Engenharia Bioquímica

Transcrição

1 Engenharia Bioquímica Cinética Enzimática Mestrando: Mateus Vinícius Casagrande da Silva Professor Doutor João Batista de Almeida e Silva

2 Conceitos e revisão sobre Enzimas

3 O que são enzimas? Definições São proteínas, exceto por um grupo de RNA catalíticos, que possuem a finalidade de catalisar reações das mais diversas possíveis (hidrólise, esterificação, transesterificação, etc.) No seres vivos são responsáveis pelos processos bioquímicos, catalisam reações de degradação ou sintetizam lipídeos, proteínas, sacarídeos, etc. As fontes de enzimas utilizadas industrialmente, são produzidas em sua maioria por microrganismos pois há a possibilidade da produção por processos fermentativos em grande escala com a regularidade e a simplicidade dos requerimentos nutricionais necessárias, embora também possam ser produzidas a partir tecidos animais e vegetais

4 Fontes produtoras Animal: Pâncreas de animais (apresenta atividade amilolítica, proteolítica e lipolítica) Pepsina da mucosa de estômago de porco (Pepsina). Catalasede fígado e sangue de boi ou porco. Vegetal: Papaína do látex do mamão verde (protease) Malte que é rico em proteases e amilases (entre outras). Microbiana (80-85% do mercad0): Bactérias, fungos filamentosos e leveduras Podem ser extracelulares e intracelulares.

5 Como são aplicadas Basicamente existem duas maneiras de se utilizar enzimas em bioprocessos: Podem ser utilizadas por meio de células de microrganismos, como por exemplo a saccharomyces cerevisiae, que hidrolisa a sacarose em glicose e frutose, e depois metaboliza esse açúcares produzindo etanol. Podem ser separadas de microrganismos e posteriormente aplicados nos processos bioquímicos, podendo ser imobilizadas ou na forma livre, como por exemplo a Lipase de cândida rugosa, inicialmente são produzidos as células em biorreatores, posteriormente são rompidas e as enzimas são extraídas, separadas e armazenadas, para depois serem aplicadas diretamente em processos

6 Classificação (IUPAC) Classes Ação catalítica Subclasses Observações Oxidoredutases Reações de oxidação-redução Desidrogenases Requere co-substrato. Peroxidases Transferases Reações de transferência de duas moléculas. -Transaminases. -Quinases. Hidrolases Reações de hidrólises de ligações -Lipases covalentes. -Proteases. -Amilases. Liases Reações de clivagem de liquações -Aldolases. não-hidrolíticas. -Fumarases. -Carboxilases. Isomerases Reações de isomerização. -Racemases. -Cis-trans isomerases. -Mutases. Ligases Reações de formação de ligações. Formadoras de ligações: -Carbono-oxigênio. -Carbono-carbono. Reação de dois substratos na qual um precisa ser ativado. Reação de dois substratos sendo um deles H 2 O. Quando se tem um substrato há quebra de ligação. Quando se tem dois substratos há formação de ligação. Reação de um substrato somente. Requere ATP como co-substratoe dois substratos.

7 Vantagens em utilizar enzimas

8 Aplicações industriais Sabões e detergentes Produção de biodiesel Ésteres para cosméticos Bebidas alcoólicas

9 Catalisador Bioquímico versus catalisador químico

10 Biocatálise Enzima altera o mecanismo de reação diminuindo a energia de ativação.

11 Como as enzimas provém de seres vivos, são sensíveis a praticamente os mesmo fatores que os afetam como: Temperatura ph Pressão Pode sofrer inibição por substrato, produto e até mesmo por enzimas. Sua atividade catalítica depende desses fatores, além disso a enzima sofre o fenômeno de desnaturação, perdendo sua conformação original e atividade catalítica.

