UNESP - INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS

UNESP - INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA CURSO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS- 2º ANO ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS

LEMBRETES IMPORTANTES 2 1. Não deixe seus pertences sobre as mesas onde os trabalhos práticos são realizados. 2. Não fume e não coma no laboratório. Evite levar à boca qualquer objeto (lápis, rótulo, etc.). 3. Não use frascos do laboratório para tomar água. 4. Comunique imediatamente aos instrutores qualquer acidente (derramamento de culturas sobre a mesa ou assoalho, ferimentos de qualquer espécie, aspirações de culturas na boca, etc). 5. Coloque sempre nos recipientes indicados o material contaminado. 6. Lave bem as mãos com desinfetante antes de deixar o laboratório. 7. Antes de iniciar suas atividades e depois de terminá-las, limpe, com desinfetante, o seu local de trabalho. 8. Durante a permanência no laboratório de aulas práticas é necessário o uso de avental. MATERIAIS E INSTRUMENTOS COMUMENTE UTILIZADOS NAS AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA 1. Alça e agulha de platina 2. Meios de cultura 3. Placas de Petri e tubos de ensaio 4. Pipeta Pasteur 5. Microscópio 6. Lâminas de vidro 7. Estufa e banho-maria 8. Autoclave e Forno Pasteur CUIDADOS PARA SE EVITAR CONTAMINAÇÃO DE CULTURAS 1. A alça e agulha de platina devem ser flambadas, isto é, aquecidas na chama do bico de Bunsen até se tornarem vermelhas, antes e depois de qualquer operação de semeadura. A flambagem é mais facilmente conseguida mantendo-se a agulha ou alça num ângulo de 45º em relação à mesa de trabalho. Antes da coleta do material, deve-se resfriar o instrumento, na parede do tubo, no próprio meio estéril, ou simplesmente aguardando o seu desaquecimento natural por alguns segundos. 2. Relativamente às semeaduras procedidas em tubos de ensaio, exige-se flambar a boca dos mesmos após a retirada e antes da colocação do tampão de algodão. O tampão de algodão deve ser segurado pelo dedo mínimo da mão direita e nunca deixado sobre a mesa de trabalho. 3. As pipetas são previamente esterilizadas e embrulhadas em papel. Para sua utilização e ao mesmo tempo evitar que se contaminem, deve-se torcer o papel na região central da pipeta, retirar primeiramente a parte superior do papel e depois a

3 inferior (ponta da pipeta). Depois de utilizada, a pipeta deverá ser colocada dentro de um recipiente de vidro, contendo solução de desinfetante. 4. Todo recipiente (placas de Petri ou tubos de ensaio) com cultura ou meio estéril deverá ser manuseado com cuidado de modo a não ficarem abertos e expostos ao ambiente. Com esta medida e mais a exigência de abri-los somente próximo ao bico de Bunsen em tempo suficiente para a semeadura, colheita do material ou simples inspeção, será evitada a sua contaminação por microrganismos do ar. Uma vez semeados, devem ser incubados em estufa. As placas de Petri devem ser colocadas na estufa com as tampas voltadas para baixo. OBSERVAÇÃO DE LÂMINAS AO MICROSCÓPIO Nos exercícios de bacterioscopia, as lâminas contendo esfregaços de material fixado e corado sempre serão observadas através de objetiva de imersão. Após a observação da lâmina, esta deverá ser colocada em recipiente com detergente, especificamente destinado a este fim. Depois de utilizados, os microscópios deverão ser limpos e devidamente acondicionados.

Bacteriologia Geral 4 MORFOLOGIA E COLORAÇÃO DAS BACTÉRIAS I - Morfologia 1. As bactérias de um modo geral, apresentam-se sob a forma de: a) cocos: células esféricas b) bacilos: células cilíndricas, em formas de bastonetes c) espirilos: células espiraladas d) vibriões Estas formas básicas estão sujeitas a variações, caso em que são denominadas de formas pleomórficas ou formas de involução. 2. Agrupamentos Segundo o (s) plano (s) de divisão celular e a disposição das células entre si, as bactérias podem apresentar-se em agrupamentos: a) diplococos b) estafilococos c) estreptococos d) estreptobacilos II - Coloração 1. Coloração de Gram Este método de coloração permite a classificação das bactérias em dois grandes grupos: Gram positivas e Gram negativas: Gram positivas: são bactérias que não se deixam descorar quando submetidas à ação de solventes orgânicos (álcool, éter, etc.) e permanecem com a cor do cristal violeta. Bactérias Gram positivas cor azul Gram negativas: São, portanto, aquelas que se deixam descorar pelo solvente orgânico tomando a cor do corante de contraste (safranina ou fucsina). 2. Coloração de Ziehl-Neelsen Bactérias Gram negativas cor vermelha Constitui um método específico para a coloração das micobactérias (ex.: bacilo de Hansen e bacilo da tuberculose). Tais bactérias se caracterizam por resistirem à descoloração por uma mistura de álcool-ácido clorídrico, depois de tratadas com fucsina fenicada e azul de metileno, permanecendo com a cor da primeiro corante. Por apresentarem esta propriedade, estas bactérias são denominadas bacilos álcool ácido resistentes (BAAR). B.A.A.R cor vermelha

