UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA COMISSÃO DE ESTÁGIO CURRICULAR

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA COMISSÃO DE ESTÁGIO CURRICULAR ENZIMOLOGIA CLÍNICA EM MEDICINA VETERINÁRIA Autor: Jean Francisco de los Santos Scheffer Orientador: Prof. Félix H. D. González Supervisor: Prof. Francisco Fuchs Monografia apresentada à Faculdade de Veterinária como requisito parcial para obtenção da Graduação em Medicina Veterinária PORTO ALEGRE 2002/2

RESUMO Os médicos veterinários têm procurado meios auxiliares para avaliação e diagnóstico que ofereçam informações cada vez mais precisas com o menor transtorno ao animal e seu proprietário. A enzimologia tem se apresentado como uma boa alternativa quando usada em conjunto com outros exames, ou mesmo isoladamente. Pelo menos 12 enzimas são rotineiramente utilizadas na avaliação nutricional e no diagnóstico e prognóstico de doenças. Além delas, outras tantas têm sido estudadas e vão sendo incorporadas aos poucos no dia a dia do médico veterinário, constituindo-se ferramentas valiosas no exercício da profissão. O presente trabalho revisou o conhecimento a cerca do tema com suas aplicações na clínica, na nutrição animal e na pesquisa científica, avaliando as possibilidades e limitações de uso em algumas espécies de interesse veterinário. Palavras-chave: análises clínicas, enzima, enzimologia veterinária. 1

ABSTRACT Veterinarians have been seeking for auxiliary assessment and diagnostic means able to offer more accurate information and to cause the least disturbance to the animal and its owner. Enzymology has proven to be a good alternative when applied with other exams or even alone. At least 12 enzymes are currently used in the nutritional assessment, diagnosis and prognosis. Others have been studied and included in the veterinarians daily practice, helping to reach a fast and accurate diagnosis. The present paper reviewed the knowledge on the subject with its use in clinical practice, in animal nutrition, and scientific research, assessing the use and limitations with some species of veterinary interest. Key words: clinical analysis, enzyme, veterinary enzymology. 2

AGRADECIMENTOS Aos meus pais pelo sonho que tiveram de me ver formado e pelo apoio que deram para concretizá-lo; Às minhas irmãs pelo incentivo e pelo carinho que sempre me deram; À minha namorada pela compreensão e pelo amor que me dedicou durante todo o curso de Veterinária; Ao Professor Félix H. D. González pela orientação, pelas oportunidades oferecidas e pela amizade; Ao Professor Francisco Fuchs pela supervisão do estágio; Ao Veterinário Rômulo Campos pelas idéias que deu para tornarem este trabalho melhor e pela amizade. A todos estes, meus sinceros agradecimentos. 3

LISTA DE ABREVIATURAS AcP : Fosfatase ácida ALP : Fosfatase alcalina ALT : Alanina aminotransferase Amyl : Amilase Arg : Arginase AST : Aspartato aminotransferase ButChE: Butiril colinesterase AChE : Acetil colinesterase CK : Creatina quinase CK-BB : Creatina quinase isoenzima cerebral CK-Mt : Creatina quinase isoenzima mitocondrial CK-MB : Creatina quinase isoenzima híbrida CK-MM : Creatina quinase isoenzima muscular GGT : Gama glutamiltransferase GLDH : Glutamato desidrogenase GSH-Px : Glutation Peroxidase IUB : União Internacional de Bioquímica IUPAC : União Internacional de Química Pura e Aplicada Kat : katal LDH : Lactato desidrogenase LDH1 : Lactato desidrogenase isoenzima 1 LDH2 : Lactato desidrogenase isoenzima 2 LDH4 : Lactato desidrogenase isoenzima 4 LDH5 : Lactato desidrogenase isoenzima 5 Lip : Lipase OCT : Ornitina carbamiltransferase PK : Piruvato quinase SDH : Sorbitol desidrogenase TGI : Trato gastrointestinal TGP : Transaminase glutâmico pirúvica TGO : Transaminase glutâmico oxaloacética TLI : Imunorreatividade semelhante à tripsina (Trypsin-Like Immunoreactivity) 4

1 INTRODUÇÃO Seguindo uma tendência da medicina humana, também a medicina veterinária tem optado por desenvolver e utilizar exames clínicos que ofereçam o máximo de informação com um mínimo de invasibilidade. A enzimologia clínica surge como uma destas possibilidades, auxiliando no diagnóstico de doenças, no prognóstico de quadros clínicos diversos e na avaliação do estado nutricional dos pacientes. A história da enzimologia é muito recente, tendo seus primeiros passos a partir de trabalhos publicados por Vitor Henri em 1901, e por Leonor Michaelis entre 1910 e 1914. Estas pesquisas ofereceram subsídio teórico para que em 1927, King e Armstrong utilizassem pela primeira vez uma enzima para o diagnóstico clínico: a fosfatase alcalina. Estas décadas iniciais serviram para gerar o conhecimento e consolidar aquele já existente, dando margem para que a partir de meados da década de 1960 as enzimas séricas pudessem ser utilizadas como meio auxiliar de diagnóstico na medicina humana. Na medicina veterinária, o seu uso começou a ganhar importância a partir da década de 1980 e continua a crescer em importância até os dias de hoje. Atualmente a enzimologia apresenta uma gama muito grande de possibilidades, podendo ser mensurada em praticamente todos os fluidos corporais. No entanto, o presente trabalho tratará somente das enzimas de uso clínico que possam ser medidas no sangue, plasma ou soro das diversas espécies de animais domésticos. 5

