Realizado por: Cláudia Regina Briosa da Silva Mataloto, nº 9144

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1 Coloração GRAM Realizado por: Cláudia Regina Briosa da Silva Mataloto, nº 9144 Produção Alimentar em Restauração 2017/18 2.º ano Microbiologia I Docente: António João Data de entrega: 02/11/2017

2 Índice Introdução As bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e a Coloração Gram Material, equipamentos, reagentes e amostras Procedimento Experimental Resultados e discussão dos resultados Conclusão... 9 Bibliografia: Anexos: Índice de Figuras Figura 1 - Célula procariota (fonte: google.pt)... 4 Figura 2 - Bactérias Gram-negativa e Gram-positiva (fonte: google.pt)... 4 Figura 3 - Técnica de Coloração de Gram (fonte: google.pt)

3 Introdução O presente relatório insere-se na cadeira de Microbiologia I, do 2.º ano, do 1.º semestre do curso de Produção Alimentar em Restauração, da ESHTE. O seu objetivo é expor os resultados da aplicação da técnica Coloração de Gram, que permite diferenciar as bactérias em dois grupos distintos: Grampositivas e Gram-negativas, tendo por base as propriedades físicas e químicas da sua estrutura, em particular da sua parede celular, nas amostras disponibilizadas (Salmonella, Bacillus cereus, Escherichia coli e Staphylococcus). O relatório apresenta a lista de materiais, equipamentos, reagentes e amostras utilizados na realização do protocolo experimental e as suas características,, o respetivo procedimento experimental, a descrição dos resultados observados (Anexo I) assim como a discussão dos mesmos e ainda a conclusão final. 3

4 1. As bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e a Coloração Gram As bactérias caracterizam-se por serem seres vivos microscópios unicelulares, procariotas, que são desprovidos de sistemas de membranas internas, conforme podemos observar na figura 1. Figura 1 - Célula procariota (fonte: google.pt) Este grupo de microrganismos pertence ao domínio Eubacteria, que compreende a maioria dos procariotas e se caracterizam por terem parede celular de peptidoglicano. Neste âmbito encontramos duas categorias: as bactérias Gram-positivas e as Gram-negativa (figura 2). Figura 2 - Bactérias Gram-negativa e Gram-positiva (fonte: google.pt) 4

5 As bactérias Gram-negativas possuem duas camadas, a camada R e a membrana externa, respetivamente. Na sua constituição inclui-se um espaço espaço periplasmático que se localiza entre a membrana citoplasmática e a camada de peptidoglicano (mais fina e representando 10% a 20%). A membrana externa é composta essencialmente por fosfolípidos, lipoproteínas, proteínas com diferentes funções específicas, porinas, autolisinas e LPS (lipopolissacáridos). Os LPS são constituídos por três regiões distintas (antigénio somático O, core do LPS e lípido A), tratando-se de endotoxinas que são responsáveis pela identificação da estripe e pelos sintomas causados no hospedeiro. Constituem ainda uma barreira de proteção em relação aos detergentes e corantes hidrofóbicos, conferindo-lhes assim uma maior resistência a estes agentes químicos. As proteobactérias são classificadas como Gram-negativas (Salmonella,,Helicobacter, Escherichia e Enterobacter). As bactérias Gram-positivas caracterizam-se pela sua camada espessa de peptidoglicano. Esta corresponde a um valor entre 60% a 90% da totalidade da parede celular e inclui ácido teicóico e teicurónico, os quais contribuem para a estabilidade da parede. Caracterizam-se ainda pela ausência de espaço periplasmático e membrana externa. A membrana citoplasmática da bactéria encontra-se por baixo da camada de peptidolicano. Nesta classificação podemos incluir a classe Clostridia e Bacilli (Staphylococcus, Lactococcus e Streptococcus) A técnica de Coloração de Gram permite a diferenciação de microrganismos através das cores, para serem observados em microscópio ótico. Esta técnica foi desenvolvida pelo médico dinamarquês Hans Cristian Joaquim Gram ( ). Por volta do ano de 1884, Hans Gram observou que as bactérias, após serem tratadas com corantes específicos, devido às diferentes estruturas constituintes da parede celular, adquiriram cores diferenciadas. Assim, as bactérias puderam ser classificadas, segundo esta técnica, em Gram-positivas (adquirem uma coloração roxa), e as Gram-negativas (adquirem uma coloração vermelha). A técnica de Gram é fundamental para a taxonomia e identificação das bactérias, sendo muito utilizada, atualmente, como técnica de rotina em laboratórios de 5