12 Efeito do ph Os ph extremos modificam irreversivelmente a estrutura das enzimas, quer devido a desnaturação, quer devido a alterações na ligação entre apoenzima e coenzima As enzimas podem apresentar dois tipos de curva de atividade em função do ph

13 possívelefeitodumaalteraçãodephaoníveldocentroativodeumenzima: A. ph óptimo B. ph inferior ao óptimo (maior [H+])

14 NemtodasasenzimastêmomesmopH.Porexemplo,apepsina,quehidrolisa proteínas a péptidos no estômago, extremamente ácido, e a tripsina, que hidrolisa péptidos a aminoácidos nas condições alcalinas do duodeno, têm óptimos de ph adaptados ao seu ambiente Em laboratório, quando estudamos a atividade de um enzima, temos que ter o cuidado de incluir um sistema tampão no meio de ensaio, de modo a estabilizar o ph;

15 ph 5 e 8 = não afeta a atividade; Declínio entre ph 6,8-8 e 6,8-5 = forma iônica não adequada; 5 > ph > 8 = inativação irreversível.

16 INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA T velocidade de reação = energia cinética; T muito elevadas = desnaturação da enzima Rompidas as pontes de hidrogênio alterações estruturas = nova conformação; T desnaturação pouco acima da T ótima.

17 Enzimas PM 1 cadeia polipeptídica e pontes dissulfeto = estáveis ao calor; Efeito da T = ph, força iônica e a presença ou ausência de ligantes; Substratos protegem a enzima da desnaturação.

18 INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA K é função da T Lei de Arrhenius A influência da temperatura na constante de velocidade k, obedece a lei Arrhenius k = k 0 e α RT

19 INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA Enzimas são termolábeis reação enzimática = inativação térmica = k ' 0 β RT Efeito da T na velocidade das reações coeficiente de temperatura e Velocidade quando a T 10ºC. k ' 2,3 R T2 T1 logq10 = 10 O Q 10 (coeficiente de temperatura) representa o fator pelo qual a velocidade das reações enzimáticas (ou de outro processo biológico) vem multiplicada em consequência de um acréscimo de temperatura de 10 C. O Q 10 das reações enzimáticas situa-se entre 1 e 2. E a

20 Mecanismo de Reação Há dois tipo de modelos que explicam o mecanismo de reação enzima-substrato: 1) Chave-fechadura Modelo clássico, o substrato liga-se à a enzima pelo encaixe geométrico, onde a enzima é a fechadura e o substrato é a chave. 2) Encaixe induzido Modelo mais atual, o substrato liga-se à enzima por meio da conformação de ambas as moléculas de enzima e substrato, modelo mais dinâmico.

21 Modelos de mecanismo No Mecanismos de reação a enzima (E) liga-se ao substrato (S) formando o complexo enzima-substrato (ES) que se converte no complexo enzima-produto (EP) dissociando-se em enzima e produto. E+S ES EP E+P

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23 Cinética Enzimática Na maior parte das preparações a concentração real da enzima é desconhecida. Consequentemente, a quantidade de enzima presente só pode ser expressa em termos de sua atividade. Atividade enzimática: Uma unidade (U) de atividade é a quantidade de enzima que catalisa a transformação de 1 micromol de substrato, ou a formação de 1 micromol de produto por minuto Exemplo: Lipase de cândida rugosa, sua atividade pode ser expressa em atividade hidrolítica (método da hidrolise do azeite de oliva). Mas também pode ser expressa em atividade de esterificação, por meio de esterificação de etanol e ácido oleico. A unidade de medida possui a sigla U (ou UI unidades internacionais) ou U/g

24 Determinação dos Parâmetros Cinéticos (Km e Vmax) Equação cinética de Michaelis-Menten: Km Constante de michaelis-menten= expressa a afinidade enzima-substrato (constante de dissociação enzima-substrato. Vmax = velocidade máxima da enzima na concentração de substrato. (saturação). [S] = Concentração de substrato. V = Taxa da velocidade de reação.

25 Importância: Determina o valor de Km para comparar com outras enzimas (afinidade) O limite bioquímico possível para uma velocidade reacional dado um concentração específica. Descreve o comportamento da enzima em diferentes concentrações de produto.(influência da concentração de substrato).

26 A saturação acontece porque, à medida que é aumentada a concentração de substrato, aumenta também a quantidade de enzima presente sob a forma de complexo enzima-substrato (ES). À velocidade máxima, Vmax, todos os centros ativos estão ocupados (saturados) com substrato, ou seja, não existe enzima livre para ligar mais substrato e a concentração de complexo ES é igual à concentração de enzima.