2 BIOQUÍMICA BÁSICA 2.1 Classificação e Nomenclatura As enzimas podem ser identificadas por dois nomes e por um número de classificação. O primeiro, é o nome recomendado, que é mais curto e geralmente indica o substrato da reação ou a descrição de uma ação realizada, acrescida ao sufixo ase. O outro, é o nome sistemático, que consiste de uma descrição razoavelmente completa da reação química catalisada, unida ao sufixo ase. Além disso, a União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (IUB) recomenda um número de classificação para ser usado em trabalhos científicos, quando se torna necessária uma identificação exata e sem ambigüidades da enzima estudada (LEHNINGER, 1976; CHAMPE; HARVEY, 1996). O número de classificação não só identifica a enzima, como também indica o tipo de reação que cataliza através de uma série numérica convencionada. A classificação é feita a partir de seis classes principais, relacionadas na tabela 1. Os números subseqüentes indicam subclasses de enzimas dentro destas primeiras classes, e assim por diante. TABELA 1 Classes de Enzimas Segundo a Classificação da IUB, e Atividade que Catalizam Classe Nome da Classe Atividade EC 1 Oxidorredutases Catalisam reações de oxi-redução EC 2 Transferases Catalisam a transferência de grupos funcionais EC 3 Hidrolases Catalisam reações de hidrólise EC 4 Liases Adicionam grupos a ligações duplas EC5 Isomerases Catalisam reações de isomerização EC 6 Ligases Formação de ligações acoplados à hidrólise de ATP Fonte: Adaptado de LEHNINGER, 1976 O uso dos nomes recomendados evita algumas confusões comuns entre os veterinários. Por exemplo, a Transaminase Glutâmico-Pirúvica (TGP) na verdade deveria ser chamada de Alanina Aminotransferase, segundo as recomendações da IUB. Da mesma forma, várias outras enzimas são conhecidas por mais de um nome, ou em outros casos, um mesmo nome pode designar duas ou mais enzimas. 6

2.2 Cinética Química Para compreender como são realizados os exames que avaliam a quantidade de enzima presente no sangue, é importante ter uma idéia de alguns conceitos básicos de cinética química. De acordo com Lehninger (1976), uma reação química ocorre quando as moléculas de reagentes, em um instante qualquer, possuem energia suficiente para atingir o estado transição, quando então existe energia suficiente para que uma ligação química se forme ou se rompa formando um produto final. A velocidade da reação é dada pela concentração de moléculas neste estado de transição. Pode-se aumentar a velocidade da reação elevando a temperatura dos reagentes, ou adicionando um catalisador. Os catalisadores exigem uma menor energia de ativação para que a reação ocorra (Figura 1). Figura 1- Efeito da ação de um catalisador sobre a energia de ativação de uma reação Para que a reação química ocorra, a enzima precisa se ligar ao substrato, formando o complexo enzima-substrato. Este complexo é convertido em um complexo enzimaproduto que logo se dissocia em enzima e produto. O sítio ativo da enzima têm uma estrutura 7

complementar à do substrato (figura 2). Figura 2 - Reação catalisada por enzima Durante a reação, a quantidade de enzima livre diminui na mesma proporção que a quantidade do complexo enzima-substrato aumenta. Da mesma forma, a quantidade de substrato diminui, enquanto a quantidade de produto, que está sendo formado, aumenta. A Figura 3 demonstra esquematicamente como isto ocorre. Figura 3 - Concentração de enzima, substrato, produto e complexo enzima-substrato durante a reação 2.3 Fatores que influenciam a velocidade da reação As enzimas são catalisadores que ocorrem nos sistemas biológicos, com uma eficiência catalítica muito maior que os catalisadores sintéticos (LEHNINGER; NELSON; COX, 1995). Desta forma, as reações que catalisam estão sujeitas a características distintas daquelas reações não catalisadas. A principal diferença é o efeito de saturação com o substrato. Se em uma reação, a quantidade de enzima é mantida constante, enquanto se adiciona mais substrato, verifica-se que, num primeiro momento a velocidade da reação aumenta de forma proporcional à concentração de substrato. Aumentando-se, ainda mais, a concentração de substrato, a velocidade da reação vai diminuindo enquanto se aproxima assintoticamente de 8

uma velocidade constante, tornando-se independente da quantidade de substrato que é acrescido (Figura 4). O ph também tem uma influência importante sobre a atividade enzimática. A maioria das enzimas tem um ph característico e distinto, em que sua atividade é máxima. O ph ótimo não é necessariamente aquele encontrado no meio intracelular, indicando que este pode ser um controle intracelular sobre a atividade enzimática (LEHNINGER, 1976). Extremos de ph podem causar a desnaturação das enzimas. Figura 4 - Efeito da concentração e saturação de substrato sobre a velocidade de uma reação catalisada por enzima Como foi citado anteriormente, a temperatura pode aumentar a velocidade da reação pelo aumento do número de moléculas com energia suficiente para passar para o estado de transição. No entanto, em reações catalisadas por enzimas, um aumento muito grande pode causar a desnaturação das enzimas, com conseqüente perda de função. 9

