Recolha e avaliação de ejaculados de garanhão em condições de campo. Collection and evaluation of horse semen under field conditions

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1 NOTA TÉCNICA REVISTA PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS Recolha e avaliação de ejaculados de garanhão em condições de campo Collection and evaluation of horse semen under field conditions José Robalo Silva CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária - TULisboa, Av. da Universidade Técnica, Lisboa Resumo: Em Portugal é pouco comum os clínicos de equinos efectuarem, no campo, exames de função sexual a garanhões que incluam a avaliação de sémen. A inseminação artificial com sémen fresco resultou em aumento de intervenção veterinária e mostrou que a avaliação de sémen, associada ao exame clínico, é fundamental à determinação do potencial de fertilidade do garanhão. Também a utilização de sémen refrigerado ou congelado, autorizada presentemente pela Associação Portuguesa de Criadores do Cavalo Puro Sangue Lusitano, impõe ao clínico de equinos a necessidade de avaliar a qualidade do sémen antes da refrigeração ou no momento da inseminação artificial. O envolvimento limitado do clínico de equinos nos procedimentos de recolha e de avaliação de sémen no campo poderá resultar da falta de informação sobre as técnicas e os equipamentos necessários aos exames. Embora vários dos testes laboratoriais disponíveis sejam morosos e exijam equipamento sofisticado, a qualidade do sémen pode ser avaliada no campo utilizando testes de rotina simples como os descritos nesta publicação. Estes testes são fáceis de executar, utilizam equipamentos relativamente baratos e permitem a determinação rápida da mobilidade, da normalidade morfológica e do número de espermatozóides no ejaculado, parâmetros correntemente usados como indicadores da qualidade do sémen. Summary: Equine practitioners in Portugal rarely perform clinical examination of stallions including evaluation of semen in the field. The use of artificial insemination with fresh semen has resulted in a more intense veterinary management and showed that semen evaluation, complementary to clinical examination, is fundamental for assessment of potential fertility of stallions. Also, the use of transported cooled or frozen semen, recently approved by the Portuguese Lusitano Horse Association, forces the practitioner to evaluate the semen before cooling or at the time of insemination. Lack of information on techniques and equipments necessary to the exams may be the main reason why practitioners rarely perform semen collection and evaluation in the field. Although several of the laboratory tests that are available for sperm analysis are time consuming and require sophisticated equipment, quality of semen can be evaluated in the field by simple routine tests as described in this publication. These tests are easy to perform, require the use of inexpensive equipment and allow rapid determination of motility, morphological normality and sperm number, parameters currently used as indicators of semen quality. Correspondência: jrobalo@fmv.utl.pt Tel: ; Fax: Introdução A inseminação artificial (IA) em equinos tem vindo a ser progressivamente aprovada pela maioria das associações de criadores das respectivas raças (Crabo, 2001; Loomis, 2001; Love et al., 2001; Brinsco et al., 2003). No caso da raça equina Lusitana, a Associação Portuguesa de Criadores do Cavalo Puro Sangue Lusitano aprovou a IA com sémen refrigerado e com sémen congelado, respectivamente em 2001 e em Antes da aprovação da IA com sémen refrigerado só era autorizado o registo no livro de nascimentos de produtos de inseminações efectuadas com sémen fresco, em presença do garanhão dador. A divulgação da inseminação artificial implica o crescente envolvimento do clínico de equinos nos procedimentos de manipulação e de avaliação de sémen refrigerado ou congelado e nos procedimentos de recolha, avaliação e acondicionamento de sémen para utilização imediata ou após refrigeração. É de esperar que, nesta fase de divulgação da IA equina, haja preocupações relativas a equipamento e a procedimentos necessários à sua prática, incluindo a recolha e a avaliação do sémen. Contudo, tanto o sémen fresco como o sémen refrigerado ou congelado podem ser avaliados, no campo, com recurso a material simples e relativamente barato. São objectivos desta publicação: 1) listar materiais necessários à recolha e à avaliação do sémen e 2) descrever e discutir procedimentos de recolha de sémen e métodos de avaliação da qualidade de ejaculados recolhidos no campo ou de amostras de sémen refrigerado ou congelado. Materiais necessários à recolha e à avaliação de ejaculados A recolha de sémen implica os seguintes materiais e equipamentos: - Vagina artificial, incluindo manga de borracha; - Sistema de aquecimento de água e termómetro; - Lubrificante não espermicida; - Copo de recolha. 305