27 O gráfico de velocidade face a[s] não é linear. Embora a baixas concentrações de substrato se mantenha linear, vai curvando à medida que aumenta a concentração de substrato. Antes da chegada dos computadores, que permitem ajustar regressões não lineares de forma simples, podia chegar a ser realmente difícil estimar os valores de Km e Vmax nos gráficos não lineares.

28 Lineweaver Burk

29 Para aplicar esta equação, o inverso a taxa de velocidade de reação em função do inverso da concentração deve ser linear A função tende a ser hiperbólica, estabilizando na região onde a concentração de substrato corresponde ao Vmax. Km = Vmax/2

30 Exercício Uma lipase de Cândida Rugosa, foi utilizada para hidrolisar azeite de oliva em seus respectivos ácidos graxos, em diferentes concentrações de substrato, e a sua taxa de velocidade de reação foi mensurada para cada concentração de substrato, conforme a tabela abaixo: Velocidade do produto formado (micromol/min) Concentração de substrato (mm) 0,21 1,5 0,24 2,0 0,28 3,0 0,33 4,0 0,40 8,0 0,45 16,0

31 Inventeros dados da tabela anterior 1/v 1/[S] 4, , , ,5 3, , , ,25 2,5 0,125 2, ,0625

32 Linearização Corr: 0,991 5 B = 4,2663 A = 1, /V 3 2 0,0 0,3 0,6 1/[S]

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34 Inibição Enzimática Inibidores enzimáticos são moléculas que reduzem ou eliminam a atividade catalítica das enzimas. Podem encontrar-se dois tipos: Reversíveis: quando a remoção do inibidor restaura a atividade enzimática; São classificados como competitivos, acompetitivos, não-competitivos e mistos, segundo o efeito que produzam nas constantes cinéticas Km e Vmax. Este efeito dependerá da união do inibidor à enzima E, ao complexo enzima-substrato ES ou a ambos. É caraterizada por uma constante de equilíbrio Ki, que é medido pela afinidade do inibidor com a enzima. Irreversíveis: quando o inibidor inativa de modo permanente a enzima.

35 Inibição reversível ES = Complexo enzima-subtrato E = Enzima S = Substrato P = produto I =inibidor Ki = Constante de afinidade do inibidor pela enzima

36 Existem diversos tipos de inibição reversível: Não-competitiva Competitiva Acompetitiva Mistos Por Substrato

37 E + S k 1 k 2 INFLUENCIA DO EXCESSO DE SUBSTRATO ES k 3 ES + S ES2 (Complexo não reativo) k 4 k 5 ES E + P V V Vmax V = VmaxS S 2 k m + S + k i ondekiéaconstantedeinibição; S Para encontrar as constantes faz-se a inversão segundo Lineweaver-Burk

38 INFLUENCIA DO EXCESSO DE SUBSTRATO 1 V = 1 Vmax + k m Vmax 1. S + 1 SX VmaxK i 1ª Hipótese: para valores de S<<ki a equação se reduz em, 1 V = 1 Vmax + k m 1. Vmax S 1/V K m /v max -1/k m 1/S

39 INFLUENCIA DO EXCESSO DE SUBSTRATO 1 V = 1 Vmax + km Vmax 1. S X + 1 S VmaxK i 2ª Hipótese: para valores de S>>k m a equação se reduz em, 1 V = 1 Vmax + 1 VmaxKi S 1/V 1/V max 1/v max K i S OsvaloresdeV max determinadosemambososgráficosdevemserpróximos.

40 Não competitiva Ocorrequandoummoléculaouíonpodeseligar emum segundo localnasuperfícieenzimática(não no sítio ativo). Isto pode distorcer a enzima tornando o processo catalítico ineficiente. O inibidor não competitivo pode ser uma molécula que não se assemelha com o substrato, mas apresenta uma grande afinidade com a enzima. É o mecanismo inverso do inibidor competitivo, porqueinibealigaçãodocomplexoesenãodaenzimalivre. OefeitodareaçãomodificaavelocidadeeoKmpermanececonstante. Diminui Vmax. Km se mantém.