3 PRINCÍPIOS DE ENZIMOLOGIA O conhecimento teórico sobre a cinética enzimática permitiu o desenvolvimento de ensaios quantitativos da atividade enzimática. Utilizando métodos analíticos relativamente simples, como a fotocolorimetria, analisa-se a quantidade de produto formado pela adição da enzima em uma solução com concentração conhecida de substrato. A reação ocorre em um tempo fixo, em condições determinadas de temperatura e ph. Pode ser necessária a adição de cofatores, como coenzimas ou íons metálicos. Para o uso na rotina de um laboratório de análises clínicas existem kits comerciais que oferecem os reagentes e o protocolo. 3.1 Unidades de Medida Normalmente, as enzimas são medidas de forma indireta. Em outras palavras, não se mede a enzima pela sua concentração molar ou massa total, mas pela sua atividade catalítica. A IUB definiu como unidade internacional de atividade enzimática (U), a quantidade de enzima que catalisa a conversão de um mol de substrato por minuto. Além disso, IUB e IUPAC recomendam uma nova unidade, o katal (kat). O katal equivale a um mol por segundo, seguindo as recomendações do Sistema Internacional de Unidades (SI). O problema é que o katal é uma unidade muito grande, de forma que na rotina da clínica os valores deveriam ser expressos em nanokatal (nkat). Para ter uma idéia 1 U é igual a 16,62 x 10-9 kat, ou 16,62 nkat. Desta forma, a maioria dos clínicos e laboratórios ainda utilizam a Unidade Internacional (U). 3.2 Cuidados com a Amostra O uso de enzimas como meio auxiliar de diagnóstico requer alguns cuidados adicionais àqueles já tomados para outros exames. Como em todos exames colorimétricos, cores estranhas presentes em grande quantidade no plasma podem interferir nos resultados. Portanto é importante tomar cuidados para evitar a hemólise das amostras. Da mesma forma, deve-se ter cuidado ao interpretar resultados de amostras muito ictéricas. Normalmente os kits comerciais fornecem parâmetros que indicam valores, dentro dos quais, a hemólise e a icterícia não interferem nos resultados. A turbidez devido a lipemia excessiva também pode interferir nos resultados. Outro cuidado a ser tomado é evitar congelar e descongelar muitas vezes a mesma 10

amostra, pois este processo pode causar a desnaturação de algumas enzimas. Quando for necessário analisar uma amostra em dias diferentes, recomenda-se dividir em pequenas alíquotas, descongelando só o que for analisado logo em seguida. 3.3 Isoenzimas Muitas enzimas são específicas de determinado órgão, portanto o surgimento desta enzima no plasma facilita a definição do local lesionado. Em outros tantos casos, as enzimas, estão presentes em vários tecidos diferentes, dificultando a interpretação clínica do exame. Quando existe esta dificuldade para definir o órgão lesionado, pode ser útil fazer uso das isoenzimas. Enzimas que, mesmo catalisando uma mesma reação e em uma mesma espécie animal, difiram entre si por suas características moleculares ou cinéticas, são chamadas de isoenzimas. Estas diferenças podem ser de origem genética ou pós traducionais (GELLA, 1994). A diferenciação das isoenzimas pode ser feita por eletroforese, por técnicas imunológicas ou pelo uso de diferentes substratos, ativadores ou inibidores enzimáticos (KRAMER; HOFFMANN, 1997). Dentre as enzimas normalmente utilizadas na clínica veterinária, aquelas que possuem isoenzimas são a aspartato aminotransferase (AST), fosfatase alcalina (ALP), creatina quinase (CK), amilase (Amyl), lactato desidrogenase (LDH), gama glutamiltransferase (GGT) e fosfatase ácida (ACP) (BUSH, 1991). 3.4 Presença de Enzimas no Sangue As enzimas de interesse diagnóstico são constituintes celulares de alguns tecidos específicos. Elas podem fazer parte tanto da membrana celular, como de organelas ou do conteúdo citossólico. Constantemente estas enzimas estão sendo liberadas na corrente sangüínea e, da mesma forma, são retiradas do sangue. Em condições normais, existe um equilíbrio entre a velocidade de liberação dos tecidos e de sua eliminação ou catabolismo. A simples detecção de atividade enzimática não é suficiente para o diagnóstico, uma vez que a presença de enzimas no sangue é considerada normal. A atividade catalítica sangüínea só tem significado clínico quando os valores encontrados ficam fora dos valores normais de referência, descartadas as causas clínicas de interferência. O incremento da atividade enzimática tecidual normalmente está associado ao aumento 11

da síntese da enzima no tecido de origem, à diminuição do catabolismo ou à proliferação celular, enquanto o decréscimo ocorre pelos fatores inversos (diminuição da síntese, aumento da degradação), pela inativação enzimática ou carência de cofatores (GELLA, 1994). Isto pode ocorrer por causas fisiológicas, patológicas ou terapêuticas. O incremento da liberação de enzimas à corrente sangüínea pode ocorrer por morte celular, aumento de permeabilidade da membrana ou pela proliferação celular. Alguns fatores interferem no tempo necessário para que a enzima seja liberada no sangue, entre eles o tamanho da enzima e outros fatores ligados ao órgão, como proximidade dos capilares e permeabilidade capilar do tecido. A eliminação das enzimas presentes na corrente sangüínea ocorre por excreção renal e pelo catabolismo mediado por células fagocíticas do sangue e do sistema retículo endotelial. A Figura 5 ilustra as inter-relações entre os fatores que influenciam a concentração de enzimas nos tecidos, sua liberação na corrente sangüínea e eliminação. Figura 5 - Fatores que afetam a concentração de enzimas no sangue. 3.5 Localização do Dano Embora algumas enzimas sejam específicas de determinados órgãos, na maioria das 12

