silva RHA, Oliveira RN. Forensic anthropology and molecular biology: independent or complementary sciences in forensic dentistry? An overview. Braz J Oral Sci. 2008; 7(25): Smith BC, Fisher DL, Weedn VW, Warnock GR, Holland MM. A systematic approach to the sampling of dental DNA. J Forensic Sci. 1993; 38(5): Sweet DJ, Sweet CH. DNA analysis of Dental Pulp to link Incinerated Remains of Homicide Victim to Crime Scene. J Forensic Sci. 1995; 40(2): Vanrell JP. Odontologia legal e antropologia forense. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan; 2002.

32 Obrigada pela Atenção! Vila Velha - ES