EXERCÍCIOS 5 A) Coloração de Bactérias pelo Método de Gram Material - Culturas A,B,C,D e E. - Lâminas bem limpas - Alça de platina - Solução fisiológica - Bateria de Gram: violeta genciana, lugol, álcool, fucsina Técnica 1. Com o auxílio da alça de platina, fazer esfregaços bem finos sobre a lâmina de microscopia. Esperar secar. 2. Fixar os esfregaços, passando a lâmina três vezes sobre a chama do bico de Bunsen. 3. Deixar a lâmina esfriar e cobrir os esfregaços com a solução de violeta genciana. Esperar 1 minuto. 4. Escorrer a violeta genciana e cobrir os esfregaços com lugol. Esperar 1 minuto. 5. Escorrer o lugol e descorar os esfregaços pelo álcool. Para isto, deixe o álcool cair, gota a gota, sobre a lâmina, mantendo-a inclinada. Considerar os esfregaços suficientemente descorados quando o álcool não mais retirar o corante dos mesmos. 6. Lavar a lâmina em água corrente. 7. Cobrir os esfregaços com a solução de fucsina, esperar de 30 segundos a 1 minuto. 8. Lavar a lâmina em água corrente. Secar com auxílio de papel de filtro. 9. Observar ao microscópio e desenhar. Lâmina A Morfologia Coloração Agrupamento Lâmina B Lâmina C Morfologia Coloração Agrupamento Morfologia Coloração Agrupamento

6 Lâmina D Lâmina E Morfologia Coloração Agrupamento Morfologia Coloração Agrupamento B) Coloração de Bactérias pelo Método de Ziehl-Neelsen Material - Lâmina de microscopia contendo esfregaço de escarro - Bateria de Ziehl-Neelsen: fucsina fenicada, álcool-ácido e azul de metileno. Técnica l. Cobrir a lâmina com fucsina fenicada. Com auxílio do bico de Bunsen, aquecer a preparação até a emissão de vapores. Manter o aquecimento durante 5 minutos. Não deixar a fucsina ferver ou secar. 2. Escorrer a fucsina e descorar completamente pelo álcool-ácido. 3. Lavar em água corrente. 4. Cobrir o esfregaço com a solução de azul de metileno. Esperar entre 30 segundos a 1 minuto. 5. Lavar em água corrente e secar com papel de filtro. 6. Observar ao microscópio e desenhar.

ESTRUTURAS DA CÉLULA BACTERIANA 7 a) Estruturas externas Flagelos Fímbrias ou pili Cápsula Parede celular Membrana citoplasmática b) Estruturas internas Esporo Mesossomos Ribossomos Cromossomos Grânulos de reserva Plasmídios EXERCÍCIO Demonstração de algumas estruturas da célula bacteriana. Observar lâminas previamente preparadas das seguintes estruturas da célula bacteriana: parede celular, cápsula e esporos. Desenhar. Cápsula Esporos MEIOS DE CULTURA E CONDIÇÕES FÍSICAS DE CULTIVO BACTERIANO A) Meios de Cultura Para o cultivo e identificação das bactérias são utilizadas soluções e substâncias nutritivas, denominadas meios de cultura que podem ser classificados com base na sua constituição, ou seja, quanto às substâncias nutritivas que os compõem, quanto ao seu estado físico e quanto à capacidade seletiva e diferencial que apresentam. Quanto às Substâncias Nutritivas: 1. Meios Sintéticos: quando as substâncias que os compõem são químicamente definidas e a concentração e características de cada ingrediente são conhecidas com exatidão. 2. Meios Simples: quando constituídos somente de substâncias essenciais para o crescimento de algumas bactérias. 3. Meios Complexos: quando se adicionam ao meio simples, substâncias orgânicas complexas.

8 Quanto ao Estado Físico: 1. Meios Líquidos: também denominados caldos. 2. Meios Sólidos: quando se adiciona ao caldo l,5% a 2% de ágar. 3. Meios Semi-sólidos: quando se adiciona ágar ao caldo, na concentração igual ou menor que 0,5%. Quanto à capacidade seletiva e diferencial: 1. Meios Enriquecidos: são meios simples adicionados de certas substâncias como soro, sangue, extrato de levedura, etc. Estes meios servem para o cultivo de bactérias que necessitam de substratos complexos. Ex: meios de ágar sangue, de ágar chocolate, de ágar soro, etc. 2. Meios Seletivos: são meios de cultura contendo substâncias que impedem o crescimento de certas bactérias sem inibir o crescimento de outras. Ex: Meios de MacConkey, de Tetrationato, de Verde Brilhante, etc. 3. Meios Diferenciais: são aqueles que contêm substâncias que, quando utilizadas, indicam certas características da bactéria. Ex: a) O sangue quando adicionado ao meio de cultura, indica se uma bactéria é hemolítica ou não. Nesse caso, o meio além de enriquecido é também diferencial. Ex: meio de ágar-sangue. b) A lactose quando adicionada ao meio juntamente com um indicador de ph, permite distinguir as bactérias que fermentam esse açúcar das que não o fermentam. Ex: meio de MacConkey. 4. Meios de Enriquecimento: são aqueles que inibem o crescimento de certas bactérias, porém favorecem o crescimento de outras. Ex: meios de tetrationato e de selenito permitem maior crescimento de bactérias do gênero Salmonella. 5. Além desses, existem outros meios de cultura, como por exemplo meios para conservação de bactérias, meios para a contagem do número de bactérias, etc. B) Condições Físicas de Cultivo Além do meio de cultura, outros fatores devem ser levados em consideração para o cultivo de bactérias, tais como: 1. ph do meio de cultura: deve ser geralmente em torno de 7. 2. Temperatura de crescimento: geralmente 37ºC Quando as bactérias crescem em temperaturas baixas (10 a 20ºC) são denominadas de psicrófilas. Quando as bactérias crescem em temperaturas médias (20 a 40ºC) são denominadas de mesófilas. Quando as bactérias crescem em temperaturas mais altas (50 a 60ºC) são denominadas termófilas. 3. Teor de Oxigênio: a) Bactérias aeróbias estritas: são aquelas que só crescem na presença de oxigênio. b) Bactérias anaeróbias estritas: crescem somente na ausência de oxigênio. c) Bactérias anaeróbias facultativas: crescem tanto na presença como na ausência de oxigênio. d) Bactérias microaerófilas: crescem somente em atmosfera com baixo teor de oxigênio. EXERCÍCIOS A) Necessidades nutritivas de algumas bactérias Material - Cultura A - Cultura B - Cultura C - Caldo sintético - Caldo comum - Caldo glicosado (caldo comum mais glicose) - Alça de platina Técnica l. Semear cada uma das 3 culturas bacterianas nos diferentes meios. 2. Deixar na estufa a 37ºC até o dia seguinte. 3. Verificar a presença de crescimento (turvação do meio).