vezes pode ser necessário usar outros recursos que ajudem na identificação do tecido afetado. Kerr (1989) cita que tanto a determinação de isoenzimas, quanto o uso concomitante de outras enzimas, podem auxiliar no diagnóstico. Bush (1991) acrescenta que outros achados laboratoriais podem indicar ou descartar o envolvimento de determinado órgão, quando avaliados conjuntamente. As técnicas de determinação de isoenzimas podem ajudar muito no diagnóstico, mas muitas vezes elas não estão disponíveis, ou seus custos são proibitivos para uso na rotina da clínica veterinária. Desta forma, resta ao médico veterinário avaliar a atividade de duas ou mais enzimas. Este procedimento aumenta a especificidade do resultado encontrado, fornecendo ao veterinário subsídios importantes para definir a conduta terapêutica. 3.6 Interpretação Além dos cuidados, já citados, com a coleta e armazenamento da amostra, é importante que o clínico tenha também um cuidado especial com a anamnese do paciente. Alguns fatos podem passar desapercebidos e levar a uma interpretação equivocada dos resultados, como por exemplo: A aplicação de uma injeção por via intramuscular pode causar uma irritação tecidual no músculo suficiente para elevar a concentração de CK, AST ou LDH no sangue; A hemólise pode interferir não somente pela variação na absorbância da amostra como também pela liberação de enzimas presentes nos eritrócitos; A CK pode elevar-se devido uma crise convulsiva em que o animal se debata e traumatize os músculos esqueléticos; O animal pode ter sofrido algum acidente que não foi percebido ou relatado pelos proprietários. Caso em que se deve procurar por outras evidências pois além do traumatismo muscular, pode ter ocorrido alguma lesão visceral; Verificar a possibilidade de indução enzimática por uso de drogas; Levar em conta fatores como caquexia, prenhez, idade, dieta e outros que possam interferir nos resultados; Animais e raças com taxas de crescimento maiores apresentam maior atividade enzimática de AST, ALT e ALP (PASTOROVÁ et al., 2000). 13

4 ENZIMAS 4.1 Alanina Aminotransferase (ALT) Também conhecida como transaminase glutâmico-pirúvica (TGP), a alanina aminotransferase está presente em tecidos com metabolismo ativo de aminoácidos como o fígado, rins e músculos esquelético e cardíaco. Esta enzima requer fosfato de piridoxal como cofator. Gella (1994) cita que gestação, nutrição inadequada e falha renal podem levar a uma atividade da ALT diminuída pela deficiência desta vitamina. Cães e ratos tratados com cefalosporina também podem apresentar esta diminuição da atividade enzimática (KRAMER; HOFFMANN, 1997). Não existem isoenzimas. De forma geral, em primatas, cães, gatos, coelhos e ratos, a ALT pode ser considerada uma enzima indicadora de dano hepático. Já em suínos, equinos, bovinos, ovinos e caprinos, a ALT tem pouco valor diagnóstico, uma vez que esta enzima é encontrada em concentrações muito baixas no fígado destas espécies. Jeschke e colaboradores (2001) demonstraram que, em ratos com 40% do corpo queimado, houve um aumento da concentração de ALT no soro. Ele concluiu que este aumento está relacionado à indução de apoptose (morte celular programada) nas células hepáticas. Portanto, em outros animais, também é provável que ocorra um aumento desta enzima quando houverem queimaduras extensas pelo corpo. Para cães e gatos a ALT é uma das enzimas de escolha para avaliar o comprometimento hepático. Segundo Bush (1991) é o melhor teste para detectar dano hepático em pequenos animais. Embora presente no coração, nos rins, músculos e eritrócitos, a enzima oriunda destes órgãos não é capaz de fazer a ALT aumentar muito mais do que 3 vezes (WILLARD; TVEDTEN; TURNWALD, 1993). O aumento da ALT está relacionado com o número de células envolvidas, ou seja, com a extensão, e não com a gravidade da lesão. Na realidade, mesmo uma lesão que não cause morte celular, pode ser suficiente para que ocorra a liberação de ALT na corrente sangüínea. Diversas drogas podem induzir um incremento da atividade sérica da ALT. Em pequenos animais são relevantes para o clínico o conhecimento dos seguintes princípios ativos: acetaminofeno, barbitúricos, glicocorticóides, cetoconazol, mebendazol, fenobarbital, fenilbutazona, primidona e tetraciclina (WILLARD; TVEDTEN; TURNWALD, 1993; SPINOSA; GORNIAK; BERNARDI, 1999). Inúmeras substâncias químicas (fenóis, alcatrão e outros), plantas hepatotóxicas e aflatoxina podem causar o mesmo efeito (OSWEILER, 14