6 análises clínicas e microbiologia. Pode ser realizada a partir de meios de cultura sólidos ou líquidos (suspensões ou diluições). Na Coloração de Gram é aplicado primeiro o Cristal de Violeta que atravessa a parede celular, a membrana citoplasmática e a membrana externa (bactérias Gram-negativas), que se difunde para o interior da célula. Seguidamente aplicase a solução de Lugol, que se liga às moléculas do Cristal Violeta que já estão no interior da célula, formando complexos maiores. Devido ao seu pequeno calibre, os poros existentes na parede celular das bactérias Gram-positivas, estes complexos, que adquiriram a cor azul violeta, não conseguem sair da célula, ficando nela retidos, quando utilizamos o etanol ou a acetona. para os dissolver, conferindo desta forma uma coloração azulada à bactéria em causa. No caso das bactérias Gram-negativas, porque possuem poros maiores, os complexos que se formam são arrastados para fora da célula durante a aplicação do etanol ou acetona., devido à permeabilidade da parede celular e à consequente destruição da membrana externa. Desta forma, estas bactérias não adquirem coloração, mantendo-se incolor. Existem espécies de bactérias (tuberculose, lepra) que, embora sejam Gram-positivas, não são confirmadas por esta técnica, uma vez são resistentes ao etanol e à acetona. Por fim, aplica-se o corante de contraste, a Safranina, que vai possibilitar a coloração das bactérias Gram-negativas, conferindo-lhes uma cor laranja/avermelhado mas não vai interferir com a coloração já obtida (violeta) no caso das bactérias Gram-positivas. 2. Material, equipamentos, reagentes e amostras Durante a realização do protocolo experimental utilizou-se material de laboratório, nomeadamente lâminas de vidro, ansas, óleo de imersão. Entre os equipamentos utilizados destaca-se o microscópio ótico e o bico de Bunsen. As amostras utilizadas dizem respeito a colónias de bactérias previamente cultivadas no laboratório e foram quatro (Salmonella, Bacillus cereus, Escherichia coli e Staphylococcus). Em relação aos reagentes foram utilizados: 6

7 Solução de Cristal Violeta, Solução de Lugol, álcool a 70% vol. e Safranina. Foi ainda utilizada a água peptonada tamponada. 3. Procedimento Experimental Para se realizar o procedimento experimental, recorreu-se a duas preparações a partir de colónias previamente cultivadas em laboratório, uma em meio de cultura líquido e outra em meio de cultura sólido. No caso da cultura líquida, colocou-se, com o auxílio de uma ansa, previamente esterilizada no bico de Bunsen, a bactéria Bacillus cereus que foi retirada de um tubo de ensaio, sobre a lâmina de vidro, espalhando uniformemente a colónia pela sua superfície. Recorrendo a uma fonte de calor (bico de Bunsen) procedeuse à sua fixação, através da evaporação de todo o líquido existente. De seguida, espalhou-se sobre a lâmina o primeiro corante, o Cristal de Violeta, de maneira a cobrir toda a superfície, deixando atuar 1 minuto. Escorreu-se o excesso. Gotejou-se sobre a lâmina a solução de Lugol e deixou-se reagir durante 1 minuto. Com a lâmina inclinada, foi gotejado o álcool a 70% vol. de forma a lavar o resíduo de corante. Gotejou-se, de seguida, o corante de contraste, Safranina e deixou-se atuar cercar de 1 minuto. Procedeu-se à lavagem da lâmina, com água corrente e deixou-se secar. Procedeu-se então à colocação da lâmina no microscópio ótico, com uma ampliação de 1000x e observaram-se os resultados, tendo-se procedido ao seu registo. Podemos observar a execução da técnica na figura 3. Figura 3 - Técnica de Coloração de Gram (fonte: google.pt) 7

8 No caso da cultura sólida, a bactéria Staphylococcus, procedeu-se de igual forma, apenas deferindo o procedimento no que se refere à recolha da amostra. Neste caso colocou-se uma gota de água peptonada tamponada na lâmina, retirou-se da caixa de Petri a colónia, com o auxílio de uma ansa, previamente esterilizada no bico de Bunsen e espalhou-se sobre a superfície da lâmina. 4. Resultados e discussão dos resultados Após os resultados obtidos (anexo I), verificou-se que a bactéria Bacilius cereus e a bactéria Staphylococcus são classificadas como Gram-positivas, uma vez que apresentam ambas uma coloração azul violeta quando observadas ao microscópio ótico. Este facto justifica-se pelo aprisionamento de complexos com a cor azul violeta no interior da célula formados pela ligação do corante Cristal de Violeta com o soluto de Lugol, isto porque a parede celular das bactérias Gram-positivas não é permeável a compostos com esta dimensão, devido aos seus poros de pequeno calibre. A bactéria Bacillus cereus pertence ao género Bacillus a qual pertence à classe Bacilli, classificada como bactéria Grampositiva, sendo o resultado obtido o esperado. O mesmo acontece para a bactéria Staphylococcus, considerada agente patogênico para os seres humanos. Organiza-se em grupos semelhantes a cachos de uvas, com formas esféricas em forma de cocos. Foi ainda observada a bactéria Salmonella, embora não se tenha acompanhado o respetivo procedimento experimental e esta foi identificada como Gramnegativa, apresentando uma coloração laranja avermelhado. Trata-se de uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae. As células têm a forma de bastonetes (bacilos) imóveis ou móveis por flagelos. 8