2 A utilização de mangas de plástico descartáveis, no interior da manga de borracha, é vantajosa. Reduz a possibilidade de contaminação e impede o contacto dos espermatozóides com a borracha que parece ser espermicida (Skidmore, 2004). A avaliação do sémen, incluindo a estimativa de mobilidade, a avaliação das percentagens de espermatozóides vivos e com morfologia normal e a determinação da concentração de espermatozóides por unidade de volume do ejaculado, implica os seguintes materiais e equipamentos: - Microscópio óptico de campo e platina térmica; - Hemacitómetro e/ou fotómetro (calibrado para esta espécie animal); - Micropipeta de volume regulável (0-20 µl ou µl); - Lâminas e lamelas; - Tubos de plástico (6-10 ml); - Banho-maria ou garrafa térmica de boca larga e termómetro; - Solução de eosina-nigrosina; - Solução hipertónica (formol-citrato); - Diluidor de sémen (à base de leite). Procedimentos de recolha e de avaliação de sémen Recolha de sémen A recolha de sémen é feita, genericamente, com vagina artificial. Existem outros métodos de recolha, como a indução farmacológica da ejaculação ex-cópula que permite obter amostras com alta concentração de espermatozóides e baixo volume (McDonnell e Turner, 1994), mas a sua utilização tem-se restringido a trabalhos de investigação. A recolha de ejaculados com vagina artificial inclui a utilização de um manequim ou de uma égua em estro, a condução do garanhão, a preparação dos materiais usados na recolha e o processo de recolha propriamente dito. Embora aqui se faça apenas a descrição dos procedimentos de preparação da vagina artificial e de remoção do ejaculado da vagina, deve assinalar-se que a probabilidade de recolha e a qualidade do ejaculado têm forte relação com o ambiente em que são feitas as colheitas e com a forma de condução do garanhão. O clínico que decide incluir na sua actividade a inseminação artificial equina tem, como preocupação importante, a análise das características do material a adquirir. Relativamente às características da vagina artificial, qualquer dos modelos existentes no mercado pode proporcionar bons resultados. Contudo, muitos operadores preferem vaginas de material leve, de lavagem fácil e de montagem e preparação rápidas. A preparação da vagina artificial, independentemente do modelo utilizado, deve ser efectuada de forma a obter uma temperatura interior de aproximadamente 44 C. Esta temperatura consegue-se enchendo a vagina com água entre 50 C e 58 C, dependendo da temperatura ambiente. A temperatura deve ser confirmada com termómetro inserido no interior da vagina e acertada caso seja necessário. A montagem da vagina inicia-se pela colocação da manga de borracha no interior do corpo da vagina. Com a manga bem alinhada, as extremidades exteriorizadas são rebatidas sobre os bordos do corpo da vagina e bem fixas com elásticos colocados em volta das extremidades rebatidas. A manga deve ficar esticada, embora não excessivamente. Uma manga demasiado frouxa pode admitir um volume excessivo de água e dificultar a intromissão do pénis, uma vez que o diâmetro interior da vagina depende da quantidade de água introduzida (Pickett, 1993). A manga interior pode ser também de borracha, mas são preferíveis mangas de plástico descartáveis. Permitem economizar o tempo necessário à lavagem e à desinfecção da manga e reduzem a probabilidade de contaminação. Também contribuem para a qualidade do ejacu-lado porque deixa de haver contacto do sémen com resíduos de substâncias espermicidas provenientes da lavagem, além de que a própria borracha parece ser espermicida (Skidmore, 2004). Deve haver o cuidado de verificar o bom alinhamento da manga interior, sobretudo quando é usada manga de plástico, uma vez que sendo muito mais fina e flexível tende a ficar torcida e com dobras. A manga interior deve ser rebatida e fixa sobre o bordo da extremidade proximal do corpo da vagina, ficando a extremidade distal livre e pronta a receber o copo de recolha. Há modelos de vaginas descartáveis que terminam em cone, desenhados para permitirem a fixação, sem formação de dobras, de copos de recolha com tampa aberta e