1998). Ikatsu e colaboradores (1998) trabalhando com ratos, demonstraram o efeito cumulativo da intoxicação hepática, utilizando tetracloreto de carbono e clorofórmio. O tetracloreto de carbono é metabolizado no fígado, produzindo um radical livre que causa peroxidação de membrana (MACLACHLAN et al., 1998) com conseqüente extravasamento da ALT. Na análise dos resultados deve-se levar em conta que a ALT tem um pico de liberação no sangue cerca de 3 ou 4 dias após a lesão, mas retorna aos valores basais cerca de 2 semanas após. A persistência de valores elevados por um período maior que este pode indicar o estabelecimento de uma patologia crônica como neoplasia ou hepatite. Outras causas possíveis de aumento da ALT são shunts portossistêmicos, lipidose hepática, pancreatite aguda (aumento moderado), hepatites tóxicas ou infecciosas (leptospirose, peritonite infecciosa felina, e outras), hipóxia e febre (pequena variação) (SHAW; IHLE, 1999). Dimsk (1999) cita que em cães e gatos, a degeneração muscular é uma causa rara de elevação da ALT. 4.2 Amilase (Amyl) A alfa-amilase está presente em vários tecidos (glândulas salivares, cérebro, pulmão), mas em maior quantidade no pâncreas e duodeno. O cão não possui alfa-amilase nas glândulas salivares, embora outras espécies a possuam (KRAMER; HOFFMANN, 1997). Kerr (1989) cita que o principal uso desta enzima é para diagnóstico de pancreatite aguda. Grande parte da amilase sanguínea é removida do organismo pela filtração renal e eliminada na urina. Portanto, uma das causas prováveis de hiperamilasemia é a diminuição da filtração glomerular. No entanto, se esta causa for eliminada, a amilase tem uma alta especificidade para lesão pancreática. Em casos mais raros pode ocorrer aumento da amilase sangüínea por trauma cerebral. Willard, Tvedten e Turnwald (1993) sugere que algumas drogas podem causar pancreatite e por conseqüência hiperamilasemia. No entanto, não foram encontrados relatos de indução da produção enzimática pelo uso de drogas. Yazar e colaboradores (2002) demonstraram que o uso de fenobarbital não afetou a quantidade de amilase tecidual no cérebro e no rim. Brobst (1997) cita que em cães vários tecidos como intestino, rins e útero apresentam atividade de amilase, e por isso, vários pesquisadores preferem considerar que o diagnóstico 15

de pancreatite em cães seja dado só quando o valor ultrapassar 3 ou 4 vezes os valores de referência. 4.3 Arginase (Arg) Esta enzima apresenta aumento de atividade após uma injúria aguda do fígado, retornando aos valores normais mais rapidamente que a ALT e AST. Em hepatites necróticas crônicas pode manter níveis elevados, com um mal prognóstico para o animal. A arginase já foi demonstrada em várias espécies, mas pode ter valor diagnóstico em eqüinos, bovinos, ovinos, caprinos e cães (TENNANT, 1997). 4.4 Aspartato Aminotransferase (AST) Conhecida também pelo nome de transaminase oxaloacética (TGO). É encontrada principalmente no fígado, nos eritrócitos e nos músculos esquelético e cardíaco. Normalmente é utilizada para avaliar lesão muscular em conjunto com a creatina quinase e lactato desidrogenase. Nos grandes animais é usada também para investigar doenças hepáticas (KERR, 1989). Méndez (2001) cita que a enzima pode estar elevada na intoxicação crônica pelo cobre nos ovinos. Plantas hepatotóxicas que causem necrose hepática, como Cestrum parqui e Xanthium cavalinesii são causas possíveis de aumento da AST (MÉNDEZ; RIET-CORREA, 2001a). Senna ocidentalis e outras que causam extensa necrose muscular podem ter o mesmo efeito (MÉNDEZ; RIET-CORREA, 2001b). A deficiência de vitamina E e selênio pode causar necrose segmentar dos músculos esqueléticos (doença dos músculos brancos), incrementando a atividade de AST no plasma (BARROS, 2001). Nestes casos pode ser interessante avaliar conjuntamente a creatina quinase, que é mais específica para lesão muscular, e a glutation peroxidase, para avaliar a carência de selênio. A AST pode ser usada para avaliar lesão hepática em pequenos animais da mesma forma que a ALT, porém com uma especificidade muito menor. Na avaliação de lesão muscular, ela produz aumentos menores do que a creatina quinase, mas que se estendem por um período de tempo maior. Perez e colaboradores (2000) sugerem que AST deva ser incluída na monitoração de problemas musculares. A utilização desta enzima em conjunto com CK pode oferecer informações mais precisas sobre o período 16

em que se encontra a lesão (TADICH et al., 2000). A AST por ser uma enzima mitocondrial e citossólica, necessita uma lesão maior para ser liberada na corrente sangüínea. Por outro lado CK e LDH, por serem citossólicas e de tamanho pequeno, conseguem ultrapassar a membrana celular mesmo que não exista um dano tecidual muito grande. Na realidade, um simples aumento de permeabilidade de membrana é suficiente para que ocorra o extravasamento da enzima (PEREZ et al., 2000). Lesões no músculo cardíaco também são demonstradas pelo aumento da AST. Cardiomiopatias diversas podem causar este efeito, assim como endocardites bacterianas, dirofilariose, trombose aórtica e infarto do miocárdio. Quando estiver presente congestão hepática por problema cardíaco, a enzima provavelmente estará elevada devido ao fígado congesto (BUSH, 1991). O aumento da AST sérica pode ocorrer em patologias de localização no sistema nervoso central. Quando isto ocorrer, sugere uma grande lesão do parênquima e um prognóstico ruim (BURTIS; ASHWOOD * apud NAZIFI et al., 1997). 4.5 Colinesterase Existem na verdade duas enzimas conhecidas por este nome, a acetilcolinesterase (AChE) ou colinesterase verdadeira, e a butirilcolinesterase (ButChE), ou pseudocolinesterase. As duas apresentam os mesmos ativadores e inibidores, diferenciando-se principalmente pelo local onde são produzidas. A acetilcolinesterase é uma enzima integrante da junção mioneural, da substância cinzenta do cérebro e dos eritrócitos. A butirilcolinesterase é encontrada no plasma, substância branca do cérebro, fígado, pâncreas e mucosa intestinal. O aumento da atividade destas enzimas no sangue pode estar relacionado à lesão no sistema nervoso central. No entanto, a acetilcolinesterase normalmente é solicitada pelo veterinário quando existe a suspeita de intoxicação por organofosforados ou carbamatos. Neste caso, o significado clínico será dado pela diminuição da atividade enzimática no sangue e não pelo seu aumento. A intoxicação por organofosforados causa uma inibição relativamente estável da enzima, enquanto que aquela causada por carbamatos é muito lábil. A acetilcolinesterase serve para fazer o diagnóstico diferencial entre as substâncias tóxicas, uma vez que não tem uma relação muito grande com a gravidade dos sinais clínicos (OSWEILER, 1998). * BURTIS, C. A.; ASHWOOD, E.R. Tietz Textbook of Clinical Chemistry. 2.ed. Philadelphia: W. B. Saunders, 1994. 17