41 Não competitiva

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43 INIBIÇÃO NÃO COMPETITIVA K I E + S K S ES E + P + + I I EI + S K I K 2 [ E][ I ] K = = [ ES ][ I ] [ EI ] [ EIS ] K S S EIS Michaelis-Menten v I = K m ( 1 + Vmax[ S] [ I ] ) + [ S](1 + K I [ I K ] ) I v i Lineweaver-Burk 1 v = K V m max (1 + [ I K ] ) I 1 [ S] + 1 V max (1 + [ I K ] ) I

44 INIBIÇÃO NÃO COMPETITIVA Equação da velocidade: V = V máx K m 1 + K [ S] [ I ] + [ S] I 1 + [ I ] K I Lineweaver-Burk 1 V K [ ] = m I [ I ] 1 + [ ] 1 + Vmáx K I S Vmáx K I

45 INIBIÇÃO NÃO COMPETITIVA 1- sem inibidor 2- com inibidor na concentração [I1] 3- com inibidor na concentração [I2] > [I1]

46 Competitiva Uma molécula apresenta estrutura semelhante ao substrato da enzima que se liga para realizar a catálise, ela poderá aceitar esta molécula no seu local de ligação, mas não pode levar ao processo catalítico, pois ocupando o sítio ativo do substrato correto. Portanto o inibidor compete pelo mesmo local do substrato. OefeitodareaçãomodificaoKm,masnãoalteraavelocidade. Resumindo: Compete com o substrato pelo sitio ativo. Km aumenta Vmnãoéalterada

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48 INIBIÇÃO COMPETITIVA Linearizando pelo método Lineawer-Burk: Equação de Michaelis e Menten [ S] V = V máx K 1+ [ I ] + [ S] K Lineweaver-Burk 1 1 = V V máx + m K m 1 + V [ I ] máx K I I 1 [ S]

49 v v INIBIÇÃO COMPETITIVA Dividindo por i Obtém-se a relação entre a velocidade de reação sem inibidor e com inibidor. s v = V k + s v k m m s = 1+ v i = V. i vi ki ( km + s) km(1 + ) + s k i Verifica-se que é possível trabalhar com concentrações de substratos relativamente altas (matematicamente, s ) a influência do inibidor pode tornar-se desprezível.. i v i V V 0 I = 1+ K I K m ( [ ]) [ I ] K + S m [S] = influência do [I] desprezível.

50 INIBIÇÃO COMPETITIVA v i 1- sem inibidor 2- com inibidor na concentração [I1] 3- com inibidor na concentração [I2] > [I1]

51 acompetitiva Ocorre em altas concentrações de substrato, onde o inibidor bloqueia do complexo enzima-substrato. Nessecasoosítiodoinibidorsósetornaativoquandoo complexoesestáformado. Diminui Km (pois favorece a Formação do complexo ES. Diminui Vmax.

52 INIBIÇÃO ACOMPETITIVA E + S ES E + P + I K S K 2 K I V EIS ) ] [ (1 1 ] [ 1 1 ] [ ] [ 1 ] [ ] [ 1 max max max I m I m i K I V S V K v S K I K S K I V v + + = = Lineweaver-Burk Michaelis-Menten

53 INIBIÇÃO ACOMPETITIVA 1- sem inibidor. 2- com inibidor na concentração [I1] 3- com inibidor na concentração [I2] > [I1]

54 Inibição mista Corresponde a junção de um ou mais modelos de inibição já descritos, Corresponde a junção de um ou mais modelos de inibição já descritos, podendo afetar a Vmaxe o Km da equação de Michaelis-Menten.

55 INIBIÇÃO IRREVERSÍVEL Combinam-se com um grupo funcional destruição; União covalente inibidor e enzima. V máx e K m =

56 INIBIÇÃO IRREVERSÍVEL Equação de Michaelis e Menten: V I ( V k [ EI ) = ] máx 3 K m [ S] + [ S]

57 INIBIÇÃO IRREVERSÍVEL Lineweaver-Burk: 1 V I = V máx 1 K 3 + K [ EI] V K [ EI ] [ S] máx m 3 1