9 5. Conclusão Pode-se concluir que o protocolo foi realizado com êxito, tendo-se procedido à identificação das bactérias em dois grupos distintos: as Gram-positivas e as Gram negativas, aplicando a técnica de Coloração de Gram e observando os resultados ao microscópio ótico, de acordo com o objetivo inicial. A técnica da Coloração de Gram é considerada uma das mais importantes utilizadas nos laboratórios de análises clínicas e microbiologia. Entre os fatores que irão permitir a diferenciação das bactérias em Gram-positivas e Gramnegativas, está a coloração que a bactéria vai obter, a composição e propriedades químicas e físicas das paredes celulares. Assim, ao observarmos ao microscópio ótico, as colónias que adquiram uma coloração azul violeta serão as Gram-positivas e as que adquiriram uma coloração laranja avermelhado serão as Gram-negativas. Para realizarmos esta técnica necessitamos de expor as bactérias a um corante primário (Violeta de Cristal) vai corar o citoplasma de cor púrpura; um mordente (solução de iodo Logol) vai aumentar a afinidade entre o Violeta de Cristal e a célula e forma com o corante um complexo insolúvel dentro da célula; um agente descolorante (álcool, acetona ou ambos álcool 70% vol.) solvente lipídico e um corante de contraste (Safranina) cora o citoplasma de vermelho. A Coloração Gram é utilizada para identificar, de forma preliminar e às vezes como forma de triagem, a morfologia das bactérias e a sua classificação geral, no que se refere à taxonomia, sendo assim possível verificar a patogenicidade das mesmas e podendo-se avaliar os riscos associados ao seu hospedeiro. Constitui-se, desta forma, um método rápido para a identificação inicial de bactérias, por exemplo, envolvidas em infeções. É uma técnica simples e com um baixo custo. Contudo, nem todas as bactérias são coradas por esta técnica, uma vez que sozinha não identifica totalmente as bactérias analisadas nem permite a sua diferenciação dentro do mesmo grupo, o que leva a uma necessidade de se proceder a outras técnicas, como provas bioquímicas, de forma a obter um resultado mais detalhados. 9

10 Bibliografia: 5 Estrutura bacteriana 2012_13ppt, ESHTE 6 Taxonomia 2012_13ppt, ESHTE 6A Colorações 2012_13ppt, ESHTE Bactéria Patogénica Bacillus cereus, disponível em: (acedido a 30/10/2017) Bactéria Patogénica Salmonella spp, disponível em: (acedido a 30/10/2017) Dicionário da Língua Portuguesa, 2008, Porto, Porto Editora. Staphylococcus, disponível em: (acedido a 30/10/2017) Técnica de Coloração Gram, disponível em: (acedido a 30/10/2017) 10

11 Anexos: Tabela 1. Resultados Resultados Bactéria Classificação Descrição Salmonella Gram-negativa A Salmonella é uma bactéria Gram-negativa que pertence à família Enterobacteriaceae. A salmonelose é reconhecida como uma das principais infecções transmitidas pelo consumo de alimentos. A maioria das espécies de Salmonella é patogénica para humanos, mas as características e severidade das doenças que originam são variáveis. Staphylococcus Gram-positiva As bactérias do gênero Staphylococcus apresentam coloração Gram-positiva e são consideradas agentes patogênicos para os humanos. Organizam-se em grupos que se assemelham à cachos de uvas, com formas esféricas de cocos. Pertencem à família Staphylococcaceae. Bacillus cereus Gram-positiva Bacillus cereus é uma bactéria Gram-positiva pertencente à família Bacillaceae. As células têm a forma de bastonetes (bacilos) de grandes dimensões, geralmente móveis, e formam esporos. B. cereus produz 2 tipos de enterotoxinas, diarreica e emética, que são os agentes responsáveis pela intoxicação alimentar. 11