Gava (2001) acrescenta que a avaliação da atividade da acetilcolinesterase varia muito com o tempo e quantidade do produto ingerido. Como a AChE é encontrada em quantidades muito pequenas no plasma, normalmente avalia-se a atividade enzimática da ButChE como indicador da atividade enzimática da AChE na junção mioneural. (KRAMER; HOFFMANN, 1997). Bogin (1994), cita que a diminuição da atividade enzimática das colinesterases pode ocorrer por má nutrição, anemia ou doenças hepáticas. 4.6 Creatina quinase (CK) Também é conhecida pelo nome de creatina fosfoquinase (CPK). A creatina quinase possui quatro isoenzimas. A CK-MM está presente nos músculos esquelético e cardíaco, a CK-BB está presente no cérebro, e a CK-MB que é uma isoenzima encontrada principalmente no coração. A quarta isoenzima é a CK-Mt que é uma enzima mitocondrial que responde por até 15% da atividade da CK cardíaca (KRAMER; HOFFMANN, 1997). Em medicina veterinária, a determinação das isoenzimas de CK ainda não tem utilidade prática, embora seja comum na medicina humana. A CK é a enzima mais sensível para indicar lesão muscular. Pode ocorrer um incremento na atividade plasmática desta enzima por injeção intramuscular, decúbito prolongado (PEEK et al., 2001), convulsões, esforço prolongado e outras lesões musculares. Thompson (1997) cita que a CK pode ser útil na avaliação de pacientes com lúpus eritematoso sistêmico. Em trabalho recente, no Laboratório de Análises Clínicas Veterinárias da UFRGS, foi verificado que cães com leptospirose apresentavam a atividade sérica da CK aumentada. De fato, em medicina humana, este é um dos primeiros testes a serem realizados quando existe suspeita desta enfermidade. Este achado sugere uma extensa degeneração muscular, que explica as dores pelo corpo relatados em humanos e observados na clínica veterinária. Tadich, Gallo e Alvarado (2000) demonstraram o incremento de CK que ocorre em bovinos transportados por longos períodos. Este aumento ocorre pelo esforço físico que são submetidos os animais. O esforço do parto também é um fator de aumento da CK (MORAIS et al., 2000), assim como o exercício de cavalos de pentatlon (BALOGH et al., 2001). Wyatt, Labuc, e Wyatt (1998) concluíram que o uso da isoenzima CK-MB não é um indicador confiável de lesão cardíaca em cães, diferente do que ocorre com humanos. Isto ocorre devido a meia vida da CK-MB ser muito curta e, desta forma, raramente a isoenzima pode ser avaliada a tempo. 18

4.7 Fosfatase Alcalina (ALP) A fosfatase alcalina está presente no intestino, nos rins, no fígado e nos ossos. Kramer e Hoffmann (1997) citam duas isoenzimas, uma de origem intestinal e outra inespecífica. Além delas, existe uma isoenzima induzida por corticosteróide. Já Syakalima e colaboradores (1997) citam que no soro de cães podem ser encontradas isoenzimas de origem óssea, hepática e induzida por corticosteróide. Citam que existe ainda uma isoenzima de origem placentária mas que, assim como a isoenzima renal, não é comumente encontrada no soro. A isoenzima induzida por corticosteróide pode estar presente nos cães com hiperadrenocorticismo, cães em tratamento, ou secundário a doenças prolongadas pelo efeito do stress (CORNELIUS, 1996). Merchant (1999), assim como Chastain (1999), consideram o aumento da fosfatase alcalina um dos achados mais comuns no hiperadrenocorticismo canino. Além dos corticosteróides, outras drogas induzem ao aumento da fosfatase alcalina. Willard, Tvedten e Turnwald (1993) citam, como drogas que podem causar hiperatividade da fosfatase alcalina, os esteróides, barbitúricos, cefalosporinas, fenobarbital, fenotiazinas, fenilbutazona, tetraciclinas, tiabendazol e halotano. A Fosfatase Alcalina de origem óssea pode estar aumentada em animais jovens, em consolidação de fraturas, hiperparatireoidismo, osteossarcoma, osteomalácia ou na deficiência de vitamina D. Lorenz (1996) cita a deficiência de cálcio como um fator de elevação da ALP. Serakides e colaboradores (2000) relatam que, em ratas, foi observada uma relação negativa entre progesterona e estradiol com a atividade da fosfatase alcalina. Os animais castrados apresentaram uma maior atividade da enzima que os inteiros. Os felinos possuem uma menor quantidade hepatocelular de fosfatase alcalina, e que é rapidamente eliminada pelos rins. Além disso, nem toda hepatopatia significativa causa um aumento significativo da enzima. Em cães, a hepatopatia que causa aumento da fosfatase alcalina, cursa com colestase. A obstrução biliar extra-hepática, assim como a indução por corticosteróides, pode aumentá-la em até 10 vezes. Necrose hepatocelular geralmente cursa com aumento transitório da fosfatase alcalina (WILLARD; TVEDTEN; TURNWALD, 1993). 4.8 Gama Glutamiltransferase (GGT) Também é conhecida como gama glutamil transpeptidase (GTP). Presente em todas as células com exceção do músculo. Apresenta grande atividade nos rins e no fígado, mas somente aquela de origem hepática é normalmente encontrada no plasma, pois a de origem 19