4. Anotar os resultados. 9 Cultura A B C Crescimento em caldo sintético caldo comum caldo glicosado B) Dependência do oxigênio para o crescimento bacteriano Material - Meio de Tiogel - Caldo simples - Culturas A, D e F - Pipeta Pasteur - Alça de platina Técnica Com a pipeta Pasteur, semear cada uma das culturas em tubos de tiogel. Colocar todos os tubos na estufa. No dia seguinte, observar os tubos, verificando, no meio de tiogel, a localização do crescimento e, no caldo simples, se houve ou não crescimento. Culturas A D F Local de crescimento no meio de tiogel Superfície Toda extensão do Meio Base do Meio ALGUMAS ATIVIDADES BIOQUÍMICAS DAS BACTÉRIAS e MOVIMENTO BACTERIANO Depois de estudarmos a forma, coloração, necessidades nutritivas e outras características (temperatura ótima de crescimento, relação com o oxigênio, etc.) de uma bactéria, torna-se necessário conhecer as suas atividades bioquímicas para que possamos determinar a família, gênero ou espécie da bactéria em estudo. Os métodos utilizados para este fim são qualitativos e variam de acordo com o tipo de atividade que se pretende pesquisar. Estudaremos aqui alguns dos métodos de interesse geral, deixando para o momento oportuno aqueles específicos para determinados grupos de bactérias. De modo geral, quando estudamos as atividades bioquímicas de uma bactéria, procuramos verificar, também, se ela é móvel ou imóvel, o que podemos fazer pela observação do seu tipo de crescimento em ágar semi-sólido. Já vimos que o movimento da maioria das bactérias depende de seus flagelos, e a verificação da presença destas estruturas, indiretamente feita pela prova de motilidade, é bastante importante para a sua identificação. EXERCÍCIOS

A) Pesquisa da Catalase 10 Princípio A catalase é uma enzima produzida por certas bactérias, que desdobra a água oxigenada (H 2 O 2 ) em água (H 2 O) e oxigênio (O 2 ). Para pesquisá-la, basta colocar algumas gotas de água oxigenada sobre a cultura. Estando a catalase presente, haverá o desprendimento de bolhas, indicando a presença de oxigênio no meio. Material - Cultura A em caldo - Cultura B em caldo - Água oxigenada a l0% Técnica Colocar na cultura A algumas gotas de água oxigenada e verificar se há ou não aparecimento de bolhas. Anotar os resultados e fazer o mesmo com a cultura B. Catalase Gênero Cultura A Cultura B B) Pesquisa de Citocromo-oxidase Princípio A citocromo-oxidase é a enzima que oxida o citocromo C. A presença do citocromo C é demonstrada tratando-se a cultura com uma solução de p-fenileno-diamina. Quando presente, a p-fenileno-diamina é oxidada e há o surgimento de cor vermelha que muda gradativamente para azul, pelo contato com a luz. Quando ausente, a cor do crescimento não se altera. Material - Cultura C em ágar inclinado - Cultura D em ágar inclinado - Papel de filtro - p-fenileno-diamina (solução aquosa a 1%) - alça de platina Técnica 1.Com a alça de platina, retire um pouco do crescimento da cultura C e coloque sobre o papel de filtro. Faça o mesmo com a cultura D, em outro ponto do papel. 2.Coloque uma gota da solução de p-fenileno-diamina em cada uma das culturas 3.Observe a ocorrência de variação de cor nas duas culturas. O aparecimento da cor vermelha indica a presença de citocromo-oxidase. Oxidase Gênero Cultura C Cultura D

