OBJETIO Medir as elocidades de transforação CINÉTICA ENZIMÁTICA Aaliar a influência de condições de reação (conc. de reagentes, enzias, teperatura, ph, etc..) nas elocidades de reação Correlacionar atraés de odelos ateáticos(epíricos) as elocidades das transforações co fatores que as afeta Caso particular da Cinética Quíica Otiização; controle e projeto de reatores ENZIMA ão catalisadores orgânicos protéicos, relatiaente específicos, produzidos por organisos ios. Disponibilidade coercial Classificação Natureza da reação catalisada ão proteínas co atiidade catalítica. Praticaente todas as reações que caracteriza o etaboliso celular são catalisadas por enzias. Coo catalisadores celulares, as enzias acelera a elocidade de ua reação, se no entanto participar dela coo reagente ou produto. Industriais (Ex: ailases) Analíticas (Ex: glicose oxidase) Médicas (Ex: asparaginase) Oxiredutases Transferases Hidrolases Liases Isoerases Ligases Noenclatura: sufixo AE adicionado a seu substrato http://www.che.qul.ac.u/iubb/enzye/ 4 Classificação Internacional das Enzias IMPORTÂNCIA INDUTRIAL Ailoglicosidase (A. niger) ------- glicose Produção de Proteases (B.subtilis) ---------- Detergentes Glicose isoerase (L.breis) ----------Frutose Inertase (. cereisiae) ------- Alientos (preine a cristalização do açúcar) 5 6
IMPORTÂNCIA INDUTRIAL CINÉTICA ENZIMÁTICA É a parte da enziologia que estuda a elocidade das reações enziáticas, e os fatores que influencia nesta elocidade. A cinética de ua enzia é estudada aaliando-se a quantidade de produto forado ou a quantidade de substrato consuido por unidade de tepo de reação. 7 8 Medida da elocidade Fatores que Afeta a Atiidade Enziática E P Teperatura ph H O catalase H O O Aelocidadedeconsuode[]ouforaçãode[P]ariacootepo Meso antendo constantes a teperatura e ph, a [E] pode diinuir deido a sua labilidade(produtos inibidores de sua ação catalítica) A elocidade da reação dee ser calculada, sepre que possíel no instante inicial t (instante e que as condições experientais são conhecidas) Há poré casos, e que a não pode ser edida (falta de técnicas experientais, equação quíica não totalente conhecida). Nestes casos, a elocidade da reação pode ser representada por ua elocidade édia de substancias escolhidas, ou ainda pela ariação de ua propriedade do sistea(iscosidade) A elocidade de reação auenta auento da energia cinética Depende dos grupos ionizáeis presente no sítio atios das enzias. 9 Fatores que Afeta a Atiidade Enziática Hipóteses Concentração da enzia Concentração do substrato O substrato e a enzia reage reersielente entre si forando u coplexo interediário chaado de coplexo enzia-substrato A elocidade de reação auenta co o auento da [E] Cinética de a orde A elocidade da reação auenta co auento da [] até u liite (saturação). Modelo cinético para explicar a influência das concentrações iniciais de [E] e [] na elocidade da reação. Michaelis-Menten A foração do coplexo se dá na proporção de ol de [] para cada ol de [E], produzindo ol do coplexo O coplexo forado se decopõe regenerando a enzia e forando produtos