renal é excretada na urina. O aumento da atividade da enzima ocorre, em todas as espécies examinadas, após colestase. Em felinos, mas não em cães, pode ser utilizada no lugar da fosfatase alcalina, com maior sensibilidade e especificidade para o fígado. Por isso é mais utilizada em gatos do que em cães. Em cães pode ser induzida pelo tratamento com prednisolona, sem causar colestase. Em filhotes de cão, a GGT pode atingir valores de até 25 vezes o valor normal para cães adultos. Aparentemente os cães também absorvem a GGT a partir do colostro (CENTER; HORNBUCKLE; HOSKINS, 1997). Em bovinos e ovinos, a GGT é transferida para os filhotes pelo colostro (KRAMER; HOFFMANN, 1997). Desta forma, é possível usar a GGT como forma de monitorar a ingestão de colostro pelos terneiros, embora com menor eficiência que a imunoglobulina G (HADORN; BLUM, 1997). Egli e Blum (1998) demonstram que a GGT é rapidamente absorvida pelos filhotes, mas que após algum tempo ela não é mais absorvida. Os níveis de GGT começam a diminuir no soro, e aos 21 dias estabilizam. Feitosa e Birgel (2002) não encontraram diferenças entre os níveis de GGT de vacas holandesas no periparto, confirmando que esta enzima não sofre alteração pelos efeitos do parto ou da colostrogênese. Peek e colaboradores (2001) citam elevação da atividade da GGT em vacas leiteiras com lipidose hepática. Müller (2001) descreve que animais infestados com Fasciola hepatica têm os níveis de GGT aumentados cerca de 6 semanas após a infecção. 4.9 Glutamato Desidrogenase (GLDH) É uma enzima utilizada para avaliar necrose hepática em ovinos, caprinos e bovinos. Pode aumentar também no parto e associado a obstrução de ducto biliar (TENNANT, 1997). Normalmente a GLDH tem uma resposta mais rápida do que a GGT, mas também volta aos níveis normais mais rapidamente. Müller (2001) descreve que animais infestados com Fasciola hepatica têm os níveis de GLDH aumentados até cerca de 2 semanas após a infecção, enquanto a GGT aumenta só a partir da sexta semana. 4.10 Glutation Peroxidase (GSH-Px) É uma enzima intracelular presente nos eritrócitos, que contém 4 átomos de selênio por molécula. A GSH-Px representa mais de 75% do selênio sangüíneo (ALONSO, 1997). O fato de existir uma boa correlação entre a atividade enzimática nos eritrócitos e a concentração de 20

selênio, faz com que a GSH-Px seja usada para avaliar a deficiência deste mineral. Como a enzima é intracelular, normalmente ela é avaliada como unidades por miligrama de hemoglobina (U/mg de Hb) ou unidades por decilitro de hemácias (U/dL de hemácias). A deficiência de selênio é conhecida por estar relacionada a uma maior incidência de mastite, degeneração testicular, imunossupressão, aborto, retenção de placenta, miopatia cardíaca, doença dos músculos brancos entre outras. A GSH-Px pode ser usada para avaliar a melhor forma de suplementar o mineral e sua resposta frente a doenças e correlação com ganho de peso (OBLITAS et al., 2000). Pavlata e colaboradores (2001) perceberam que animais deficientes em selênio, quando submetidos a esforços físicos intensos, têm uma maior lesão tecidual e por conseqüência um nível mais elevado de outras enzimas como a AST, CK e LDH. 4.11 Lactato Desidrogenase (LDH) É uma enzima presente em vários tecidos, em particular no músculo esquelético, músculo cardíaco, fígado e eritrócitos, mas também nos rins, ossos e pulmões. Existem cinco isoenzimas conhecidas, que não são comumente analisadas nos laboratórios veterinários. Isoladamente a enzima não é específica para nenhum órgão. Qualquer intensidade de hemólise é prejudicial, pois o extravasamento de enzimas eritrocitárias incrementa a atividade total da LDH no plasma. Lesões musculares de etiologias variadas podem estar relacionadas ao aumento da LDH. Cardinet (1997) cita que a deficiência de vitamina E e selênio e a mioglobinúria são causas de aumento de LDH. Balogh (2001) demonstrou que, em cavalos de salto, a LDH aumentou imediatamente após o exercício e se manteve elevada após 24 horas, diferente da CK que teve um pico após o exercício, mas voltou aos valores basais após um dia. Por se apresentar como um bom indicador de lesão muscular. Garcia et al.(2000) utilizaram a LDH em conjunto com CK e AST para monitorar a intensidade de exercício de cavalos crioulos. A LDH pode ser utilizada para avaliar cardiomiopatias diversas (isquemia, endocardite bacteriana, dirofilariose, trombose aórtica e infarto do miocárdio). Normalmente a LDH aumenta menos rapidamente que a CK, mas também mantém os valores elevados por mais tempo. Após o infarto agudo do miocárdio, em humanos, a LDH atinge valores acima da referência após 16 horas, atingindo valores máximos em 40 horas e mantendo a atividade elevada por até 8 dias. Em medicina humana é comum analisar a isoenzima LDH1, e comparar com os 21