c) Pesquisa do Movimento Bacteriano (prova de motilidade) 11 Princípio As bactérias flageladas crescem além do ponto de inóculo ( picada ), quando semeadas em ágar semi-sólido com uma agulha de platina. As bactérias que não possuem flagelos crescem apenas no ponto de inóculo. Material - Tubo com ágar semi-sólido - Cultura C - Cultura F - Agulha de platina Técnica 1. Inocular, por picada, as culturas C e F (uma em cada tubo de ágar semi-sólido). 2. Incubar a 37ºC até o dia seguinte. 3. Observar o crescimento. Resultado positivo - crescimento bacteriano além do ponto de inóculo negativo - crescimento bacteriano apenas no ponto de inóculo 4. Anote os resultados. Cultura C Cultura F Motilidade gênero CONTROLE DE POPULAÇÕES BACTERIANAS I - Ação dos agentes físicos sobre as bactérias O calor e várias formas de radiação, bem como outros processos físicos, são frequentemente utilizados com a finalidade de destruir bactérias e outros microrganismos. Verificaremos a ação do calor úmido sobre duas bactérias, uma esporulada e outra não esporulada. EXERCÍCIOS A) Ação da temperatura, em função do tempo, sobre cultura bacteriana não esporulada Material - Cultura A em ágar inclinado (bactéria não esporulada) - Tubo contendo 1 ml da solução salina esterilizada - Placa de Petri contendo ágar nutriente - Banho-Maria a 60º C - Alça de Platina Técnica 1. Divida a placa de ágar nutriente em 4 quadrantes, anotando diferentes períodos de tempo em cada um: 0, 5, 10 e 15. 2. Coletar com a alça de platina, um pouco do crescimento da cultura A e passar para o tubo contendo solução salina. Homogeneizar a suspensão. 3. Inocule (com alça de platina) a suspensão no quadrante correspondente ao tempo 0. 4. Coloque o tubo com a suspensão em banho-maria a 60º C e, aos 5', 10' e 15', retire amostras, inoculando-as nos respectivos quadrantes da placa de Petri (proceda exatamente como no item 2). 5. Deixe a placa na estufa até o dia seguinte.

12 6. Observe a variação quantitativa de crescimento nos quadrantes em função do tempo de aquecimento da cultura e anote os resultados (de + a ++++, conforme a intensidade de crescimento) Tempo de aquecimento 0 5 10 15 B) Ação da temperatura, em função do tempo, sobre cultura bacteriana esporulada Material - Cultura E em ágar inclinado (bactéria esporulada) - Tubo contendo 1 ml de solução salina esterilizada - Placa de Petri contendo ágar nutriente - Banho-maria a 60º C - Alça de platina Técnica - Proceda como no exercício A e anote os resultados. Tempo de aquecimento 0 5 10 15 II - Ação dos agentes químicos sobre as bactérias A ação dos agentes químicos sobre as bactérias é muito importante, do ponto de vista prático e todos devem se familiarizar com estas substâncias, suas ações e limitações. Verificaremos a ação do fenol e do mertiolato sobre algumas bactérias. EXERCÍCIOS C) Ação do fenol a 0,8% de acordo com o tempo. Material - Tubo contendo solução aquosa a 0,8% de fenol (10 ml) - Cultura A em caldo - Placa de Petri contendo ágar nutriente - Alça de platina - Pipeta de 1 ml esterilizada Técnica 1. Adicione, com a pipeta, 1 ml da cultura A aos 10 ml da solução de fenol e misture bem. 2. Imediatamente e após 5', 10' e 15', retire com a alça de platina, amostra da mistura (fenol mais cultura A) e inocule nos respectivos quadrantes da placa de Petri (0', 5', 10' e 15'). 3. Deixe a placa na estufa, a 37 o C, até o dia seguinte. 4.Leia os resultados, anotando a variação quantitativa de crescimento (+ a ++++) em cada um dos quadrantes da placa, em função do tempo de tratamento da cultura com o fenol. Tempo de tratamento com o fenol 0 5 10 15 D) Ação de um antisséptico sobre as bactérias da pele Material - Placa de Petri contendo ágar nutriente - Zaragatoas estéreis - Álcool iodado (ou outro antisséptico) - Solução salina estéril

Técnica 1. Divida a placa de ágar nutriente em duas partes. 2. Umedeça uma zaragatoa em solução salina e esfregue-a vigorosamente no dorso de uma das mãos, numa extensão de aproximadamente 4 cm 2. Inocule, a seguir, numa das metades da placa de ágar nutriente. 3. Umedeça uma outra zaragatoa com o antisséptico e esfregue-a no dorso da outra mão, em área semelhante. 4. Espere 5 minutos para que haja ação do antisséptico e secagem da superfície. Passe então, nessa área, uma terceira zaragatoa umedecida com salina, tomando cuidado para não atingir a área não tratada. Inocule a outra metade da placa de ágar. 5. Deixe a placa na estufa, a 37 o C, até o dia seguinte. 6. Leia os resultados, anotando a variação quantitativa de crescimento (+ a ++++), em função da presença do antisséptico utilizado. Tratamento Sem antisséptico Com antisséptico 13 TRANSFERÊNCIA DE RESISTÊNCIA A DROGAS ENTRE BACTÉRIAS Os genes que conferem resistência bacteriana a drogas frequentemente localizam-se em partículas de DNA extracromossômico chamadas plasmídios, bastante comuns em microrganismos patogênicos. Os plasmídios podem ser transferidos de uma célula bacteriana para outra e, desta forma, os genes de resistência a drogas podem ser disseminados numa população bacteriana, através dos mesmos, a partir de uma bactéria resistente portadora. A transferência de plasmídios ocorre por conjugação ou por transformação. No primeiro caso, há necessidade de contato físico entre a bactéria portadora do plasmídio (doadora) e a bactéria receptora. A tranformação ocorre quando uma bactéria sensível a um dada droga torna-se resistente, ao incorporar DNA plasmidial presente no meio e que contem o gene para resistência ao antimicrobiano. A conjugação é um fenômeno relativamente comum de transferência de plasmídios na natureza. Já a transformação é um mecanismo mais raro e normalmente é artificialmente induzida em laboratório em experimentos de tranferência de DNA cromossômico ou plasmidial. O exercício prático desta aula consistirá na transferência de resistência ao antibiótico canamicina, de uma Salmonella, para uma Escherichia coli, através de conjugação. EXERCÍCIO Material - Meio de MacConkey - Meio de MacConkey contendo Canamicina na concentração de 20 mg/ml - Cultura em caldo da bactéria A (Salmonella sp, lactose -) - Cultura em caldo da bacteria B (Escherichia coli, lactose +) - Tubo de ensaio contendo mistura de cultura A mais cultura B (0,1 ml da cultura A + 0,1 ml da cultura B foram transferidos para 5 ml de caldo nutriente e esta mistura foi previamente incubada a 37º C, durante 18 horas) - Pipetas estéreis - Solução salina estéril (2 tubos com 9 ml) para diluir a mistura A + B - Alça de platina Técnica 1. Dividir as placas de Mac Conkey (com e sem canamicina) em duas partes. 2. Semear, por esgotamento com a alça de platina, a cultura A numa das metades da placa de MacConkey contendo canamicina e a cultura B na outra metade. Incubar a 37º C até o dia seguinte. 3. Repetir o procedimento do item 2 na placa de Mac Conkey sem canamicina