rosca de fixação. Estes copos são de plástico, têm graduação que permite determinar o volume do ejaculado e permitem a adaptação de um filtro para eliminação imediata da fracção com gel e de detritos adicionados ao ejaculado durante a recolha. Os copos de recolha devem ser mantidos em estufa a 37 C, caso esteja disponível e, essencialmente nas colheitas feitas ao ar livre, o copo de recolha deve ser envolvido por material isolante. Depois de verificada a temperatura da vagina artificial, o interior deve ser lubrificado com lubrificante não espermicida (Froman e Amann, 1983). Estando a égua e o garanhão preparados, o copo de recolha, devidamente protegido, deve ser, então, colocado na extremidade da manga interior da vagina. Após recolha, a manga descartável deve ser removida da vagina artificial e deve ser esticada e inclinada em direcção ao copo para facilitar a drenagem completa do sémen. O copo de recolha deve, então, ser separado da manga e transferido para a zona de observação e avaliação do ejaculado. 306

3 Avaliação do sémen A avaliação do sémen deve incluir sempre a determinação e o registo de parâmetros macroscópicos (volume e cor do ejaculado) e de parâmetros microscópicos (mobilidade, morfologia, concentração). Avaliação macroscópica Imediatamente após recolha, devem ser registados o volume e a cor do ejaculado. Caso não tenha sido usado filtro durante a recolha, o ejaculado deve ser filtrado para um recipiente graduado (usar filtro apropriado ou improvisar com meia de nylon vulgarmente denominada por meia de vidro). Neste caso, registar o volume e a cor do sémen filtrado. O grau de opacidade dá uma ideia aproximada da concentração de espermatozóides no ejaculado. A cor típica é branco ou branco cinza. Ejaculados com cor amarela ou rosa indicam contaminação com urina ou sangue, respectivamente, e devem ser rejeitados. Após a avaliação macroscópica, que deve ser rápida, o recipiente que contém o ejaculado deve ser transferido, de imediato, para um banho-maria ou para uma garrafa térmica com água a 37 C. O sémen deve ser mantido a esta temperatura e deve ser protegido da luz, durante a avaliação microscópica. No caso de estarmos perante um ejaculado refrigerado, este deve ser mantido à temperatura de refrigeração durante a avaliação. Avaliação microscópica A observação microscópica de amostras de sémen, quando efectuada em condições adequadas, permite avaliar características de mobilidade e de morfologia dos espermatozóides nos ejaculados. Estas características são avaliadas no campo por observação directa ao microscópio de uma fracção de sémen diluído e por observação de esfregaços corados com substâncias de contraste, conforme se descreve adiante. Mobilidade dos espermatozóides. O teste microscópico de rotina mais comum é a avaliação visual, ao microscópio, da percentagem de espermatozóides móveis no ejaculado. Em muitas situações, este é o único teste executado. A execução deste teste deve incluir os passos seguintes: - Diluir 0,1 ml de sémen em 1 ml de diluidor apropriado mantido em banho-maria a 37 C. Se não for usado diluidor os espermatozóides aglutinam rapidamente, o que dificulta a observação. Na falta de diluidor pode usar-se soro fisiológico mas, neste caso, a observação deve ser rápida porque o tempo de sobrevivência dos espermatozóides é menor. - Colocar uma pequena gota do sémen diluído sobre lâmina colocada em platina térmica, cobrir com lamela e observar ao microscópio com uma ampliação de 400X. Como a temperatura é um factor crítico, no caso de não haver platina térmica, observar mais do que uma amostra em vez de efectuar uma observação prolongada da mesma amostra porque o abaixamento rápido de temperatura provoca decréscimo de mobilidade dos espermatozóides. Se a observação mostrar um número excessivo de espermatozóides com movimentos circulares, é provável que tenha havido choque térmico (Macpherson, 2001). O choque térmico evita-se procurando manter aquecidos a cerca de 37 C todos os dispositivos de recolha, de acondicionamento e de observação de sémen. No caso dos materiais de observação do sémen, quando o microscópio não está equipado com platina térmica, podem e devem ser usados sistemas que permitem aquecer a platina do microscópio e manter as lâminas aquecidas. Uma forma simples de improvisar uma placa térmica é introduzir um saco de borracha com água a 37 C numa caixa de plástico, de parede fina, invertida. O fundo da caixa, que funciona de placa onde devem ser mantidas as lâminas, deve estar encostado ao saco de borracha