E E E P endo: K constante de elocidade de foração do coplexo K constante de elocidade de dissociação do coplexo K constante de elocidade de decoposição do coplexo forando o produto ν elocidade de foração do produto Produto [P]: Balanço de assa [ P] d Coplexo [E] d[ E] Enzia [E]: E E [ E] [ E] [ E][ ] [ E] [ E] () () () Aplicando estado estacionário, na eq., ou seja d [ E] [ E] d [ E] [ E][ ] [ E] [ E] [ E][ ] () (4) ubstituindo a eq.() na eq.(4), tereos: [ E] Resolendo a eq.(5), tereos: ubstituindo a eq.(6) na eq.(), tereos: [ P] E [ ] d [ ] [ E] ( E [ E] )[ ] [ ] E [ ] (5) (6) (7) (8) [ ] Equação de Michaelis-Menten 4 [ ] Equação de Michaelis-Menten Por que na região de eleada [] a elocidade é ia e constante? endo: ν elocidade da reação elocidade ia da reação K constantedemichaelis. K [ ] Quanto enor o alor de K aior será a afinidade da E pelo K É a concentração de substrato a qual corresponde a ua elocidade igual a etade da ia 5 6 Deterinação das Constantes Cinéticas ( e ) O étodo ais utilizado foi a linearização proposta por Lineweaer-Bur (duplo recíproco) e consiste e inerter abos os lados da equação de Michaelis Deterinação das Constantes Cinéticas ( e ) O étodo proposto por Hanes, consiste siplesente e ultiplicar por []abos os lados da equação de Michaelis Y b ax Y ax b 7 8
A título de exeplo, considereos os alores da Tabela que nos fornece os dados experientais de ua reação enziática. Tabela : elocidade inicial de foração do produto e função da concentração inicial do substrato. (g/l) ν(g/l.h),5,78,5,5,,66,5,9 4,,5 7,5,57 Deterinar os alores das constantes cinéticas da reação aplicando O étodo de Lineweaer-Bur e de Hanes. Influência da Presença de u Inibidor Os inibidores são substâncias que pode diinuir a elocidade da reação. Copetitia O inibidor se liga no eso sítio de ligação do substrato O efeito é reertido auentando-se a concentração de substrato Reersíel Inibição Irreersíel Não-Copetitia O inibidor liga-se reersielente à enzia e u sítio próprio de ligação Depende apenas da concentração do inibidor. 9 Modelos de Ligação Enzia-ubstrato Mecaniso para inibição COMPETITIA Mecaniso para inibição NÃO-COMPETITIA E I b EI E E P I, app I I [ ] I α I [ ] I ax, app ax I I α Não ocorre inibição Efeito do [I] é auentar pelo fator α Contornado pelo auento de [] Não odifica a O inibidor se liga e abos (E ou E) e u sítio distinto do sítio atio O efeito do [I] é diinuir a pelo fator α Nenhua udança no 4 4
Influência da Presença de u Inibidor nas Constantes Cinéticas (K e ) Tipo de Inibidor Ligação no itio Atio Efeito Cinético e Inibidor Nenhu Não altera as constantes Copetitio Copete co o pelo eso sítio atio(reersíel pelo ) Auentar K se alterar a elocidade Não-Copetitio O inibidor ocupa outro sítio regulador da enzia (não reersíel pelo ) Não altera o K e a elocidade decresce co proporcionalentea[i] 5 6 Na tabela estão ostrados os dados experientais obtidos após a reação de hidrólise do aido co a enzia α-ailase na ausência e na presença de altose. Pede-se: a) Representação gráfica da influência do substrato sobre a elocidade de hidrólise do aido, na presença e na ausência de altose; b) Representação gráfica de Lineweaer-Bure deterinação da constante de Michaelis (K M ) e a elocidade ia ( M ), para abas condições ubstrato (g/l) elocidade de hidrólise (g/in) ubstrato elocidade de hidrólise (g/in).56 77.4 98. 7.7 7.4 9 9.4 5.6 6.5 8. 9 4.55 58.9 6. 8.7. 5.4 5.6 79..4 8.9 4.8 7.9.89 7.56 65.67 4..4 5.7 8.8 7 8 9 5
Resolução Resolução - Coportaento 8 Hidrólise do aido 8 Hidrólise do aido 6 6 4 4 5 5 [] K M 5 5 [] 4 Linearização Resolução - Linearização / / / /.8.99...89...4..8.9.6....7.58...9.78.6.49.6.4.4.59.7.8.54.599.9.47.9.47.4 /.5..5..5..5 Hidrólise do aido y.5x.98 y.69x.78....4.6.8.. [] Linear () Linear () 5 6 6
/ / / / -.89. -...8.99...89...4..8.9.6....7.58...9.78.6.49.6.4.4.59.7.8.54.599.9.47.9.47 7 8 KM seelhante Hidrólise do aido. y.6x.98 elocidades ias diferentes.5. /.5. y.7x.78.5. -.4 -....4.6 -.5 /[] Linear () Linear () 9 4 CINÉTICA ENZIMÁTICA 4 7