14 4. Tomar uma alçada da mistura A + B e semear, por esgotamento, na placa de MacConkey contendo antibiótico. Incubar por 24 horas a 37 o C 5. Observar ocorrência de crescimento da cultura A e B separadas e da mistura A+B Anotar os resultados Crescimento em Mac Conkey Com Canamicina Sem Canamicina Cultura A Cultura B Mistura A+B Lactose Bactéria sensível - ausência de crescimento. Bactéria resistente - presença de crescimento. DETERMINAÇÃO DA SENSIBILIDADE BACTERIANA A DROGAS Após o isolamento de uma bactéria de um processo infeccioso, é desejável em alguns casos, conhecer a sua sensibilidade ou resistência a vários antibióticos e quimioterápicos. Isto se consegue com o emprego de vários métodos, sendo que o método do disco de papel de filtro impregnado com solução da droga (Método de Bauer e Kirby) é o mais amplamente utilizado. EXERCÍCIO Antibiograma pelo Método de Bauer e Kirby Material - Cultura B em caldo BHI (Brain Heart Infusion): cinco colônias da cultura B foram semeadas em caldo BHI e incubadas a 37 o C durante 4 horas. - Placa de Petri contendo meio de Mueller-Hinton - Discos de papel de filtro impregnado com soluções de drogas antimicrobianas - Zaragatoa - Agulha estéril - Escala 0,5 de MacFarland - Solução salina estéril - Pipeta estéril - Régua Técnica 1. Transferir, com a pipeta, o crescimento da cultura B para o tubo contendo solução salina, ajustando a concentração de bactérias, conforme a escala 0,5 de MacFarland. O ajuste de concentração é feito por comparação da turbidez da cultura com a do tubo da escala. 2. Umedecer a zaragatoa neste crescimento de concentração padronizada; esgotar o excesso de cultura na parede do tubo e inocular uniformemente em toda a superfície da placa de Petri contendo o meio de Müeller-Hinton. 3. Esperar secar. 4. Colocar, sobre a superfície do ágar, com o auxílio de uma agulha estéril, os discos de papel de filtro impregnados com as drogas. A disposição dos discos deve obedecer o esquema da figura abaixo 5. Colocar a placa de Petri na estufa a 37º C, até o dia seguinte. 6. Com o auxílio de uma régua, medir o diâmetro do halo de inibição do crescimento. 7. Consultar a tabela de referência, fornecida pelo instrutor, para interpretar os resultados e anotar no quadro da página seguinte.

15 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 Droga Concentração (ug/ml) Diâmetro do halo de inibição do crescimento Interpretação* * S = Sensível; R = Resistente; I = Intermediário EXERCÍCIOS STAPHYLOCOCCUS A) Observar placas de ágar sangue semeadas com as culturas A e B. Descrever as características das colônias e verificar hemólise. Cultura Características das Colônias Hemólise A B B) Corar, pelo método de Gram, esfregaços das culturas A e B (ver Morfologia e coloração da bactérias, página 1). Observar ao microscópio e desenhar. Cultura A Cultura B

C) Prova da Catalase 16 Colocar sobre as culturas A e B algumas gotas de água oxigenada. Observar a reação e anotar os resultados. (Obs., ver técnica na página 10) Cultura A B Prova da Catalase D) Prova da Coagulase Princípio A coagulase é uma enzima, produzida por certas bactérias, que coagula o plasma sanguíneo. Técnica Misturar 0,5 ml da cultura A com 0,25 ml de plasma citratado de sangue de coelho a 1%. Incubar a 37 o C e observar durante 4 horas. Fazer o mesmo com a cultura B e anotar os resultados. Resultado positivo - formação de coágulo. negativo - suspensão inalterada Cultura A B Prova da Coagulase E) Prova da DNAse Princípio A DNAse é uma enzima, produzida por certas bactérias, que hidroliza o DNA. Para pesquisá-la, utiliza-se o DNase Test Agar, que contém DNA e o indicador de ph verde de metila. Se a bactéria produzir DNase, haverá hidrólise de DNA e consequentemente a formação de um halo ao redor da colônia. Técnica Culturas A e B foram semeadas individualmente em placas contendo o meio DNase Test Agar com verde metila, e após 24 hrs/37 o C é realizada a leitura anotando os resultados conforme abaixo: Resultados: positivo: No meio originalmente verde, após o rompimento do DNA, há a formação de um halo incolor circundando as colônias. negativo: sem formação de halo ao redor das colônias;. Cultura A B Prova da DNAse F) Identificação das culturas Cultura A Cultura B

ESQUEMA DE IDENTIFICAÇÃO DOS GÊNEROS Staphylococcus,Micrococcus (família Staphylococcaceae) 17 Cocos Gram positivos Isolados ou agrupados Catalase + O OF Micrococcus sp Staphylococcus sp Coagulase (+) DNAse (-) S. aureus S. coagulase negativa