e deve estar bem seco porque a água provoca a morte dos espermatozóides. Um saco idêntico pode ser colocado sobre a platina do microscópio entre cada observação. A percentagem de espermatozóides móveis na amostra é um indicador útil da qualidade do ejaculado, embora nem sempre a mobilidade dos espermatozóides e a fertilidade estejam correlacionados. Efectivamente, esta característica permite identificar ejaculados de fertilidade baixa, uma vez que maus ejaculados se correlacionam com baixa fertilidade, mas não é possível predizer se bons ejaculados correspondem a boa fertilidade (Amann, 1989). Testes mais elaborados também não permitem estabelecer correlações significativas com o nível de fertilidade potencial (Rodriguez-Martinez, 2003), pelo que a avaliação visual da mobilidade dos espermatozóides continua a ser o teste mais usado na avaliação de ejaculados. Integridade da membrana (vivos:mortos) e morfologia. A percentagem de espermatozóides vivos no ejaculado pode ser facilmente determinada através da característica que a membrana plasmática dos espermatozóides vivos tem de ser impermeável a corantes (moléculas grandes). Este objectivo tem sido conseguido, durante décadas, com eosina. Este corante confere cor rosa aos espermatozóides mortos, mantendo-se incolores os espermatozóides vivos (Dott e Foster, 1972). A visualização dos espermatozóides vivos é facilitada pela adição à eosina de um corante de contraste, a nigrosina. A eosina-nigrosina, além de permitir a identificação dos espermatozóides vivos e mortos, permite a avaliação morfológica dos espermatozóides. A avaliação da percentagem de espermatozóides vivos e da percentagem de espermatozóides com morfologia normal é efectuada por observação de um esfregaço preparado da seguinte forma: - Colocar 2 gotas de corante (eosina-nigrosina) num 307

4 tubo eppendorf (ou de ensaio com tampa) e manter em banho-maria (colocar 1 a 2 minutos antes da adição do sémen para a temperatura equilibrar); - Adicionar uma gota de sémen e misturar suavemente; - Transferir uma gota da mistura para uma lâmina e fazer um esfregaço. Se o esfregaço for demasiado espesso, com a lâmina usada para estender o esfregaço, fazer, de imediato, outro esfregaço que ficará muito menos espesso. Uma forma de evitar que o esfregaço fique espesso consiste em interromper o percurso da lâmina usada para estender o esfregaço, após ter deslizado alguns milímetros, e reiniciar imediatamente à frente da linha de interrupção, conforme se mostra na Figura 1. - Deixar o esfregaço a secar durante 1 a 2 minutos, identificar e observar de imediato ou mais tarde se conveniente. A observação deve ser com objectiva 40X ou, se as células estiverem bem intervaladas, com objectiva de imersão. Quer para a determinação de vivos:mortos, quer para a determinação de anomalias morfológicas, devem ser observados, pelo menos, 100 espermatozóides. A análise da morfologia dos espermatozóides é importante porque ejaculados com percentagens altas de anomalias morfológicas têm fertilidade baixa. Contudo, nem todas as anomalias têm o mesmo significado. Love et al. (2000) verificaram que incidência alta de anomalias da cabeça, cabeças destacadas, anomalias de conformação da peça média, caudas enroladas e formas imaturas têm correlação significativa com a fertilidade, enquanto que a mesma correlação não foi observada para anomalias do acrossoma, gotas citoplasmáticas (proximal ou distal), peça média dobrada e cauda dobrada. Figura 1 - Técnica de preparação de esfregaços de sémen corados com eosina-nigrosina. (1) Fazer retroceder a lâmina que estende o esfregaço até tocar a gota de sémen-corante; (2) Começar a estender o esfregaço alguns milímetros à frente. Concentração A determinação da concentração de espermatozóides deve ser sempre efectuada nos exames de rotina de avaliação de ejaculados. Este teste é indispensável nas situações em que se prevê a preparação de amostras para inseminação artificial. A concentração de espermatozóides multiplicada pelo volume do ejaculado corresponde ao número total de espermatozóides no ejaculado. Esta informação, em conjunto com a percentagem de espermatozóides com movimentos progressivos, permite calcular o número de doses que é possível preparar para IA. A concentração pode ser determinada, de forma rápida e expedita, quando se dispõe de um fotómetro calibrado para a espécie. Não estando disponível esse equipamento, pode usar-se um hemacitómetro, havendo no mercado vários modelos. O método que aqui se descreve corresponde à utilização do modelo "improved Neubauer". Contagem com hemacitómetro A determinação da concentração com hemacitómetro requer, além da câmara de contagem, solução hipertónica (formol-citrato), tubos eppendorf ou tubos Figura 2 - Contagem de espermatozóides na câmara de Neubauer. (A) Devem utilizar-se os quadrados grandes marcados com L; (B) Esquema de contagem dos espermatozóides 308