valores de outras isoenzimas para avaliar o infarto do miocárdio. LDH1, que normalmente não ultrapassa 40% da atividade total, após o infarto pode atingir a proporção de 50 a 60% da atividade total. Além disso, ela costuma estar em menor quantidade que a LDH2, situação que se inverte após o infarto (CHAPELLE, 1994). A LDH também pode ser utilizada em casos de meningite bacteriana. Nestes casos, ocorre um incremento da isoenzima LDH5 e um pequeno aumento da LDH4. (NAZIFI; REZAKHANI; BADRAN, 1997). Smith (1993) considera comum o aumento de LDH, em grandes animais, por problemas hepáticos como colelitíase, fasciolose e insufuciência hepática. 4.12 Lipase (Lip) Esta enzima normalmente é medida em conjunto com a amilase para diagnosticar pancreatite. Brobst (1997) cita que a lipase pode aumentar por doenças hepáticas e renais. Alem disso, a manipulação de vísceras durante cirurgia (estômago, fígado, intestino) pode ter o mesmo efeito. Também existe evidência de aumento da concentração de lipase pela administração de dexametasona. Quigley, Jackson e Haines (2001) demonstram a evidência de neoplasias hepáticas e pancreáticas produtoras de lipase. 4.13 Ornitina Carbamiltransferase (OCT) esta enzima ocorre em quantidades significativas somente no fígado, por isso sua especificidade para detectar problemas neste órgão. Tennant (1997) cita que a OCT tem uma sensibilidade semelhante à da ALT para o diagnóstico de necrose hepática no cão. Esta enzima pode estar relacionada também com a fasciolose nos bovinos. 4.14 Sorbitol Desidrogenase (SDH) É uma enzima com uma meia vida muito curta, de no máximo 24 a 48 horas e apresenta um pico logo após a lesão retornando aos valores normais em cerca de três dias. Por este motivo deve ser analisada rapidamente (MEYER; COLES; RICH, 1995). É particularmente utilizada em eqüinos para diagnosticar lesão hepatocelular aguda, mas também pode ser utilizada em ruminantes, substituindo a GLDH. 22

4.15 Tripsina Esta enzima é produzida inicialmente pelo pâncreas na forma de tripsinogênio, sendo convertido em tripsina pela enteroquinase intestinal ou pela própria tripsina. No plasma, ela pode ocorrer na forma de tripsina, tripsinogênio ou do complexo antitripsina. Um tipo de imunoensaio específico é capaz de detectar as três formas de tripsina, e é chamado de TLI (trypsin-like immunoreactivity ou imunorreatividade semelhante à tripsina). O aumento da TLI pode ocorrer nos casos de pancreatite aguda (KRAMER; HOFFMANN, 1997). Archer (1997) confirmou que a TLI apresentou valores significativamente maiores em cães com pancreatite. Em alguns casos os valores encontrados não apresentaram uma magnitude suficiente para um diagnóstico conclusivo (Dimski, 1999). 4.16 Outras Enzimas Algumas outras enzimas podem ser utilizadas na medicina veterinária. No entanto, devido aos custos elevados, dificuldade de realizar os testes ou à baixa especificidade que oferecem, acabam substituídas por outras enzimas. É o caso da aldolase. Esta enzima tem uma boa especificidade por lesões no fígado e nos músculos esquelético e cardíaco. A sua atividade sérica pode estar aumentada em hepatites virais, tumores hepáticos, infarto do miocárdio e lesões dos músculos esqueléticos. A dificuldade de realizar o ensaio de determinação da atividade da aldolase, faz com que seja substituída por outros testes mais fáceis e rápidos, como a AST, ALT, CK e LDH (BOGIN, 1994). A piruvato quinase (PK) pode ser utilizada para avaliar lesões musculares. Cardinet (1997) cita que a enzima pode auxiliar na identificação de suínos homozigotos para hipertermia maligna. Embora seja bastante utilizada na medicina humana, a fosfatase ácida (AcP) não é comumente avaliada na clínica veterinária. Em humanos, a enzima tem sua atividade sérica aumentada em doenças prostáticas (hipertrofia, prostatite e carcinoma), além de algumas doenças ósseas e hematológicas (GELLA, 1994). Em medicina veterinária ainda não existem resultados conclusivos a respeito de doenças prostáticas e a atividade sérica da AcP. A transcetolase é uma enzima intra-eritrocitária que pode estar aumentada em casos de necrose cerebrocortical ou na acidose lática nos bovinos (DIRKSEN; GRÜNDER; STÖBER, 1993). 23

5 CONCLUSÃO: A enzimologia tem uso corrente e garantido na medicina humana, infelizmente na medicina veterinária ainda não é utilizada na mesma proporção. A presença de alterações na atividade sérica pode dar informações muito úteis ao clínico de forma rápida e precisa. Sabe-se que muitas vezes o proprietário não dispõe de recursos financeiros para a realização de muitos exames. Esta talvez seja a principal limitação do uso de enzimas séricas como meio auxiliar de diagnóstico, uma vez que o ideal é que duas ou mais enzimas sejam avaliadas conjuntamente para aumentar a especificidade do teste. Por outro lado, a enzimologia pode oferecer informações suficientes para a conclusão de um diagnóstico de forma rápida e pouco traumática para o animal. Igualmente,é possível avaliar a extensão ou gravidade da lesão e fornecer um prognóstico mais preciso a partir de dados obtidos pela avaliação enzimática. Este trabalho teve o objetivo de demonstrar com mais clareza as limitações e possibilidades de uso das enzimas séricas, fornecendo ao clínico uma ferramenta a mais na difícil tarefa de construir o diagnóstico. 24

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