STREPTOCOCCUS 18 EXERCÍCIOS A)Observar placas de ágar sangue semeadas com as culturas C, D e E. características das colônias e verificar hemólise. Descrever as Cultura Características das Colônias Hemólise C D E B) Corar, pelo método de Gram, esfregaços das culturas C, D e E, observar ao microscópio e desenhar. Cultura C Cultura D Cultura E C) Prova da catalase. Colocar sobre a cultura C (em caldo) algumas gotas de água oxigenada. Verificar a reação e anotar o resultado. Fazer o mesmo com as culturas D e E. Cultura C D E Catalase D) Prova da sensibilidade a optoquina Princípio: Esta prova verifica a sensibilidade das bactérias A e E à optquina (etilhidrocupreína hidroclorídrica) Técnica: Adicionar um disco contendo a substancia em uma placa de Agar sangue semeado com as bactérias aserem testados. Incubar a 37 o C e examinar após 24 horas. Anotar o resultado. Fazer o mesmo com a cultura E. Leitura. Resultado positivo (suspensão solúvel)-a cultura fica transparente. negativo (suspensão insolúvel)- a cultura permanece turva. Cultura D E Optoquina

E) Prova de sensibilidade à bacitracina. 19 Princípio: O princípio desta prova baseia-se na inibição de crescimento do Staphylococcus pyogenes ( -hemolítico, grupo A) frente a uma pequena quantidade de bacitracina. Técnica: Verificar se ocorre uma zona de inibição de crescimento ao redor do disco de papel de filtro contendo bacitracina, colocado sobre a cultura C. Leitura: sensível: existência de uma zona de inibição do crescimento. resistente: ausência de zona de inibição de crescimento. F) CAMP Teste Princípio: A atividade da hemolisina do S. aureus é aumentada pela atividade hemolítica do S. agalactiae ( -hemolítico do grupo B). Técnica: Verificar zona de hemólise, em placa de ágar sangue (feito c/ sangue de carneiro), semeada com S. agalactiae e S. aureus. Leitura: resultado - positivo: formação de uma zona de hemólise semelhante à "ponta de flecha" na união das duas hemolisinas. negativo: não formação de "ponta de flecha". G) Identificação das culturas Cultura C Cultura D Cultura E

20 ESQUEMA DE IDENTIFICAÇÃO Família: Streptococcaceae Gênero: Streptococcus (cocos Gram positivos aos pares ou em cadeia) Catalase (-) Tipo de hemólise Optoquina Bilisolubilidade Letalidade em camundongos Bacitracina S R (+) (-) (+) ( -) S R S. pneumoniae S. -hemolítico S. pneumoniae S. -hemolítico S. pneumoniae S. -hemolítico S. pyogenes (gr.a) Streptococcus (quaisquer dos grupos de Lancefield, exceto o A) S = sensível; R = resistente provas sorológicas (grupos de Lancefield)

21 NEISSERIA EXERCÍCIOS A) Observar, ao microscópio, esfregaço de secreção uretral, corado pelo método de Gram e desenhar. B) Crescimento em ágar-simples Verificar a diferença de crescimento, em meio de ágar simples, entre Neisseria sp e N. meningitidis. Anotar o resultado. Cultura Neisseria sp N. meningitidis Crescimento em ágar simples C)Teste de Citocromo-oxidase Fazer o teste da citocromo-oxidase com uma das culturas de Neisseria e com a cultura de Escherichia coli. (ver princípio e técnica do teste na página 11). Anotar os resultados. Cultura Neisseria sp Escherichia coli Prova da citocromo-oxidase

22 ESQUEMA DE IDENTIFICAÇÃO Família: Neisseriaceae Gênero: Neisseria (diplococos Gram negativos) citocromo-oxidase positivos Crescimento em ágar simples (+) (-) N. sicca e outras espécies não patogênicas de Neisseria fermentação da maltose (+) (-) N. meningitidis N. gonorrhoeae Reações sorológicas Identificação do sorotipo

23 PSEUDOMONAS EXERCÍCIOS A) Observar placa de ágar sangue semeada com Pseudomonas aeruginosa. Descrever as características das colônias e verificar hemólise. Observar, também, a pigmentação verde do crescimento em ágar simples uma característica peculiar da espécie. Cultura Característica das colônias P. aeruginosa B) Corar, pelo método de Gram, esfregaço da cultura de Pseudomonas aeruginosa. Observar ao microscópio e desenhar. C) Prova da Citrocromo-oxidase Pseudomonas aeruginosa Fazer prova da citocromo-oxidase com a cultura de P. aeruginosa e com uma cultura de Escherichia coli, para fins de comparação. Anotar o resultado. Cultura P. aeruginosa Prova de citocromo-oxidase Escherichia coli

24 Diferenciação entre as famílias Enterobacteriaceae e Pseudomonadaceae Bacilos Gram negativos OF citocromo-oxidase negativos Enterobacteriaceae O citocromo-oxidase positivos Pseudomonadaceae gênero Pseudomonas (produção de pigmento) provas bioquímicas para identificação de espécies