5 de plástico de 2-5 ml providos de rolha, micropipetas para 10 µl e 1000 µl e lamelas. A câmara de Neubauer "improved Neubauer" tem 9 quadrados grandes, estando os 4 dos cantos marcados com a letra L. Estes quadrados estão subdivididos em 16 quadrados pequenos. Cada quadrado grande tem 1 mm de lado e 0,1 mm de profundidade. A execução de técnica inclui: - Colocação da lamela sobre a câmara de contagem pressionando para que a aderência seja perfeita; - Pipetagem de 10 µl do ejaculado para um tubo contendo 0,99 ml de solução de formol-citrato. O tubo é rolhado e invertido 3 ou 4 vezes para misturar bem; - A câmara é cheia com a mistura, colocando a ponta da micropipeta de 10 µl no bordo formado entre a lâmina e a lamela; - Depois de aguardar 5 ou 6 minutos para que os espermatozóides sedimentem, observa-se ao microscópio focando primeiro com fraca ampliação e contando com um aumento de 400X; - Conta-se o número de espermatozóides contidos em 1 ou nos quatro quadrados grandes dos cantos (marcados com a letra L). A contagem deve respeitar o esquema apresentado na Figura 2; - Anota-se o número de quadrados e o número total de espermatozóides contados nesses quadrados. A concentração de espermatozóides no ejaculado é dada pela seguinte fórmula (se a diluição feita tiver sido 1:100 e se forem contados os 16 quadrados pequenos contidos num dos quadrados grandes): Concentração Spz/mL = nº total de Spz num dos quadrados grandes (letra L) A contagem directa com hemacitómetro, embora mais morosa, tem vantagens sobre a contagem automática com fotómetro ou com outros equipamentos portáteis. Sendo uma contagem directa tem um grau de precisão maior, além de poder ser utilizada tanto para sémen puro como para amostras de sémen processadas. Relativamente à precisão, a contagem com fotómetro é aceitável para concentrações entre Spz/mL mas não para concentrações abaixo ou acima desses limites. Isto porque para estes limites a concentração determinada por fotometria tem boa correlação com a contagem directa com hemacitómetro, mas as determinações por fotometria tendem a ser falsamente elevadas no caso de concentrações <100x10 6 Spz/mL e tendencialmente baixas no caso de concentrações > Spz/mL (Robalo Silva et al., 2002). Bibliografia Amann RP (1989). Can the fertility potential of a seminal sample be predicted accurately? J Androl, 10, Brinsko SP, Varner DD, Love CC, Blanchard TL, Day BC, Wilson ME (2003). Effect of feeding a DHA-enriched nutriceutical on motion characteristics of cooled and frozen stallion semen. Proc 49 th Annual Convention of the AAEP. Crabo BG (2001). Physiological aspects of stallion semen cryopreservation. Proc AAEP, 47, Dott HM, Foster GC (1972). A technique for studying the morphology of mammalian spermatozoa which are eosinophilic in a differential live/dead stain. J Reprod Fertil, 29, Froman DP, Amann RP (1983). Inhibition of motility of bovine, canine and equine spermatozoa by artificial vagina lubricants. Theriogenology, 20, Loomis PR (2001). Storage, handling, and distribution of frozen equine semen. Proc AAEP, 47, Love CC, Thompson JA, Lowry VK, Varner DD (2001). The relationship between chromatin quality and fertility of chilled stallion sperm. Proc AAEP, 47, Macpherson ML (2001). How to evaluate semen in the field. Proc AAEP, 47, McDonnell SM, Turner RMO (1994). Post-thaw motility and longevity of motility of imipramine-induced ejaculates of pony stallions. Theriogenology, 42, Pickett BW (1993). Collection and evaluation of stallion semen for artificial insemination. In Equine Reproduction, Ed. Angus O. McKinnon & James L. Voss. Lea & Fabiger, Pennsilvania, USA, pp Robalo Silva J, Barbosa M, Agrícola R (2002). Variação sazonal da produção de sémen e do comportamento sexual de cavalos Lusitanos com 6-8 anos de idade: resultados preliminares. Proc. Congresso de Ciências Veterinárias, Oeiras, pp Rodriguez-Martinez H (2003). Laboratory semen assessment and prediction of fertility: still utopia? Reprod Dom Anim, 38, Skidmore L (2004). Artificial insemination. In: lecture notes for the short course in reproduction in the dromedary camel. Ed. L. Skidmore; Publ. IVIS ( Ithaca, USA. 309