ENTEROBACTÉRIAS 25 As enterobactérias são bacilos Gram negativos morfologicamente indistinguíveis entre si e pertencentes à família Enterobacteriaceae. Compreendem vários gêneros e espécies, algumas das quais divididas em tipos sorológicos ou sorotipos. As enterobactérias são citocromo-oxidase negativas, fermentam a glicose, reduzem nitrato a nitrito, crescem bem nos meios de cultura comuns e, quando móveis, possuem flagelos peritríquios. A identificação de gêneros dentro da família é feita através de uma série de provas bioquímicas e através do teste de motilidade (ver páginas 10 a 18). Algumas provas são especialmente úteis para a diferenciação de alguns gêneros, como por exemplo, a prova de urease e da fenilalanina para os gêneros Proteus, Morganella e Providencia. Assim como para a maioria dos microrganismos patogênicos, a identificação a nível de espécie de uma enterobactéria nem sempre satisfaz ao clínico e ao epidemiologista. Por exemplo, quando isolamos um colibacilo das fezes de um recém-nascido com diarréia, não é suficiente dizer que se trata de uma Escherichia coli mas, devemos proceder a identificação a nível intraespecífico porque nem todos os colibacilos são diarreagênicos. Do mesmo modo, a identificação de um sorotipo de Salmonella pode ser indispensável ao trabalho de um epidemiologista que estuda infecções entéricas. Deste modo, a identificação da espécie deve ser complementada com métodos sorológicos para caracterização da cepa, a fim de se ter uma idéia de seu potencial de patogenicidade. A identificação sorológica pode ser aplicada a qualquer espécie de enterobactéria mas, na prática, é feita para Escherichia coli, Shigella, Salmonella e Yersinia enterocolitica. A sorologia baseia-se na detecção de variações antigênicas de alguns constituintes bacterianos como o antígeno capsular K, o antígeno O do LPS e a flagelina, proteína que constitui o flagelo (H). Variações dos antígenos O definem sorogrupos. Bactérias de um mesmo sorogrupo frequentemente apresentam variações antigênicas no antígeno flagelar H e capsular K. Em E. coli, a combinação de variantes O:K:H, ou apenas O:H, define um sorotipo. Embora isto não seja sempre possível na prática, a identificação precisa de uma Escherichia coli enteropatogênica requer a caracterização a nível de sorotipo. A tipagem dos antígenos O, K e H é feita através de reações de aglutinação utilizando-se soros preparados por inoculação de amostras padrões em coelhos. Estes soros podem ser dirigidos contra antígenos individuais (soros monovalentes) ou contra uma mistura de antígenos (soros polivalentes). A sorotipagem de uma amostra bacteriana é feita inicialmente com soros polivalentes. Quando a reação é positiva, submete-se a amostra a reações individuais com cada um dos soros monovalentes do pool contido no soro polivalente. Meios de Cultura utilizados para o enriquecimento e isolamento de enterobactérias. Meio de enriquecimento: Meio de tetrationato. Favorece o crescimento das enterobactérias do gênero Salmonella e inibe o crescimento de outras enterobactérias. Meios de isolamento. Esses meios foram idealizados para o isolamento de enterobactérias patogênicas das fezes. Possuem componentes que eliminam bactérias da microbiota normal e facilitam a diferenciação entre bactérias patogênicas e não patogênicas. São, portanto, meios seletivos e diferenciais (ver página 7). Os meios mais utilizados são MacConkey, Salmonella- Shigella (SS), verde brilhante e hektoen. MacConkey. Impediente para bactérias Gram positivas, permitindo o crescimento das enterobactérias. Bactérias fermentadoras da lactose apresentam colônias vermelhas e não fermentadoras, colônias incolores. Ágar SS. Impediente para bactérias Gram positivas e enterobactérias da microbiota intestinal normal, possibilitando o isolamento de Shigella, Salmonella, Escherichia coli enteroinvasora (EIEC) e Yersinia enterocolitica. A coloração das colônias Lac + e Lac - no ágar SS é semelhante à observada no MacConkey.

26 Ágar hektoen. Impediente para bactérias Gram positivas, enterobactérias da microbiota intestinal normal, possibilitando o crescimento de Shigella e Salmonella (exceto Salmonella typhi, que cresce com menor intensidade). As bactérias fermentadoras de lactose formam colônias de cor amarela ou alaranjada enquanto que as não fermentadoras apresentam colônias incolores. Meios de cultura utilizados para identificação de enterobactérias. Meio TSI O meio TSI (triplice sugar iron ou triplice acúcar ferro) contém glicose (0.1%), lactose (1.0%), sacarose (1.0%), uma base sulforada, um sal férrico e, como indicador de ph, o vermelho fenol, que lhe confere cor vermelha. O TSI é um meio sólido que deve ser mantido em posição inclinada, quando do seu preparo. A inoculação é feita a partir de uma colônia bem isolada, por picada em toda a base e esgotamento na superfície. Culturas em TSI de bactérias que fermentam somente a glicose produzem mudança de coloração para amarelo na base, mantendo a cor original do meio na superfície. Embora outras explicações possam ser dadas, parece mais provável que isto decorra da diferença no volume de crescimento nas duas partes do meio (base e superfície). Na superfície, onde o crescimento bacteriano é abundante, a acidez resultante da fermentação da glicose é neutralizada pelos produtos do metabolismo proteico, o mesmo não ocorrendo na base, onde o crescimento se restringe ao ponto de inoculação (picada), não havendo, portanto, quantidade suficiente de metabólitos para neutralizar os ácidos produzidos. Se a bactéria fermenta a lactose e/ou sacarose, acúcares que se encontram em concentrações 10 vezes superior a da glicose, a quantidade de ácido formada será bem maior e, desta forma, não haverá neutralização por outros produtos do metabolismo bacteriano. Consequentemente, tanto a base como a superfície acidifica-se, apresentando coloração amarela. Assim sendo, conforme as reações que ocorrem na base, na superfície e em toda a extensão do meio, pode-se saber se apenas a glicose ou se também a sacarose e/ou a lactose foram metabolizadas. Além disto, o meio TSI permite verificar se houve produção de H 2 S e gás. O resultado positivo para H 2 S é indicado pelo surgimento de cor escura no meio e, de gás, pela retenção de bolhas de ar. Meio EPM O meio EPM também é um meio sólido, que deve ser mantido em posição inclinada após o preparo, como o TSI. Este meio resultou da modificação de um meio tradicional, de uso muito comum em Bacteriologia, o meio de Rugai. A modificação foi feita na Escola Paulista de Medicina, cujas iniciais designam o meio, e teve como objetivo ampliar o número de provas do meio de Rugai. No EPM, são realizadas 5 provas: urease, fenilalanina-desaminase, H 2 S, glicose e produção de gás. O meio estéril apresenta coloração verde clara. Quando semeado com uma cultura-teste, apresenta-se multicolorido. A coloração azul na base indica resultado positivo para urease e, verde escuro na superfície, positivo para fenilalanina-desaminase. Assim como no meio de TSI, o resultado positivo para glicose e H 2 S é indicado, respectivamente, por coloração amarela e por pontos escuros na base. Bactérias produtoras de gás retêm o mesmo no interior do meio (formação de bolhas), do mesmo modo que no meio TSI. Embora o meio EPM facilite o trabalho, ao permitir a realização de 5 provas de uma só vez, a leitura dos resultados nem sempre é fácil. Frequentemente o resultado positivo de uma prova impede a leitura de outra. É o caso, por exemplo, da urease. Bactérias que apresentam reação muito forte nesta prova (quando o meio fica todo azulado) têm o resultado da glicose mascarado. Neste caso, a prova de glicose deve ser repetida em um meio de cultura específico para glicose. Meio de MILi A designação deste meio é formada pelas iniciais das três provas que nele são testadas: Motilidade, Indol e Lisina-descarboxilase (LDC). Sua formulação também deve-se ao trabalho

27 de pesquisadores da Escola Paulista de Medicina. O meio MILi é um meio semi-sólido e, quando estéril apresenta coloração vinho. Após o crescimento de uma cultura, pode ficar turvo em toda sua extensão ou somente na linha do inóculo (picada). No primeiro caso, trata-se de uma bactéria móvel e, no segundo, de uma bactéria imóvel. Bactérias LDC+ mantêm a coloração original do meio e LDC- mudam a coloração de vinho para amarelo. A revelação da prova de indol segue o mesmo procedimento da prova realizada com cultura crescida em meio específico (ver página 15): após o crescimento da cultura, coloca-se entre 5 a 10 gotas de reativo de Kovacs, espera-se alguns segundos, e observa-se a superfície do meio. Bactérias indol positivas mudam a cor do reativo de Kovacs para vermelho. EXERCÍCIOS A) Observar a coloração das colônias das bactérias A, B e C cultivadas em placas de MacConkey, ágar SS e hektoen. Anotar os resultados da prova de lactose. Cultura coloração da colônia em lactose MacConkey SS hektoen A B C B) Observar e interpretar crescimento das culturas A, B e C em meio de TSI. coloração da base coloração da superfície H 2 S gás Cultura em TSI A B C C) Identificação bioquímica A partir do TSI, inocular as culturas A, B e C em séries bioquímicas (meios de EPM, MILi e citrato de Simmons) e incubar a 37 o C. Anotar os resultados e identificar as culturas, com base no perfil bioquímico, utilizando a tabela da página 41. Provas A B C citrato glicose gás urease H 2 S Fenilalanina motilidade lisina Indol lactose* Espécie/ gênero *resultado da prova de lactose: ver item A

28 D) Reação sorológica para confirmação dos resultados de identificação bioquímica. Fazer reação de aglutinação em lâmina com as culturas A, B e C, utilizando os soros anti - S. flexneri, anti - E. coli O55 e anti - Salmonella sp. Anotar os resultados (positivo ou negativo). Soro Anti - Escherichia coli O55 Anti - Shigella flexneri Anti Salmonella Cultura A B C Comportamento de Enterobactérias fermentadoras (lac +) e não fermentadoras (lac -) de lactose em MacConkey, ágar SS e ágar hektoen. Diferenciação baseada na coloração das colônias Bactérias Gênero Cor da colônia em MacConkey e SS ágar hektoen Fermentadoras Escherichia vermelha alaranjada Klebsiella vermelha alaranjada Enterobacter vermelha alaranjada Serratia vermelha alaranjada Não Shigella incolor incolor fermentadoras Salmonella incolor incolor Proteus incolor incolor Morganella incolor incolor Yersinia incolor incolor

29 Perfil Bioquímico e Motilidade de Algumas Espécies de Enterobactérias Prova E. coli Shigella Edwardsiella Salmonella sp Citrobacter Klebsiella Enterobacter Serratia Proteus Proteus Morganella Providencia sonnei tarda freundii pneumoniae cloacae marcescens mirabilis vulgaris morganii rettigeri Citrato - - - + ou - + + + + + ou - + ou - - + Glicose + + + + + + + + + + + + Gás + - + + + + + + ou - + + ou - + ou - + ou - Urease - - - - + ou - + + ou - + ou - + ou - + + + H 2 S - - + + + - - - + + - - Fenilalanina - - - - - - - - + + + + Motilidade + ou - - + + + - + + + + + ou - + Lisina + ou - - + + - + - + - - - - Indol + - + - - - - - - + + + Lactose + - - - + ou - + + ou - - - - - -